具体实施方式

本发明提供了一种核苷类似物，所述核苷类似物的结构式如式I所示：

本发明所述核苷类似物的名称为：苄基((((2R,3S)-3-羟基-5-(6-(甲氨基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯，英文名：benzyl((((2R,3S)-3-hydroxy-5-(6-(methylamino)-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphoryl)-L-alaninate(通用名：QKY-613)。化学式为C₂₇H₃₁N₆O₇P，分子量为582.55。本发明核苷类似物在结构上与天然核苷不同，本发明通过用芳香基团和氨基酸酯掩饰住带磷酸的核苷类似物的磷酸基团的氧原子，使得本发明所述核苷类似物能够提高生物体利用度，同时能够使本发明核苷类似物进入人体后合成活性三磷酸代谢物效率显著高于核苷。本发明所述核苷类似物进入人体后，合成活性三磷酸代谢物，在病毒感染初期能够通过病毒复制进入病毒DNA进而引起很强的免疫反应达到抗病毒的效果。具体的，体内感染病原微生物的DNA刺激先天免疫反应，环状GMP-AMP合酶(cGAS)通过识别细胞质DNA和信号，激活STING，进而诱导具有抗病毒和免疫调节活性的I型干扰素(IFNB)。哺乳动物的dm6A水平极低(dm6A/dA<1×10^-6)，而大多数微生物(如细菌)的dm6A水平要高出10000倍以上。哺乳动物DNA聚合酶保真性极高，而病原微生物的DNA聚合酶保真性很低，本发明所述核苷类似物进入体内后合成活性三磷酸代谢物，通过DNA聚合酶插入病毒基因组，而不进入人基因组。经过核苷类似物修饰的病毒基因组，增强了cGAS对其感知能力，进而提高人体固有免疫能力。本发明所述核苷类似物可以应用于制备活体疫苗和DNA疫苗，作为免疫预防。

本发明还提供了上述技术方案所述核苷类似物的制备方法，包括以下步骤：

将溶解后的L-丙氨酸苄酯盐酸盐(式a)与三乙胺混合，进行中和反应，得到游离的L-丙氨酸苄酯，将游离的L-丙氨酸苄酯与二氯化磷酸苯酯(b)混合进行第一取代反应，得到中间产物A，将所述中间产物A与对硝基苯酚(c)和三乙胺混合，进行第二取代反应，得到式1所示化合物，

将N6-甲基脱氧腺苷(式2)溶解于无水四氢呋喃和N-甲基吡咯烷酮的混合液中，加入叔丁基氯化镁进行活化反应，得到活化后的N6-甲基脱氧腺苷，将活化后的N6-甲基脱氧腺苷与式1所示化合物混合，进行第三取代反应，得到如式I所示的核苷类似物。

本发明所述核苷类似物由L-丙氨酸苄酯盐酸盐，二氯化磷酸苯酯、对硝基苯酚和N6-甲基脱氧腺苷反应制备得到。具体反应式如下：

本发明所述制备方法优选在保护气体的环境下进行，如惰性气体或氮气。当所述保护气体为惰性气体时，所述惰性气体优选为氩气。

本发明将溶解后的L-丙氨酸苄酯盐酸盐(式a)与三乙胺混合，进行中和反应，得到游离的L-丙氨酸苄酯。本发明优选使用二氯甲烷作为溶剂对L-丙氨酸苄酯盐酸盐进行溶解，所述L-丙氨酸苄酯盐酸盐的物质的量与二氯甲烷的体积比优选为0.1mol：150～220ml，更优选为0.1mol：200ml。在本发明中，所述L-丙氨酸苄酯盐酸盐和三乙胺混合的摩尔比优选为100：(200～220)，更优选为100:210，三乙胺与L-丙氨酸苄酯盐酸盐的盐酸反应，得到游离的L-丙氨酸苄酯。本发明所述中和反应条件优选为常温，更优选为20～25℃，反应时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明具体实施例中，本发明优选将21.568g L-丙氨酸苄酯盐酸盐(0.1mol)溶于200ml二氯甲烷，加入21.25g三乙胺(0.21mol)进行中和反应。

得到游离的L-丙氨酸苄酯后，本发明将游离的L-丙氨酸苄酯与二氯化磷酸苯酯(b)混合进行第一取代反应，得到中间产物A。游离的L-丙氨酸苄酯交换二氯化磷酸苯酯的一个氯，得到中间产物A(苄基(氯(苯氧基)磷酰)-L-丙氨酸，反应的开始会放热，故本发明在所述混合前，优选降温至-75～-80℃，更优选降温至78℃。本发明优选将二氯化磷酸苯酯滴加入游离的L-丙氨酸苄酯中，游离的L-丙氨酸苄酯与二氯化磷酸苯酯的摩尔比优选为1:(10～12)，更优选为1:11。本发明所述第一取代反应的条件优选为-75～-80℃反应25～35min后再20～30℃反应2.5～3.5h，更优选-78℃反应30min后再20～30℃反应3h。本发明反应条件的设定能够保证第一取代反应进行完全。

得到中间产物A后，本发明将所述中间产物A与对硝基苯酚(c)和三乙胺混合，进行第二取代反应，得到式1所示化合物。在本发明中，所述对硝基苯酚和三乙胺的添加的物质的量分别优选为L-丙氨酸苄酯盐酸盐的物质的量的0.9～1.1倍，更优选分别与L-丙氨酸苄酯盐酸盐的物质的量相同。加入对硝基苯酚后反应放热，故混合后，所述第二取代反应的条件优选为0℃反应25～35min后20～30℃反应4.5～5.5h，更优选为0℃反应30min后再20～30℃反应5h。本发明所述反应条件的设定，能够保证第二反应进行的更完全，本发明所述第二取代反应能使对硝基苯酚交换二氯化磷酸苯酯另一个氯，得到式1所示化合物(无色油状物)。本发明优选采用点板的方法检测所述第二取代反应是否反应完毕。本发明所述点板优选为石油醚：乙酸乙酯体系，石油醚：乙酸乙酯的体积比优选为3:1。反应完毕后，本发明优选进行旋干、过柱，用来分离产物。本发明所述旋干的条件优选为45～55℃，更优选50℃水浴下真空旋干。本发明所述过柱的条件优选为SiO₂(硅胶柱)，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，石油醚：乙酸乙酯的体积比为3:1，其它比例会导致产物分离效果不好。

本发明将N6-甲基脱氧腺苷(式2)溶解于无水四氢呋喃和N-甲基吡咯烷酮的混合液中，加入叔丁基氯化镁进行活化反应，得到活化后的N6-甲基脱氧腺苷。本发明对所述N6-甲基脱氧腺苷(式2)的来源没有特殊限定，采用常规市售产品或者采用常规N6-甲基脱氧腺苷(式2)的合成方法(本发明优选采用自行合成的方式获得，详细合成方法将在下文具体阐述)进行合成均可。在本发明中，所述N6-甲基脱氧腺苷的物质的量与无水四氢呋喃的体积和N-甲基吡咯烷酮的体积比优选为18.85mmol:(90～150)ml：(30～50)ml，更优选为18.85mmol:120ml：40ml。在本发明中，所述叔丁基氯化镁在混合前，优选溶于无水四氢呋喃，所述叔丁基氯化镁在无水四氢呋喃中的浓度优选为1M。在本发明中，所述活化反应的温度优选为20～25℃，时间优选为20～60min，更优选为20min。在本发明中，所述活化反应优选在搅拌条件下进行。

得到式1所示化合物和活化后的N6-甲基脱氧腺苷后，本发明将活化后的N6-甲基脱氧腺苷与式1所示化合物混合，进行第三取代反应，得到如式I所示的核苷类似物。在本发明中，所述式1所示化合物在与N6-甲基脱氧腺苷混合前，优选溶解于无水四氢呋喃中。在本发明中，所述N6-甲基脱氧腺苷与式1所示化合物混合的摩尔比优选为(18～19):(37～38)，更优选为18.85:37.7。在本发明中，所述第三取代反应的温度优选为50～60℃，时间优选为6～8h；更优选为55℃反应7h，使反应进行完全。所述第三取代反应结束后，本发明优选降温至室温(20～30℃)，将反应液倒入10％的氯化氨水溶液中，中和反应液里碱性物质。中和碱性物质后，本发明优选进行萃取，所述萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次。本发明所述萃取优选使用二氯甲烷或氯仿，萃取后，本发明将二氯甲烷层或氯仿层合并，优选用无水硫酸钠干燥，旋干上柱，得到式I所示化合物(白色固体)。本发明所述旋干的条件优选为45～55℃，更优选50℃水浴下真空旋干。本发明所述上柱的条件优选为SiO₂(硅胶柱)，洗脱液优选为二氯甲烷(DCM)与甲醇(MeOH)的混合溶剂，DCM:MeOH的体积比优选为(98:2)～(95:5)，更优选为95:5。

在本发明中，N6-甲基脱氧腺苷(式2)的合成方法优选包括以下步骤：

将甲苯磺酸甲酯溶解在溶剂DMF中，与2'-脱氧腺苷混合，室温搅拌；加入硅藻土，过滤，取滤液与丙酮混合，室温搅拌，过滤取固体，用丙酮洗涤，真空干燥；得到的固体溶解NaOH或KOH的水溶液中，室温搅拌，然后用质量百分含量为8～12％的对甲苯磺酸水溶液中和，旋干上柱，得到(N6-甲基脱氧腺苷)白色固体。

本发明将甲苯磺酸甲酯溶解在溶剂DMF中，与2'-脱氧腺苷混合，室温搅拌，对甲苯磺酸甲酯可以提供甲基，让2'-脱氧腺苷1位的氮变成甲基季铵盐。在本发明中，所述甲苯磺酸甲酯和2'-脱氧腺苷混合的摩尔比优选为(3～5):1，更优选为4:1。在本发明中，所述室温搅拌的条件优选为20～30℃搅拌8～12h。

搅拌过夜后，本发明加入硅藻土，过滤，取滤液与丙酮混合，室温搅拌，过滤取固体，用丙酮洗涤，真空干燥。在本发明中，所述对甲苯磺酸甲酯的物质的量与硅藻土的质量比优选为0.1mol：(18～22)g，更优选为0.1mol：20g。硅藻土能够帮助过滤掉反应液里的固体杂质，丙酮能够将产物从溶液中沉淀出来。在本发明中，当所述对甲苯磺酸甲酯为0.1mol时，与滤液混合的丙酮的添加量优选为800～950ml，更优选为900ml。在本发明中，所述室温搅拌的条件优选为20～30℃搅拌1h。

真空干燥后，本发明得到的固体溶解NaOH或KOH的水溶液中，室温搅拌，然后用质量百分含量为8～12％的对甲苯磺酸水溶液中和，旋干上柱，得到N6-甲基脱氧腺苷(白色固体)。在本发明中，所述NaOH或KOH水溶液的浓度优选为2M。在本发明中，所述固体与NaOH或KOH的摩尔比优选为1：(15～20)。在本发明中，所述室温搅拌的条件优选为20～30℃搅拌1h。在本发明中，所述对甲苯磺酸水溶液中对甲苯磺酸的质量百分含量优选为10％。本发明所述旋干的条件优选为45～55℃，更优选50℃水浴下真空旋干。在本发明中，所述上柱的条件优选为SiO₂，DCM:MeOH＝(10～20):1。

本发明还提供了上述技术方案所述核苷类似物或上述技术方案所述制备方法制备得到的核苷类似物在制备抗病毒药物中的应用。

在本发明中，所述病毒优选包括单纯疱疹病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒。

本发明还提供了上述技术方案所述核苷类似物或上述技术方案所述制备方法制备得到的核苷类似物在制备提高固有免疫能力的药物中的应用。本发明所述核苷类似物进入体内并合成活性三磷酸代谢物(N6-Methyl-dATP，N6mdATP)，病毒核酸酶的保真性低，而哺乳动物DNA聚合酶保真度比较高，因此当人体感染病毒时可通过病毒DNA聚合酶将N6mdATP掺入病毒基因组中而几乎不进入人体基因组。由于细胞质中DNA的存在通常是病原微生物感染的标志，可被环GMP-AMP合酶(cGAS)快速检测，从而引发抗感染免疫反应。故掺入N6mdATP修饰的病毒能引起更强的免疫反应。本发明所述核苷类似物可以通过cGAS增强DNA的感知，进而增强DNA免疫刺激能力。

本发明还提供了上述技术方案所述核苷类似物或上述技术方案所述制备方法制备得到的核苷类似物在制备抗癌药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种核苷类似物及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

按照以下反应式进行本发明核苷类似物的合成：

1)第一步合成化合物1(即式1所示化合物)：

在氩气保护下，将21.568g L-丙氨酸苄酯盐酸盐(0.1mol，1eq)溶于200ml二氯甲烷，加入21.25g三乙胺(0.21mol，2.1eq)，降温到-78℃，滴加入23.2g二氯化磷酸苯酯(0.11mol，1.1eq)，加完后-78℃保温30min。升至室温反应3h。然后降到0℃，加入13.91g对硝基苯酚(0.1mol，1eq)和10.12g三乙胺(0.1mol，1eq)。加完后保温30min，然后升到室温反应5h，点板(石油醚：乙酸乙酯)。反应完毕后溶液直接旋干，过柱(SiO₂，石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，得到23g无色油状物，收率50.4％。

化合物1的H NMR谱图如图1所示。根据图1可知，化合物1的1H NMR谱给出5组峰，其积分比(由低场至高场)为2:12:2:2:3，共21个氢质子，与式1所示结构的氢质子数相符。

化合物1的质谱结果如图2所示。根据图2的质谱结果可以得到的结论为：化合物1质谱质荷比为457.1，质谱采用正电模式，因此精确分子量为456.11。

2)第二步合成N6-甲基脱氧腺苷(dm6A)(式2所示)

在氩气保护下，18.62g对甲苯磺酸甲酯(0.1mol，4eq)溶解在60ml DMF中，加入6.28g 2'-脱氧腺苷(0.025mol，1eq)。反应液在室温搅拌过夜。加入硅藻土20g，过滤。滤液中加入900ml丙酮，室温搅拌1h，有固体产生，过滤。固体用丙酮洗涤，真空干燥。得到的固体溶解在150ml 2MNaOH中，室温搅拌1h。反应液用10％的对甲苯磺酸水溶液中和，旋干上柱(SiO₂，DCM:MeOH＝10:1)得到白色固体0.8g，收率12.1％。3)第三步得到N6-甲基脱氧腺苷。

N6-甲基脱氧腺苷的H NMR谱图如图3所示。N6-甲基脱氧腺苷的1H NMR谱给出13组峰，其积分比(由低场至高场)为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:3:1:1，共15个氢质子，与式2所示的结构的氢质子数相符。N6-甲基脱氧腺苷质谱结果如图4所示。根据图4可知，N6-甲基脱氧腺苷质谱质荷比为266.1，质谱采用正电模式，因此精确分子量为265.12。

3)第三步得到终产物

在氩气保护下，将5gN6-甲基脱氧腺苷(18.85mmol，1eq)溶解在120ml无水四氢呋喃和40ml N-甲基吡咯烷酮的混合液中，室温下加入叔丁基氯化镁37.7ml(1M inTHF，37.7mmol，2eq)。搅拌20min后，加入17.2g化合物1(37.7mmol，2eq)溶解在50ml无水四氢呋喃中的溶液，然后升温到55℃反应7h。反应结束后，降到室温，将反应液倒入10％的氯化铵水溶液中，加入二氯甲烷萃取三次，二氯甲烷层合并，用无水硫酸钠干燥，旋干上柱(SiO₂，DCM:MeOH＝95:5)得到0.67g白色固体，收率6.1％。

实施例2

提高生物利用的实例

将0.1mM的N6-甲基脱氧腺苷(dm6A)和本发明核苷类似物QKY-613分别加入Hela细胞，对照组(Ctrl)加DMSO，12小时后，加入PBS缓冲液洗三次，每1*10^7个细胞加入100微升细胞代谢物的提取试剂(甲醇、乙腈和水体积比为40：40：20)，经液氮和37℃反复冻融后，于4℃，1,3000rpm/min离心15min，取上清以得到细胞代谢物。利用液相串联质谱定量检测提取的代谢物中的N6-Methyl-dATP。结果表明本发明新合成的药物QKY-613细胞利用度明显高于dm6A，如表1和图5所示，表1和图5为提供的细胞内游离的N6-甲基脱氧腺苷三磷酸(N6-Methyl-dATP)含量。

表1不同条件下细胞内游离的N6-甲基脱氧腺苷三磷酸(N6-Methyl-dATP)含量

实施例3

由于病毒DNA聚合酶和哺乳动物DNA聚合酶的保真度差异，本发明提供的核苷类药物QKY-613补充导致N6mdATP进入病毒DNA比进入哺乳动物宿主DNA多10000倍。验证过程如下：结果如表2和图6所示，图6为细胞和病毒基因组内N6-甲基脱氧腺苷(dm6A)和脱氧腺苷(dA)比值的结果图，纵坐标是QKY-613药物进入人类细胞，非洲绿猴肾细胞和病毒后，各自基因组的dm6A和dA之比，横坐标是人类细胞(包括人胚肾细胞HEK293，宫颈癌细胞Hela，单核巨噬细胞THP-1)，非洲绿猴肾细胞(Vero)和病毒(AdV和HSV-1，具体为感染了AdV病毒的HEK293细胞和感染了HSV-1的Vero细胞)。具体过程，向HEK293，Hela，THP-1，Vero细胞加入0.1mM QKY-613，对照为DMSO；AdV和HSV-1复制的细胞分别为HEK293和Vero细胞，因此向HEK293细胞加入适当的AdV病毒，在Vero细胞加入适量的HSV-1病毒，同时将0.1mM QKY-613分别加入含有病毒的HEK293和Vero细胞，对照为DMSO。48h后，利用商品化的试剂盒提取基因组，QPCR标准化病毒和宿主细胞基因组。分别取1微克基因组，加入2U核酸酶(NucleaseP)和0.2U脱磷酶(CIAP)37℃酶解12h。液相串联质谱定量发现腺病毒AdV和单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组dm6A/dA比例显著高于人的细胞和非洲绿猴肾细胞，高于10000倍，即表明QKY-613补充导致N6mdATP进入病毒DNA显著高于其进入哺乳动物宿主DNA。

表2 QKY-613补充导致N6mdATP进入病毒和哺乳动物DNA后定量DNA的N6-甲基脱氧腺苷和脱氧腺苷比值

实施例4

通过单纯疱疹病毒(HSV-1)和腺病毒(AdV)实验进一步说明本发明核苷类似物的抗病毒能力。

实验方法：本发明试验组核苷类似物(QKY-613)分别以终浓度0.1mM加入HSV-1病毒复制细胞Vero，AdV复制的HEK293细胞；脱氧腺苷(dA)作为对照，48h后收病毒，此时试验组中N6mdATP通过病毒复制进入其基因组，得到插入N6mdATP修饰的HSV-1和插入N6mdATP修饰的AdV；对照组得到HSV-1和AdV。采用倍比稀释法来测定病毒滴度，按不同感染复数MOI(Mock表示感染复数为0，MOI：1表示感染复数为1，MOI：10表示感染复数为10)感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和小鼠肺成纤维细胞(MLF)。通过荧光定量PCR测定病毒感染引起的免疫刺激能力(IFNB)。结果如图7～图10(分别对应表3～表6)，图7(表3)为本发明提供的QRT-PCR检测MEF细胞感染HSV-1和插入N6mdATP修饰的HSV-1对IFNB在mRNA水平引起的变化图；图8(表4)为本发明提供的QRT-PCR检测MLF细胞感染HSV-1和插入N6mdATP修饰的HSV-1对IFNB在mRNA水平引起的变化图；图9(表5)为QRT-PCR检测MEF细胞感染AdV和插入N6mdATP修饰的AdV对IFNB在mRNA水平引起的变化图；图10(表6)为QRT-PCR检测MLF细胞感染AdV和插入N6mdATP修饰的AdV对IFNB在mRNA水平引起的变化图。根据图7～图10可知，与正常病毒相比，N6mdATP进入病毒基因组内可以引起强烈的免疫反应，mRNA水平的IFNb可以提高至少10～100倍。

表3 QRT-PCR检测MEF细胞感染HSV-1和插入N6mdATP修饰的HSV-1对IFNB在mRNA水平引起的变化

表4 QRT-PCR检测MLF细胞感染HSV-1和插入N6mdATP修饰的HSV-1对IFNB在mRNA水平引起的变化

表5 QRT-PCR检测MEF细胞感染AdV和插入N6mdATP修饰的AdV对IFNB在mRNA水平引起的变化

表6 QRT-PCR检测MLF细胞感染AdV和插入N6mdATP修饰的AdV对IFNB在mRNA水平引起的变化

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。