马兜铃次酸衍生物及其在制备抗炎药物中的应用
阅读说明：本技术 马兜铃次酸衍生物及其在制备抗炎药物中的应用 (Aristolochiatic acid derivative and application thereof in preparation of anti-inflammatory drugs ) 是由 袁干军 赖珊 贺苏 赵文佳 孙一斐 张同科 夏雪雪 于 2021-01-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了马兜铃次酸衍生物及其在制备抗炎药物中的应用,实验证明,本发明所述的马兜铃次酸衍生物可显著抑制角叉菜胶所致大鼠的足肿胀,且可明显减少角叉菜胶所致大鼠胸膜炎胸腔渗出液量和白细胞游走。从而显示本发明所述的马兜铃次酸衍生物具有显著的抗炎作用,可用于抗炎药物的制备,并显示其良好的应用和开发前景。(Experiments prove that the aristolochic acid derivative can obviously inhibit the foot swelling of a rat caused by carrageenan, and can obviously reduce the pleural effusion quantity and leukocyte migration of the rat pleurisy caused by the carrageenan. Therefore, the aristolochic acid derivative has a remarkable anti-inflammatory effect, can be used for preparing anti-inflammatory drugs, and shows good application and development prospects.)
技术领域
本发明涉及马兜铃次酸衍生物及其在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症是机体对抗外界感染或损伤性刺激的一种保护性反应，同时也是多种不同类型疾病的共同病理过程。长期持续、过度的炎症反应或炎症风暴，将会造成对机体自身造成严重伤害、甚至脏器的衰竭，故需要采用药物干预以阻断炎症持续和发展。目前临床上常用的抗炎药主要有两类：非甾体抗炎药和甾体类抗炎药(糖皮质激素类)。虽然这两类抗炎药都有很好的临床抗炎效果，但长期大量使用会产生一系列不良反应和耐受性，如前者的胃粘膜损伤、肝肾损害和心脏毒副作用，后者的水钠潴留等。为解决药物的耐受性及不良反应，寻找结构新颖、机制独特的抗炎药物一直是新型抗炎药物研发领域的热点。
马兜铃酸(Aristolochic acids)是一类含芳硝基的菲羧酸类似物，其广泛存在于马兜铃科、毛茛科、木兰科和防己科等植物，尤其在马兜铃科马兜铃属的植物各部位中含量较高。该类化合物及体内的代谢产物具有严重的肝肾毒性、致突变和致癌毒性，且这些毒性与其所含的间硝基羧酸结构密切相关。本发明以马兜铃酸类化合物为起始原料，通过桑德迈尔(Sandmeyer)反应，得到马兜铃次酸衍生物，然后对这些马兜铃次酸衍生物的抗炎活性进行评价，发现本发明所述的马兜铃次酸衍生物具有显著的抗炎作用，且同剂量给药后其抗炎作用明显强于它们的合成起始原料马兜铃酸类化合物，同时因它们的分子结构中去除了间硝基羧酸结构中的硝基，故其间硝基羧酸结构带来的肝肾毒性和致癌性完全消除。
发明内容
本发明的目的就是提供马兜铃次酸衍生物及其在制备抗炎药物中的应用。
本发明中用于制备抗炎药物的马兜铃次酸衍生物的化学结构如下式所示：
式一中，R1为甲氧基、羟基或氢，R2为氯或溴；当R1为甲氧基，R2为氯时，式一为马兜铃次酸衍生物I；当R1为甲氧基，R2为溴时，式一为马兜铃次酸衍生物II；当R1为羟基，R2为氯时，式一为马兜铃次酸衍生物III；当R1为羟基，R2为溴时，式一为马兜铃次酸衍生物IV；当R1为氢，R2为氯时，式一为马兜铃次酸衍生物V；当R1为氢，R2为溴时，式一为马兜铃次酸衍生物VI。
本发明中用于制备抗炎药物的马兜铃次酸衍生物可为马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V或VI。其可先从含马兜铃酸类化合物的中药或植物中分离纯化得到下式二所示的马兜铃酸类化合物(R1为甲氧基、羟基或氢，当R1为甲氧基时，式II为马兜铃酸I；当R1为羟基时，式II为马兜铃酸Ia；当R1为氢时，式II为马兜铃酸II)，再按所示合成路线制备；也可通过商业途径购买如式二所示的马兜铃酸类化合物(R1为甲氧基、羟基或氢)，再按所示合成路线制备。
马兜铃次酸衍生物的合成路线。
本发明通过观测和分析马兜铃次酸衍生物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响和对角叉菜胶所致大鼠胸膜炎胸腔渗出液量和白细胞游走的影响，证明马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI具有显著的抗炎作用，故可用于抗炎药物的制备。
本发明在观察到马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI具有显著的抗炎作用时，发现其抗炎活性明显强于它们的合成原料马兜铃酸I、Ia和II，且其毒性明显减少；同时发现其抗炎活性明显优于阳性对照药阿司匹林。由此进一步证明本发明所述的马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI具有显著的抗炎作用，可用于抗炎药物的制备，并显示其良好的应用和开发前景。
具体实施方式
实施例1：
药材：青木香药材购于江西省樟树市中药材市场，云南丽江产(批号F41)，为马兜铃科马兜铃属植物马兜铃(Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.)的干燥根，粉碎机粉碎，得青木香粗粉。
取上述青木香药材100kg，用70％乙醇提取，减压浓缩至无醇味，然后用氯仿萃取，萃取物按文献方法(陈仲良,等.化学学报,1981,39(3):237-242和吴立军,等.沈阳药学院学报,1982,(16):19-22)，采用硅胶柱色谱和溶剂结晶方法，制得马兜铃酸I(45.8g)、Ia(11.3g)和II(7.1g)。
将5.0g马兜铃酸I溶于100ml浓HCl中，降温至0-5℃，缓慢滴加20ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入50ml CuCl盐酸溶液中，待全部加入后，60℃搅拌2h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.2，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物I(2.7g)。
将1.0g马兜铃酸Ia溶于15ml浓HCl中，降温至0-5℃，缓慢滴加5ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入10ml CuCl盐酸溶液中，待全部加入后，50℃搅拌3h，放置过夜。溶液用25％NaOH调pH至3.5，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物III(0.5g)。
将1.5g马兜铃酸II溶于20ml浓HCl中，降温至0-5℃，缓慢滴加5ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入10ml CuCl盐酸溶液中，待全部加入后，45℃搅拌4h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.0，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物V(0.8g)。
将2.0g马兜铃酸I溶于50ml浓HBr中，降温至0-5℃，缓慢滴加10ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入20ml CuBr氢溴酸溶液中，待全部加入后，55℃搅拌2h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.5，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物II(1.3g)。
将3.5g马兜铃酸Ia溶于70ml浓HBr中，降温至0-5℃，缓慢滴加15ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌40min，将重氮化溶液缓慢加入20ml CuBr氢溴酸溶液中，待全部加入后，70℃搅拌2.5h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.5，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物IV(1.3g)。
将2.1g马兜铃酸II溶于70ml浓HBr中，降温至0-5℃，缓慢滴加15ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌40min，将重氮化溶液缓慢加入20ml CuBr氢溴酸溶液中，待全部加入后，50℃搅拌2.5h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.5，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物VI(1.5g)。
上述制得的马兜铃次酸衍生物I～VI的理化性质和波谱数据如下：
马兜铃次酸衍生物I：分子式为C18H13ClO4，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠水溶液；薄层板上，喷洒0.5％二苯胺溶液，加热显深蓝色；ESI-MS(m/z):329.06[M+H]+。13C NMR(CD3OD,100MHz)δppm：170.7、156.3、143.0、141.9、132.0、130.1、128.3、127.8(CH)、125.4、125.3、124.6(CH)、119.2(CH)、117.8(CH)、117.1、105.5(CH)、73.9(CH2)、73.1(CH2)、55.9(CH3)。
马兜铃次酸衍生物II：分子式为C18H13BrO4，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠水溶液；薄层板上，喷洒0.5％二苯胺溶液，加热显深蓝色；ESI-MS(m/z):373.01[M+H]+。13C NMR(CD3OD,100MHz)δppm：170.0、156.1、143.8、142.1、131.7、129.5、128.0(CH)、128.0(CH)、127.6、127.0、126.6、119.8(CH)、119.0(CH)、107.5(CH)、106.7、73.9(CH2)、73.1(CH2)、55.8(CH3)。
马兜铃次酸衍生物III：分子式为C17H11ClO4，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠水溶液；薄层板上，喷洒0.5％二苯胺溶液，加热显黑色；ESI-MS(m/z):315.04[M+H]+。13C NMR(CD3OD,100MHz)δppm：170.7、157.3、142.2、142.0、134.8、132.1、130.4(CH)、126.7、126.3(CH)、123.7、123.3、119.2(CH)、116.1(CH)、114.4、109.0(CH)、73.9(CH2)、73.1(CH2)。
马兜铃次酸衍生物IV：分子式为C17H11BrO4，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠水溶液；薄层板上，喷洒0.5％二苯胺溶液，加热显黑色；ESI-MS(m/z):358.99[M+H]+。13C NMR(CD3OD,100MHz)δppm：170.0、155.8、143.9、141.3、132.9、131.8、130.7(CH)、128.9、128.5(CH)、124.0、122.1、119.0(CH)、118.1(CH)、111.0(CH)、101.7、73.9(CH2)、73.1(CH2)。
马兜铃次酸衍生物V：分子式为C17H11ClO3，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠水溶液；薄层板上，喷洒0.5％二苯胺溶液，加热显蓝色；ESI-MS(m/z):299.05[M+H]+。13C NMR(CD3OD,100MHz)δppm：170.7、142.0、141.0、132.2、131.6、131.2、130.4(CH)、129.6、129.3(CH)、127.8(CH)、127.0(CH)、126.7、125.8(CH)、125.5、119.2(CH)、73.9(CH2)、73.1(CH2)。
马兜铃次酸衍生物VI：分子式为C17H11BrO3，不溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠水溶液；薄层板上，喷洒0.5％二苯胺溶液，加热显蓝色；ESI-MS(m/z):343.00[M+H]+。13C NMR(CD3OD,100MHz)δppm：170.0、143.9、140.1、132.4(CH)、131.8、131.4、131.0、130.4(CH)、129.2(CH)、128.5、128.0(CH)、127.7、127.6(CH)、119.0(CH)、118.0、73.9(CH2)、73.1(CH2)。
实施例2：
将市售的马兜铃酸I(2.0g)溶于40ml浓HCl中，降温至0-5℃，缓慢滴加12ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌40min，将重氮化溶液缓慢加入20ml CuCl盐酸溶液中，待全部加入后，45℃搅拌3h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.2，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物I(1.5g)。
将市售的马兜铃酸II(1.7g)溶于15ml浓HCl中，降温至0-5℃，缓慢滴加10mlNaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入10ml CuCl盐酸溶液中，待全部加入后，60℃搅拌2h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.3，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物V(1.3g)。
将市售的马兜铃酸I(5.0g)溶于90ml浓HBr中，降温至0-5℃，缓慢滴加30ml NaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入50ml CuBr氢溴酸溶液中，待全部加入后，45℃搅拌2.5h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.0，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物II(3.8g)。
将市售的马兜铃酸Ia(3.0g)溶于60ml浓HBr中，降温至0-5℃，缓慢滴加17mlNaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入25ml CuBr氢溴酸溶液中，待全部加入后，65℃搅拌2h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.1，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物IV(1.0g)。
将市售的马兜铃酸Ia(2.0g)溶于20ml浓HCl中，降温至0-5℃，缓慢滴加20mlNaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌30min，将重氮化溶液缓慢加入20ml CuCl盐酸溶液中，待全部加入后，55℃搅拌2.5h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.2，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物III(0.8g)。
将市售的马兜铃酸II(2.5g)溶于50ml浓HBr中，降温至0-5℃，缓慢滴加20mlNaNO2水溶液，在0-5℃下搅拌40min，将重氮化溶液缓慢加入20ml CuBr氢溴酸溶液中，待全部加入后，60℃搅拌2h，放置过夜。溶液用30％NaOH调pH至3.2，析出沉淀，静置，抽滤，滤饼干燥，得马兜铃次酸衍生物VI(1.8g)。
经测试分析，上述制得的马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI的理化性质和波谱数据分别与实施例1所述的马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI的理化性质和波谱数据一致。
实施例3：
实验动物及试药
实验动物：SPF级SD大鼠，体重180～220g，购于江西中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(赣)2018-0003。
试药：按实施例1制备的马兜铃酸I、Ia和II，马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI，阿司匹林和角叉菜胶购于上海化学试剂公司，实验前均用0.15％CMC-Na水溶液临时配制成所需浓度。
马兜铃次酸衍生物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响
雄性SD大鼠144只，按体重随机分为12组：正常对照组(生理盐水)、模型组(1％角叉菜胶/生理盐水)，阿司匹林(400mg/kg)阳性对照组，马兜铃酸I组(80mg/kg)、马兜铃酸Ia组(80mg/kg)、马兜铃酸II组(80mg/kg)、马兜铃次酸衍生物I组(80mg/kg)、马兜铃次酸衍生物II组(80mg/kg)、马兜铃次酸衍生物III组(80mg/kg)、马兜铃次酸衍生物IV组(80mg/kg)、马兜铃次酸衍生物V组(80mg/kg)和马兜铃次酸衍生物VI组(80mg/kg)，每组12只。口服灌胃给药，给药1h后，模型组及各实验组右后肢足趾皮下注射1％角叉菜胶-生理盐水溶液(临用时新鲜配制)0.1mL致炎，空白组于模型组的左下肢注射生理盐水0.1mL，用软尺测量各组大鼠致炎前及致炎后5h后的右后肢足围，计算肿胀度。
肿胀度＝(致炎后足跖周长—致炎前足跖周长)/致炎前足跖周长
统计学分析
实验结果以x±SD表示，采用SPSS 11.0软件包进行方差分析，用t检验进行各组间的比较。
结果与结论
马兜铃次酸衍生物I～VI对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响见表1。
表1马兜铃次酸衍生物对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响(n＝12)
注：与正常对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：##P＜0.01；与对应的起始物料组比较：++P＜0.01；与阿司匹林组比较，§§P＜0.01。
由表1可知：与正常组比较，模型组大鼠足肿胀模型造模成功(**P＜0.01)；与模型组比较，马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI组大鼠足趾的肿胀度明显减小(##P＜0.01)，由此表明：本发明所述的马兜铃次酸衍生物均可显著的抑制角叉菜胶所致大鼠的足肿胀，具有显著的抗炎作用；且其在80mg/kg的剂量下，其抗炎效果均明显优于400mg/kg的阿司匹林(§§P＜0.01)。同时，与马兜铃次酸衍生物合成的起始原料马兜铃酸类化合物比较，以马兜铃酸I为起始原料合成的马兜铃次酸衍生物I和II的抗炎效果明显强于马兜铃酸I(++P＜
0.01)；同样，马兜铃次酸衍生物III和IV的抗炎效果明显强于马兜铃酸Ia(++P＜0.01)，马兜铃次酸衍生物V和VI的抗炎效果明显强于马兜铃酸II(++P＜0.01)。因马兜铃酸类化合物的毒性与其所含的间硝基羧酸结构密切相关[3]，而马兜铃次酸衍生物的结构中不含马兜铃酸类化合物的间硝基羧酸结构，由此显示：本发明所述的马兜铃次酸衍生物I～VI不仅抗炎活性显著强于其合成的起始原料马兜铃酸I、Ia和II，同时其毒性也显著减少，可用于抗炎药物的制备，并显示其良好的应用和开发前景。
实施例4
实验动物及试药
实验动物：SPF级SD大鼠，体重180～220g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(赣)2019-0014。
试药：市售的马兜铃酸I、Ia和II(Merck公司)，按实施例2制备的马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI，阿司匹林和角叉菜胶购于上海化学试剂公司，实验前均用0.15％CMC-Na水溶液临时配制成所需浓度。
马兜铃次酸衍生物对角叉菜胶致胸膜炎大鼠胸腔渗出物量和白细胞游走的影响
SD大鼠144只，雌雄各半，随机分为12组：正常对照组(生理盐水)、模型组(1％角叉菜胶/生理盐水)，阿司匹林(100mg/kg)阳性对照组，马兜铃酸I组(50mg/kg)、马兜铃酸Ia组(50mg/kg)、马兜铃酸II组(50mg/kg)、马兜铃次酸衍生物I组(50mg/kg)、马兜铃次酸衍生物II组(50mg/kg)、马兜铃次酸衍生物III组(50mg/kg)、马兜铃次酸衍生物IV组(50mg/kg)、马兜铃次酸衍生物V组(50mg/kg)和马兜铃次酸衍生物VI组(50mg/kg)，每组12只。实验前48、24、1h灌胃给药，未次给药后1h，将大鼠用乙醚浅麻醉，仰位固定于手术台上。在大鼠右侧胸腔注入1％角又菜胶0.25ml，5h后断头处死大鼠，在横隔周边部打开胸腔，用注射器或吸管吸出胸腔液，记录渗出量，并计数细胞数。
统计学分析
实验结果以x±SD表示，采用SPSS 11.0软件包进行方差分析，用t检验进行各组间的比较。
结果与结论
马兜铃次酸衍生物I～VI对角叉菜胶所致胸膜炎大鼠胸腔渗出物量和白细胞游走的影响见表2。
表2马兜铃次酸衍生物对胸膜炎大鼠胸腔渗出物量和白细胞游走的影响(n＝12)
注：与正常对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：##P＜0.01；与对应的起始物料组比较：++P＜0.01；与阿司匹林组比较，§§P＜0.01。
由表2可知：与正常组比较，模型组大鼠胸膜炎模型造模成功(**P＜0.01)；与模型组比较，马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI组大鼠胸腔渗出液量和白细胞游走均显著减少(##P＜0.01)，由此说明本发明所述的马兜铃次酸衍生物具有显著的抗炎作用；且在50mg/kg的剂量下，其抗炎效果明显优于100mg/kg的阿司匹林(§§P＜0.01)。同时，与马兜铃次酸衍生物合成的起始原料马兜铃酸类化合物比较，以马兜铃酸I为起始原料合成的马兜铃次酸I和II的抗炎效果明显强于马兜铃酸I(++P＜0.01)；同样，马兜铃次酸III和IV的抗炎效果明显强于马兜铃酸Ia(++P＜0.01)，马兜铃次酸V和VI的抗炎效果明显强于马兜铃酸II(++P＜0.01)。因马兜铃酸类化合物的毒性与其所含的间硝基羧酸结构密切相关，而马兜铃次酸衍生物的结构中不含马兜铃酸类化合物的间硝基羧酸结构，由此显示：本发明所述的马兜铃次酸衍生物I～VI不仅抗炎活性显著强于其合成的起始原料马兜铃酸I、Ia和II，同时其毒性也显著减少，可用于抗炎药物的制备，并显示其良好的应用和开发前景。
综上实施例3和4的实验结果和分析表明：通过考察马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响和对角叉菜胶所致大鼠胸膜炎胸腔渗出液量和白细胞游走的影响，结果显示：马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI可显著抑制角叉菜胶所致大鼠的足肿胀，也可显著减少角叉菜胶所致大鼠胸膜炎胸腔渗出液量和白细胞游走，从而显示其具有显著的抗炎作用；同时，本发明所述的马兜铃次酸衍生物I～VI的抗炎活性明显强于它们合成的起始原料马兜铃酸I、Ia和II，且其毒性明显减少；另外，其抗炎活性明显优于阳性对照药阿司匹林。由此证明：本发明所述的马兜铃次酸衍生物I、II、III、IV、V和VI具有显著的抗炎作用，且毒性较小，可用于抗炎药物的制备，并显示其良好的应用和开发前景。
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