具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

本发明涉及的固相担载体是将肽(IgG结合肽)固定化而得的固相担载体，所述肽的特征在于能与IgG结合，其中，

该肽的外侧的2个半胱氨酸残基以下式所示的方式连接，

[化学式3]

[式中，

上部的半胱氨酸残基为肽中的N末端侧的半胱氨酸残基，并且

下部的半胱氨酸残基为肽中的C末端侧的半胱氨酸残基]。

通过本发明涉及的固相担载体，可利用该固相担载体上的IgG结合肽来高效地纯化IgG，所述IgG结合肽对IgG纯化后的碱溶液洗涤的重复具有耐性并且IgG结合亲和性高。

＜包含IgG结合肽的固相担载体＞

一个方案中，本发明涉及包含IgG结合肽的固相担载体。作为本说明书中的“固相担载体”，没有限定，可举出玻璃珠、硅胶等无机担载体、包含交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类的有机担载体、以及通过它们的组合而得的有机-有机、有机-无机等的复合担载体等，其中，亲水性担载体的非特异吸附较少，IgG结合肽的选择性良好，因此是优选的。此处所谓的亲水性担载体，表示使构成担载体的化合物成为平板状时的与水的接触角为60度以下的担载体。作为这样的担载体，可举出包含纤维素、脱乙酰壳多糖、葡聚糖等多糖类、聚乙烯醇、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝聚乙烯、玻璃等的担载体作为代表例。

作为固相担载体的形态，可以是珠状、纤维状、粒子条、膜状(也包括中空纤维)、凝胶状等中的任一者，可选择任意的形态。从制作具有特定排阻极限分子量的担载体的容易程度考虑，特别优选使用珠状。对于珠状的平均粒径而言，10～2500μm的平均粒径容易使用，尤其从IgG结合肽固定化反应易于进行的方面考虑，优选25μm至800μm的范围。作为固相担载体，具体而言，可举出例如磁珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、硅胶珠、及多糖类珠等。

此外，在固相担载体表面存在可用于IgG结合肽的固定化反应的官能团时，有利于IgG结合肽的固定化。作为这些官能团的代表例，可举出羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅烷醇基、环氧基、琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基等、酸酐基、碘代乙酰基等。

作为固相担载体，也可使用市售品。作为市售品，可示例作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、GC700、将烯丙基葡聚糖与亚甲基双丙烯酰胺通过共价键交联而得的SephacrylS-1000、作为丙烯酸酯系担载体的Toyopearl、作为琼脂糖系交联担载体的SepharoseCL4B、作为被环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的Eupergit C250L、包含被NHS基活化的Sepharose担载体的NHS活化预装柱等。但是，本实施方式中，并不仅限于这些担载体、活化担载体。

上述的固相担载体可各自单独使用，也可将任意的2种以上混合。另外，作为固相担载体，从其使用目的及方法考虑，期望表面积较大，优选具有许多大小合适的细孔、即为多孔质。

上述固相担载体优选固定有本说明书中记载的IgG结合肽，肽的固定化可使用本领域技术人员公知的方法来进行，例如可通过物理吸附法、共价结合法、离子结合法等来进行。固定化优选通过例如使IgG结合肽的N末端的氨基直接或介由间隔物与固相担载体共价结合来进行。为了通过使IgG结合肽的空间位阻较小从而提高分离效率、进而抑制非特异性的结合，更优选介由亲水性间隔物进行固定化。亲水性间隔物没有特别限定，例如，优选使用将两个末端用羧基、氨基、醛基、环氧基等取代而得的聚环氧烷烃的衍生物。

被导入至上述固相担载体的IgG结合肽及作为间隔物使用的有机化合物的固定化方法及条件没有特别限定，可示例在将蛋白质、肽固定至担载体时通常采用的方法。例如，可举出下述方法：使担载体与含有氨基的化合物、含有N-羟基琥珀酰亚胺基的化合物、溴化氰、表氯醇、二缩水甘油醚、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼等进行反应而活化(变成与担载体原本具有的官能团相比容易与IgG结合肽反应的官能团)，与IgG结合肽进行反应、固定化的方法；以及，向存在担载体和IgG结合肽的体系中加入碳二亚胺这样的缩合试剂、或如戊二醛这样在分子中具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联来进行固定化的方法，更优选应用在固相担载体的灭菌时或利用时IgG结合肽不会容易地从固相担载体脱离的固定化方法。

包含本说明书中记载的IgG结合肽的固相担载体可填充至色谱柱等中，用于纯化或分离IgG。

以下，对本发明涉及的固相担载体所能包含的IgG结合肽进行详细说明。

本说明书中使用的“IgG”是指哺乳动物、例如人及黑猩猩等灵长类、大鼠、小鼠、及兔等实验动物、猪、牛、马、绵羊、及山羊等家畜动物、以及狗及猫等宠物的IgG、优选人的IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本说明书中的IgG进一步优选为人IgG1、IgG2、或IgG4、或者兔IgG，特别优选为人IgG1、IgG2、或IgG4。

一个方案中，本发明涉及的固相担载体所能包含的IgG结合肽包含下式I表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-(X₂)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3)(I)

[式中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

G为甘氨酸残基，

Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]，

并且，该肽的外侧的2个半胱氨酸残基以下式所示的方式连接，

[化学式4]

[式中，

上部的半胱氨酸残基为肽中的N末端侧的半胱氨酸残基，并且

下部的半胱氨酸残基为肽中的C末端侧的半胱氨酸残基]。

上述式中，N末端或C末端的X_1-3这一表述表示半胱氨酸(C或Cys)以外的独立且任意的氨基酸残基X连续1～3个，构成其的氨基酸残基是相同或不同的残基，优选由3个并非完全相同的残基的序列组成。同样地，X₂也表示半胱氨酸(C或Cys)以外的独立且任意的氨基酸残基X连续2个，构成其的氨基酸残基是相同或不同的残基，优选由这2个连续的氨基酸残基不是相同残基的序列组成。

在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式I’及式I”表示的肽如下所示。

即，式I’表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-(X₁)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X_1-3)(I’)

[式中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

Y为酪氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

G为甘氨酸残基，

N为天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

式I”表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-A-(X₁)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3)(I”)

[式中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

A为丙氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

G为甘氨酸残基，

E为谷氨酸残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

另外，在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式II表示的肽如下所示。

即，式II表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3)(II)

[式中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

G为甘氨酸残基，

Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，

W为色氨酸残基，

Xaa3为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且

Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基]。

上述的式I’、式I”及式II的肽的氨基酸序列中，作为17个氨基酸残基的情况下的、自N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位的氨基酸残基X可以缺失，这样的肽由13个氨基酸长度组成。

本说明书中使用的“作为17个氨基酸残基的情况下的”是在以氨基酸编号称呼肽的氨基酸残基时，针对式I的肽、方便地表述用于自最大氨基酸长度即17个残基的N末端起依次从第1位编号至第17位的术语。

另外，在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式III表示的肽如下所示。

即，式III表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3)(III)

[式中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

A为丙氨酸残基，

Y为酪氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

G为甘氨酸残基，

E为谷氨酸残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

上述的式III的肽的氨基酸序列中，作为17个氨基酸残基的情况下的、自N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位的氨基酸残基X可以缺失，这样的肽可由13个氨基酸长度组成。

此外，上述的各式的肽的氨基酸序列的半胱氨酸(C)以外的氨基酸残基、即、作为17个氨基酸残基的情况下的自N末端起第1～3、5、6、15～17位的各氨基酸残基优选选自以下的氨基酸残基。此处，各大写英文字母为氨基酸的单字母缩写：

第1位的氨基酸残基＝S、G、F或不存在，

第2位的氨基酸残基＝D、G、A、S、P、高半胱氨酸或不存在，

第3位的氨基酸残基＝S、D、T、N、E或R，

第15位的氨基酸残基＝S、T或D，

第16位的氨基酸残基＝H、G、Y、T、N、D、F、高半胱氨酸或不存在，

第17位的氨基酸残基＝Y、F、H、M或不存在，

第5位的氨基酸残基＝A或T，

第6位的氨基酸残基＝Y或W。

另外，在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式IV表示的肽如下所示。

即，式IV表示的肽包含下式表示的、由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T(IV)

[式中，

D为天冬氨酸残基，

C为半胱氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

G为甘氨酸残基，

Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，

W为色氨酸残基，

T为苏氨酸残基，

Xaa3为丙氨酸残基或苏氨酸残基，并且

Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基]。

以下的1)～18)中列举了式I的肽的几个具体例，但当然不限于这些具体例：

1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列号1)；

2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2)；

3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(序列号3)；

4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列号4)；

5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号5)；

6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号6)；

7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号7)；

8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列号8)；

9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(序列号9)；

10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列号10)；

11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列号11)；

12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列号12)；

13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列号13)；

14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(序列号14)；

15)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列号15)；

16)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(序列号16)；

17)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(序列号17)；以及

18)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(序列号18)

[式中，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

Xaa2为高半胱氨酸，优选高半胱氨酸之间彼此形成二硫键]。

作为式I的肽的优选具体例，可举出：

1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列号1，其中，Xaa1为精氨酸(R)；

2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2，其中，Xaa1为R、L、赖氨酸(K)或乙酰化赖氨酸)；以及

4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列号4，其中，Xaa1为R)，

作为特别优选的例子，可举出GPDCAYHRGELVWCTFH(序列号31)。

另外，一个方案中，本说明书中记载的IgG结合肽包含下式V表示的、由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列作为广义的一级结构，

D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T(V)

[式中，

D为天冬氨酸残基，

C为半胱氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

L为亮氨酸残基，

W为色氨酸残基，

T为苏氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物，

Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，

Xaa3为色氨酸残基或酪氨酸残基，

Xaa4为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，

Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基，并且

Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基]，

并且，该肽的外侧的2个半胱氨酸残基以下式所示的方式连接，

[化学式5]

[式中，

上部的半胱氨酸残基为肽中的N末端侧的半胱氨酸残基，并且

下部的半胱氨酸残基为肽中的C末端侧的半胱氨酸残基]。

以下的19)～30)中列举了式V的肽的几个具体例，但当然不限于这些具体例：

19)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号19)；

20)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号20)；

21)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号21)；

22)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(序列号22)；

23)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列号23)；

24)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(序列号24)；

25)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(序列号25)；

26)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号26)；

27)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(序列号27)；

28)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(序列号28)；

29)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(序列号29)；以及

30)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(序列号30)

[式中，Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基或者它们的衍生物]。

如上所述，本说明书中记载的IgG结合肽中，Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、或天冬酰胺残基、或者它们的衍生物，优选为精氨酸残基、赖氨酸残基或其衍生物、亮氨酸残基或天冬酰胺残基，进一步优选为精氨酸残基、赖氨酸残基或其衍生物、或者亮氨酸残基。本说明书中，衍生物的种类没有特别限定，可举出乙酰基或丙炔基等的酰基化衍生物(酰基化衍生物由通式：R-CO-表示，式中，R为烃基、优选碳原子数1～6的烷基)。作为衍生物的例子，可举出例如赖氨酸残基的ε氨基经酰基化、例如经乙酰化而成的衍生物。

如上所述，本说明书中记载的IgG结合肽的特征在于，具有在各氨基酸序列中隔开的至少2个半胱氨酸(C)残基，这些半胱氨酸残基以下式所示的方式连接，

[化学式6]

[式中，

上部的半胱氨酸残基为肽中的N末端侧的半胱氨酸残基，并且

下部的半胱氨酸残基为肽中的C末端侧的半胱氨酸残基]。

制备具有上述接头的肽的方法没有特别限定。

与接头的形成相关的硫原子(S)来自半胱氨酸残基、或者高半胱氨酸残基，通过与另一方的氨基酸侧链的离去基团X进行取代反应来形成接头。

与半胱氨酸残基进行取代反应的情况下，离去基团X结合于另一方的氨基酸的β位，与高半胱氨酸进行取代反应的情况下，离去基团X结合于另一方的氨基酸的γ位。

离去基团X可利用常见的离去基团，可举出例如卤素原子、经磺酰基化的羟基等。本方法的形成接头时的取代反应中，优选卤素原子，进一步优选可使用氯原子。

该取代反应可将原料肽置于合适的缓冲液中、于室温(例如约15℃～30℃)或高温下(30℃～70℃)实施，可于优选40℃～60℃、进一步优选50℃实施。

该取代反应步骤可添加适量的促进取代反应的碱(base)(或碱盐(alkali))、例如其弱碱性的无机或有机形式(例如盐酸胍、碳酸氢钠、及二乙胺等)来进行。

该取代反应步骤中的硫原子(S)与离去基团(X)的混合比率没有特别限定。硫原子(S)与离去基团(X)的摩尔比率可设为例如1:0.2～1:5，优选1:0.5～1:2，进一步优选1:1。

对于该取代反应步骤的反应时间而言，只要在硫原子(S)与离去基团(X)之间发生取代反应即可，没有特别限定，可设为例如1小时～96小时，优选10小时～72小时，进一步优选24～48小时。

本方法可根据需要还包括下述步骤：从实施上述步骤后的混合物中，分离杂质、例如未反应的肽及化合物等，将通过取代反应而连接的肽纯化。该步骤可使用本领域中已知的方法、例如凝胶过滤色谱、离子交换柱色谱、亲和色谱、反相柱色谱、及HPLC等色谱来进行。

另外，对于本说明书中记载的IgG结合肽而言，可基于提高其稳定性的目的，通过例如N末端的PEG化(附加聚乙二醇)、及C末端的酰胺化等来进行修饰。进行PEG化的情况下的PEG的分子数目没有特别限定，可附加例如1～50个分子、1～20个分子、2～10个分子、2～6个分子、或4个分子的PEG。

另外，本说明书中记载的IgG结合肽可进行多聚体化。本说明书中，所谓IgG结合肽的“多聚体化”，是指介由共价键将2个分子以上的上述IgG结合肽连接，IgG结合肽的多聚体可以为例如2～6聚体、2～5聚体、2～4聚体、2～3聚体，优选为2聚体。

前述肽的多聚体可在该肽间具有间隔物。多聚体化可利用本领域技术人员已知的方法来进行，可通过例如将上述IgG结合肽的N末端的氨基介由间隔物连接2个分子以上来进行。间隔物的种类没有特别限定，可举出例如在两个末端具有羧基的天冬氨酸及谷氨酸等氨基酸、以及将两个末端用羧基、醛基、环氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基等官能团进行取代而得的聚环氧烷烃的衍生物。

对于本说明书中记载的IgG结合肽而言，与人IgG的结合亲和性可以较之其他的人免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)高约10倍以上、优选高约50倍以上、更优选高约200倍以上。本说明书中记载的IgG结合肽和人IgG的结合相关的解离常数(Kd)可通过表面等离子共振谱分析(例如使用BIACORE系统)来确定，例如小于1×10^-1M、小于1×10^-3M，优选小于1×10^-4M，更优选小于1×10^-5M。本说明书中记载的IgG结合肽能与IgG的Fc结构域结合。

本说明书中记载的IgG结合肽可以利用惯用的液相合成法、固相合成法等肽合成方法、基于自动肽合成仪的肽合成等(Kelley等，Genetics Engineering Principles andMethods,Setlow,J.K.eds.,Plenum Press NY.(1990)Vol.12,p.1-19；Stewart等,Solid-Phase Peptide Synthesis(1989)W.H.Freeman Co.；Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:p.5132；“新生化学实验讲座1蛋白质IV”(1992)日本生化学会编，东京化学同人)来制造。或者，可以通过使用了编码本说明书中记载的IgG结合肽的核酸的基因重组法、噬菌体展示法等来制造IgG结合肽。例如可以将编码本说明书中记载的IgG结合肽的氨基酸序列的DNA组入表达载体中，导入宿主细胞中并进行培养，由此制造作为目标的IgG结合肽。制得的IgG结合肽可以通过常规方法、例如凝胶过滤色谱、离子交换柱色谱、亲和色谱、反相柱色谱、HPLC等色谱、硫酸铵分级、超滤、及免疫吸附法等来进行回收或纯化。

肽合成中，例如，准备对各氨基酸(无论是天然或非天然均可)的要键合的α-氨基和α-羧基以外的官能团进行了保护的氨基酸类，在各氨基酸的α-氨基与α-羧基之间进行肽键形成反应。通常，预先将位于肽的C末端的氨基酸残基的羧基介由合适的间隔物或接头结合于固相。选择性地除去如此操作得到的二肽的氨基末端的保护基团，再与下一氨基酸的α-羧基之间形成肽键。连续实施这样的操作从而制造侧链基团被保护的肽，最后，除去全部的保护基团，从固相分离。保护基团的种类、保护方法、肽结合方法的细节详细记载于上述文献中。

利用基因重组法的制造例如可以通过包括下述步骤的方法来进行：将编码本说明书中记载的IgG结合肽的DNA插入至合适的表达载体中，将载体导入至合适的宿主细胞，培养细胞，从细胞内或从细胞外液中回收作为目标的IgG结合肽。载体没有限定，例如为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、及病毒等载体。作为质粒载体，没有限定，可举出来源于大肠杆菌的质粒(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、来源于枯草芽孢杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)、及来源于酵母的质粒(例如YEp13、YCp50等)等。作为噬菌体载体，没有限定，可举出T7噬菌体展示载体(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、及λ噬菌体载体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。作为病毒载体，没有限定，可举出例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、及仙台病毒等动物病毒、以及杆状病毒等昆虫病毒等。作为粘粒载体，没有限定，可举出Lorist6、Charomid9-20、及Charomid9-42等。作为噬菌粒载体，没有限定，例如pSKAN、pBluescript、pBK、及pComb3H等是已知的。载体中可以以能表达目标DNA的方式含有调控序列、用于筛选含有目标DNA的载体的筛选标记、用于插入目标DNA的多克隆位点等。这样的调控序列中包括启动子、增强子、终止子、S-D序列或核糖体结合位点、复制起点、及多聚A位点等。另外，筛选标记可以使用例如氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、及二氢叶酸还原酶基因等。用于导入载体的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如，哺乳动物细胞)、及植物细胞等，向这些细胞的转化或转染包括例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体转染法、粒子轰击(particle gun)法、及PEG法等。转化细胞的培养按照用于培养宿主生物的常规方法进行。例如，对大肠杆菌、酵母细胞等微生物的培养液而言，含有宿主微生物能同化的碳源、氮源、及无机盐类等。为了使本说明书中记载的IgG结合肽的回收变得容易，优选使通过表达而生成的IgG结合肽分泌至细胞外。这可以通过将编码能使IgG结合肽从该细胞中分泌的肽序列的DNA、与编码作为目标的IgG结合肽的DNA的5’末端侧结合来进行。利用信号肽酶切割转移至细胞膜的融合肽，将作为目标的IgG结合肽分泌释放至培养基中。或者，也可以回收集聚至细胞内的作为目标的IgG结合肽。这种情况下，将细胞物理性或化学性地破坏，使用蛋白质纯化技术回收作为目标的IgG结合肽。

＜IgG分离用柱或用于IgG的纯化的试剂盒＞

一个方案中，本发明涉及包含固相担载体的IgG(优选为人IgG)分离用柱，所述固相担载体包含上述的IgG结合肽。

上述IgG分离用柱包括用于纯化或分离IgG的色谱柱、高效液相色谱(HPLC)柱等柱。柱的大小没有特别限定，可根据分析用途、纯化用途、分选用途等用途、施加(apply)(装载)或注入的量、柱的长度或内径等而改变。另外，柱的材质可以是金属、塑料、玻璃等通常作为柱使用的材质。

上述的柱可通过将上述的本发明涉及的固相担载体(可以是干燥或湿润状态中的任何)密实地填充至柱中来制造。

另外，一个方案中，本发明涉及用于纯化IgG(优选为人IgG)的试剂盒，所述试剂盒包含上述的包含IgG结合肽的固相担载体或上述的IgG分离用柱。

本发明涉及的试剂盒可以包含记载了IgG的分析步骤、纯化步骤的使用说明书、纯化所需要的试剂、缓冲液、固相担载体的填充用柱中的至少一者。

＜IgG的纯化方法＞

一个方案中，本发明涉及IgG(优选为人IgG)的纯化方法，其包括使IgG与上述固相担载体或上述IgG分离用柱结合的步骤、及将结合后的IgG洗脱并回收IgG的步骤。

结合步骤可通过本领域技术人员已知的方法来实施。例如，将上述固相担载体或IgG分离用柱用合适的缓冲液平衡，于0℃～室温(优选0℃～约10℃、更优选约4℃的低温)施加含有IgG的液体，使IgG与固相担载体上的IgG结合肽结合。例如分离血清中的IgG时，可使用中性区域的pH(例如pH6.0～7.5)的缓冲液施加至柱中，实施结合步骤。

洗脱步骤也可通过本领域技术人员已知的方法来实施。例如，可以使酸性区域的pH(例如pH2～4)的缓冲液(例如含有0.3M的NaCl的pH3.5～pH2.5的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液或20mM柠檬酸缓冲液)流过柱来进行，也可以使用上述的IgG结合肽通过竞争洗脱来进行洗脱。尤其从成本的观点考虑，优选利用酸进行洗脱。这种情况下，可以通过将固相担载体或柱使用氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、及氢氧化钾溶液等碱性的溶液(例如，0.1M氢氧化钠溶液)进行洗涤，将固相担载体或柱再生，再次用于结合步骤。溶液的碱性的程度可由本领域技术人员容易地决定。因此，本发明涉及的方法可任意地包括通过利用碱性的溶液进行洗涤，使固相担载体或柱再生的步骤。

关于IgG是否已被回收，可通过例如利用电泳的分子量确认、及任意地在其后的使用抗IgG抗体的Western印迹法来进行判定。例如，电泳可通过使用了5～20％丙烯酰胺梯度凝胶的SDS-PAGE来实施，另外，Western印迹法可将电泳后的蛋白质转印至PVDF膜，用脱脂奶封闭后，使用抗IgGα链山羊抗体和HRP标记抗山羊IgG小鼠抗体进行检测。

本发明涉及的方法可用于在从通过各种方法生产的含有IgG的产物中纯化IgG的步骤中得到富含IgG的组分的情况。因此，优选在亲和色谱、HPLC等柱色谱中使用本发明涉及的方法。在纯化IgG时，除了这样的色谱法以外，还可适当组合蛋白质的惯用纯化技术、例如凝胶过滤色谱、离子交换柱色谱、反相柱色谱等色谱、硫酸铵分级、超滤等。

实施例

以下，使用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围不限于这些实施例。

〔实施例1：交联环肽的制备及结合亲和性的测定〕

使用自动肽合成仪Prelude(Protein Technologies,Inc.)，通过固相肽合成法(Fmoc法)合成了原料肽[序列:H₂N-PEG4-GPD(Hse)AYHRGELVWCTFH,Hse：高丝氨酸(序列号32)]。即，基于MSNT/NMI/DCM条件使α-氨基被Fmoc基保护且侧链官能团被通常的保护基团保护的氨基酸与Rink Amide-ChemMatrix树脂缩合，完成C末端氨基酸向树脂的担载。向其中注入Fmoc基去保护溶液(20％哌啶/DMF)，除去Fmoc基后，基于HCTU/NMM/DMF条件使α-氨基被Fmoc基保护且侧链官能团被通常的保护基团保护的氨基酸进行缩合，合成二肽。通过重复实施基于Fmoc基去保护溶液的Fmoc基去保护、和基于HCTU/NMM/DMF条件的氨基酸的缩合操作，合成了目标序列的肽。

保护肽树脂的合成完成后，实施了N-末端Fmoc基的去保护、利用二碳酸二叔丁酯、DIPEA的N-末端氨基的Boc化。然后，为了将Hse的羟基氯化，使用2％TFA/5％TIPS/93％DCM仅将作为Hse的保护基团的Trt基去保护。将去保护后的Hse的游离羟基利用三光气、三苯基膦进行氯化。树脂上的Hse羟基的氯化结束后，将去保护溶液(2.5％三异丙基硅烷、2.5％水、2.5％1,2-乙二硫醇、92.5％三氟乙酸)添加至保护肽树脂中，反应4小时，由此，在除去肽侧链保护基团的同时从树脂切出游离肽。

滤去树脂，将得到的滤液添加至冷醚中，由此将肽沉淀并回收。利用Proteonavi柱(SHISEIDO)，溶剂体系使用0.1％TFA水溶液及乙腈，将得到的肽纯化。

利用CAPCELL PAK UG120柱(SHISEIDO)及HPLC装置(HITACHI)确认最终纯化肽的纯度。另外，利用ESI-MS装置(Synapt HDMS，WATERS)确认分子量，冷冻干燥。

将如上所述地得到的Hse侧链羟基经氯化的原料肽溶解于6MGn·HCl,0.2MTris·HCl,1mM TCEP水溶液中，使其于50℃反应，由此进行环化。自反应开始起39小时后，通过HPLC分析确认环化产物。利用Proteonavi柱(SHISEIDO)，溶剂体系使用0.1％TFA水溶液及乙腈，将作为目标的环肽纯化。

利用CAPCELL PAK UG120柱(SHISEIDO)及HPLC装置(HITACHI)确认最终纯化肽的纯度。另外，利用ESI-MS装置(Synapt HDMS，WATERS)确认分子量，冷冻干燥。

需要说明的是，上文中的缩写如下所示：

DCM：二氯甲烷；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；Fmoc：9-芴基甲基氧基羰基；Boc：叔丁氧基羰基；DIPEA：N,N’-二异丙基乙胺；HCTU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸酯；MSNT：1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑；NMI：N-甲基咪唑；NMM：N-甲基吗啉。

通过以上的步骤，得到了N末端PEG4化及C末端酰胺化肽(交联环肽)，所述肽包含GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2，Xaa1为精氨酸、C末端酰胺化；相当于序列号31所示的氨基酸序列)所示的氨基酸序列，并且肽的外侧的2个半胱氨酸残基以下式所示的方式连接，

[化学式7]

[式中，

上部的半胱氨酸残基为肽中的N末端侧的半胱氨酸残基，并且

下部的半胱氨酸残基为肽中的C末端侧的半胱氨酸残基]。

亲和性分析通过以下的方法实施。首先，向安装于BIAcoreT200(GE healthcare)的CM5传感芯片上，以10μl/ml的流速将等量混合的0.4M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和0.1Msulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide，磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)溶液注入传感芯片，由此将传感芯片激活。然后，在pH 5.5(10mM乙酸Na)的条件下，将人IgG固定化于传感芯片上。测定使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％吐温20、3mM EDTA、pH 7.4)，以流速50μl/ml将15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000nM的上述经纯化的交联环肽注入180秒，由此对结合反应进行监控。解离反应测定时，仅将缓冲液注入600秒。相互作用参数的分析使用BIAevalution T100软件实施。

〔比较例1〕

作为比较例1，合成专利文献2中记载的交联环肽，通过与实施例1同样的方法测定了亲和性。肽的合成、及交联反应在以下条件下实施。

NH2-PEG4化合成肽GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2，Xaa1为精氨酸、C末端酰胺化)是在肽合成微珠(Rink-amide-Chemmatrix resin，Biotage)上、通过Fmoc固相合成法按照常规方法合成的。

从树脂切出肽并实施去保护后，得到肽。将得到的肽65mg(15.6μmol)溶解于含有6M盐酸胍(Gn·HCl)的磷酸缓冲液(pH＝7.3)5mL中，向其中加入溶解于乙腈120μL中的1,3-二氯-2-丙酮(2.9mg，23.4μmol，1.5等量摩尔)，于室温搅拌。1小时后，通过HPLC分析确认反应的结束，将反应溶液直接通过HPLC进行纯化，由此得到环肽(33mg，7.8μmol，收率50％)。

通过以上的步骤，得到了N末端PEG4化及C末端酰胺化肽，所述肽包含GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2，Xaa1为精氨酸、C末端经酰胺化)所示的氨基酸序列，并且外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基介由下式所示的接头连接：

[化学式8]

实施例1及比较例1的亲和性测定结果示于表1。

[表1]

如表1所示，可见实施例1中示出的交联结构的环肽具有IgG结合功能，与专利文献2中记载的交联环肽相比IgG亲和性高。

〔实施例2：动态结合载量(DBC)测定〕

针对交联环肽是否可用作人抗体纯化亲和配体，将其固定化于NHS活化预装柱(GEHealthcare)，实施吸附性能评价。肽固定化柱通过以下的方法制作。需要说明的是，溶液的输送使用了注射器。

向1mL容量的NHS活化预装柱中，输送1mM盐酸5mL，除去柱内的异丙醇溶液。然后，输送1.0mg/mL肽溶液(将溶解于DMSO中的100mg/mL的实施例1中制备的肽溶液使用偶联溶液(20mM碳酸缓冲液，50mM氯化钠，pH 8.3)稀释至100倍)1mL，于室温固定化1小时。然后，使用1M Tris(pH 8.0)5mL，将未反应的NHS于室温封闭1小时。最后，输送吸附溶液(20mM磷酸缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.4)5mL，用于色谱评价。

DBC测定使用液相色谱装置AKTAexplore(GE Healthcare)实施。将制作的柱使用吸附溶液进行平衡后，以1mL/min的流速输送溶解于吸附溶液的1mg/mL来源于人血清的γ-球蛋白(Sigma-Aldrich)。关于DBC，通过在280nm吸光度处、除去非吸附成分后的值达到样品总体吸光度的10％为止所输送的试样量来求出。

〔比较例2〕

作为比较例2，制作将比较例1中合成、交联而得的肽按实施例2同样地进行固定化而得到的柱，实施DBC测定。

各DBC值为实施例2：9.4mg/mL柱，比较例2：2.3mg/mL柱，可见实施例1示出的交联结构的环肽与专利文献2中记载的交联环肽相比IgG吸附性能高。

〔实施例3：耐碱性的评价〕

向通过与实施例2相同的方法制作的1mg肽固定化1mL柱中输送0.1M氢氧化钠溶液10mL，然后，使用吸附溶液10mL进行洗涤。在实施了1、2、5、10次前述氢氧化钠溶液洗涤/吸附溶液洗涤处理后，与实施例2同样地，以流速1mL/min测定DBC。将实施氢氧化钠处理前的DBC设为100％，求出DBC变化率。

〔比较例3〕

作为比较例3，通过与实施例2相同的方法，制作将介由二硫键交联的NH2-PEG4化合成肽(包含GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2，Xaa1为精氨酸、C末端酰胺化)所示的氨基酸序列、并且外侧的2个半胱氨酸残基介由二硫键交联的肽)1mg固定化而得的柱，与实施例3同样地实施了耐碱性评价。

实施例3及比较例3的测定结果示于图1，另外，实施例3及比较例3中的DBC变化率示于图2。另外，将实测值汇总于表2。

[表2]

如图1及2以及表2所示，介由二硫键交联的肽中，由于10次氢氧化钠处理，DBC降低至45.2％(比较例3)。另一方面，实施例1示出的具有交联结构的环肽中，几乎未确认到DBC的降低，可见其具有高耐碱性。

本说明书引用的所有出版物、专利及专利申请均通过引用而原样并入本说明书。