用于骨骼肌内移植的pda-plga细胞支架及其制备方法
阅读说明：本技术 用于骨骼肌内移植的pda-plga细胞支架及其制备方法 (PDA-PLGA cell scaffold for skeletal intramuscular transplantation and preparation method thereof ) 是由 张明 陈立 关越琪 张文友 杨雪晗 于 2021-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明属于骨骼肌部位的移植应用技术领域,具体为用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法,步骤一：配制合适浓度的PLGA纺丝溶液；步骤二：通过静电纺丝法制备连续的无规则纳米纤维,并用金属接收板收集静电纺丝纤维支架,干燥后得到PLGA细胞支架；步骤三：在有氧条件下,将收集好的PLGA细胞支架浸没在含有多巴胺的弱碱性Tris-HCl水溶液中振摇,使其自聚合形成聚多巴胺涂层,干燥后得到PDA-PLGA细胞支架,其结构合理,通过将聚多巴胺能够牢固地粘附在纳米纤维细胞支架上,有效的增强纳米纤维的机械性能和亲水性,对细胞粘附,增殖和生长具有极好的适用性,对组织工程治疗的推进及我国卫生事业的发展有重要的现实意义。(The invention belongs to the technical field of transplantation application of skeletal muscle parts, and particularly relates to a PDA-PLGA cell scaffold for skeletal muscle transplantation and a preparation method thereof, wherein the PDA-PLGA cell scaffold comprises the following steps: preparing PLGA spinning solution with proper concentration; step two: preparing continuous irregular nanofibers by an electrostatic spinning method, collecting an electrostatic spinning fiber scaffold by a metal receiving plate, and drying to obtain a PLGA cytoskeleton; step three: under the aerobic condition, the collected PLGA cytoskeleton is immersed in weak alkaline Tris-HCl aqueous solution containing dopamine to shake, so that the PLGA cytoskeleton is self-polymerized to form a polydopamine coating, and the PDA-PLGA cytoskeleton is obtained after drying.)
技术领域
本发明涉及骨骼肌部位的移植应用技术领域，具体为用于骨骼肌内移植的 PDA-PLGA细胞支架及其制备方法。
背景技术
组织工程主要利用细胞支架材料进行细胞培养，形成具有生物活性的种植体,进行体内组织修复或重建。为细胞的增殖提供三维空间和新陈代谢环境的细胞支架成为组织工程的重要基础，细胞支架的制备方法主要包括：溶剂浇筑、气体发泡、相分离、自组装和静电纺丝法等。其中静电纺丝法能够获得具有三维结构的纳米纤维膜，由于其巨大的细胞外基质仿生潜能，而广泛用于骨、神经、血管和肌腱等的组织修复和功能重建。
目前用作细胞支架的生物材料主要是一些天然高分子，天然无机物和合成高分子。其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是生物医用领域应用最广泛的可降解合成高分子材料，其生物降解速度可调节，力学性能和加工性能比天然材料好，降解产物是乳酸和羟基乙酸，对人体无毒无害。PLGA已经获得美国FDA批准而可用于临床，通常被作为缝线，药物输送装置和组织工程支架的主要材料，但作为合成高分子材料，其生物相容性及细胞亲和性一般都比天然高分子材料差。对材料表面进行涂层修饰可有效提高材料的生物相容性和细胞亲和性，常见的涂层包括透明质酸、胶原蛋白、羟基磷灰石和聚多巴胺等。其中聚多巴胺能够牢固地粘附在纳米纤维细胞支架上，有效的增强纳米纤维的机械性能和亲水性，对细胞粘附，增殖和生长具有极好的适用性。
骨胳肌作为机体内数量最多的组织，对完成躯体的各种活动及维持正常生理状态起着极为重要的作用。骨骼肌作为糖脂代谢的重要靶器官，周围含有丰富的血管、神经、结缔组织和骨组织，在进行肌肉修复、骨修复及糖脂代谢性疾病的治疗时，骨骼肌可以作为组织工程移植治疗的潜在位点，并且在骨骼肌组织更容易进行细胞支架的固定，方便移植后的监测和回收。综上所述，开发一种简单易得，机械性能合适，适用于骨骼肌部位移植，具有良好生物相容性的 PDA-PLGA细胞支架，对组织工程治疗的推进及我国卫生事业的发展有重要的现实意义。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
因此，本发明的目的是提供用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法，能够实现有效的增强纳米纤维的机械性能和亲水性，对细胞粘附，增殖和生长具有极好的适用性。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法，其包括包括如下步骤：
步骤一：配制合适浓度的PLGA纺丝溶液；
步骤二：通过静电纺丝法制备连续的无规则纳米纤维，并用金属接收板收集静电纺丝纤维支架，干燥后得到PLGA细胞支架；
步骤三：在有氧条件下，将收集好的PLGA细胞支架浸没在含有多巴胺的弱碱性Tris-HCl水溶液中振摇，使其自聚合形成聚多巴胺涂层，干燥后得到PDA-PLGA细胞支架。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：所述的PLGA纺丝溶液的质量分数为5％～25％。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：所述的PLGA纺丝溶液中三氯甲烷和丙酮作为溶剂的体积比为2:1～5:1。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：通过静电纺丝法制备连续的无规则纳米纤维时，控制静电纺丝参数为电压5～30kV，静电纺丝喷丝头内径为0.5～2.2mm，溶液流速 1～10ml/h，温度20～30℃，控制静电纺丝喷丝头与接收装置之间的距离为 15～30cm。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：所述的多巴胺弱碱性溶液的多巴胺浓度为1mg/ml～5mg/ml。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：所述的Tris-HCl水溶液pH为8.0～8.5。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：PLGA细胞支架浸没在含有多巴胺的弱碱性Tris-HCl水溶液中振摇时间为12～36h。
作为本发明所述的用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的一种优选方案，其中：用于骨骼肌内移植的PDA-PLGA细胞支架的制备方法得 PDA-PLGA细胞支架后，进行骨骼肌部位的移植应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过该用于骨骼肌内移植的 PDA-PLGA细胞支架及其制备方法的设置，结构设计合理，通过将聚多巴胺能够牢固地粘附在纳米纤维细胞支架上，有效的增强纳米纤维的机械性能和亲水性，对细胞粘附，增殖和生长具有极好的适用性，有利于原位组织的修复及再生，对组织工程治疗的推进及我国卫生事业的发展有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明步骤流程图；
图2为电纺丝过程示意图。
图3为实施例1制备的PDA-PLGA细胞支架的扫描电镜照片。
图4为实施例1制备的PDA-PLGA细胞支架的亲水性测量结果。
图5为实施例1制备的PDA-PLGA细胞支架的力学性能测量结果。
图6为实施例4通过MTT法检测的多种细胞在PDA-PLGA细胞支架上的增殖结果。
图7为实施例5通过荧光显微镜观察到的细胞在PDA-PLGA细胞支架上的粘附形态。
图8为实施例6PDA-PLGA细胞支架的骨骼肌移植后的组织HE染色结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
PDA-PLGA细胞支架的制备。
首先将作为静电纺丝主体的高分子聚合物PLGA固体颗粒称取1.0g溶解在4.2mLCHCL3和1.4mLC3H6O(v/v＝3:1)的混合溶液中，在25℃下搅拌1h至完全溶解，制得质量分数约12％的静电纺丝原液。将上述制得的静电纺丝原液加入 5mL注射器中，前端通过17G平头金属喷丝头与静电纺丝机器连接，并将该注射器固定在注射泵上，金属喷丝头内径1.12mm。调节金属接收板和喷丝头之间的距离，确定接收距离为15cm。其电纺丝过程如图1所示，控制纺丝过程中金属喷丝头与接收板间的静电高压为15kv，用注射泵控制静电纺丝原液的流速为 1.5mL/h，纺制3小时，将制得的材料取下放在通风橱中干燥过夜即得到PLGA纤维支架。
配制10mM Tris-HCl缓冲溶液，用HCl调节pH＝8.5，取20mg多巴胺盐酸盐溶解于10mL Tris-HCl缓冲溶液中，制备成2mg/mL多巴胺弱碱性溶液。取合适大小的PLGA纤维支架浸没在多巴胺弱碱性溶液中，保持有氧条件下，充分振摇使多巴胺在材料表面自聚合成聚多巴胺(PDA)涂层，在pDA的自聚合期间，观察到溶液颜色从浅棕色变为黑色，24小时后将支架取出，用蒸馏水轻轻冲洗3 次，以去除未附着的聚多巴胺分子，将制得的材料放在通风橱中干燥过夜即得到PDA-PLGA细胞支架。
扫描电镜(图2)分析结果显示，与未修饰的PLGA纤维支架相比，经过PDA 表面改性的PLGA纤维支架表面有更加粗糙的表面形态，在纳米纤维的表面上观察到PDA层和自聚合的PDA颗粒的沉积，表明PDA涂层增加了PLGA纤维支架的表面粗糙度。该结果表明pDA涂层改变了PLGA纤维支架的表面性质。
实施例2
PDA-PLGA细胞支架亲水性检测。
在制备好的PDA-PLGA细胞支架和未经过涂层处理的PLGA细胞支架材料表面注射体积为20μL去离子水，将去离子水滴放置在一个样品的六个不同位置，利用水接触角测量仪(SL200B)，每个样品测量6次水接触角，取平均值，计算接触角大小。
水接触角(图3)测量结果显示，未修饰的PLGA细胞支架水接触角为122°，经PDA涂层处理的PDA-PLGA细胞支架水接触角降至103°，表面亲水性是生物材料影响细胞活性(例如粘附和迁移)的主要因素。与未修饰的PLGA纤维支架相比，经过PDA表面改性的PLGA纤维有更好的亲水性和表面湿润性，更有利于细胞的附着和增殖。
实施例3
PDA-PLGA细胞支架力学性能检测。
将制备好的PDA-PLGA细胞支架和未经过涂层处理的PLGA细胞支架材料裁剪成宽1cm，长3cm的矩形，通过游标卡尺测量厚度，测量每个膜上的四个随机点，取平均值作为厚度(≈0.1mm)。用电子万能试验机(INSTRON 5948)检查所取样品的拉伸强度和弹性模量，测量时两端各留出1cmx1cm的正方形夹持位置，将材料条两端夹在液压夹上，实际工作面积为1cmx1cm，固定后，以1mm/min 的速度恒速轴向向两端牵拉材料至材料断裂，得出两种材料的应力-应变曲线，将应力-应变曲线的屈服点值确定为拉伸强度，并且通过曲线的线性部分的斜率计算弹性模量。每种材料做4组平行实验。
力学性能(图4)测量结果显示与未修饰的PLGA细胞支架相比，经过PDA 表面改性的PDA-PLGA细胞支架力学性能得到显著提高。未修饰的PLGA细胞支架的弹性模量为118.625MPa，拉伸强度为2.4275MPa，经PDA涂层修饰后，材料弹性模量提高到164.75MPa，拉伸强度提高到3.365MPa，材料的刚度和韧性显著提高。综上所述，PLGA细胞支架可以通过简单地浸入多巴胺溶液中而具有优异的综合机械性能。PDA涂层和PLGA细胞支架纳米纤维之间可以形成共价键和氢键，可以有效地增强PLGA细胞支架纳米纤维的机械性能，使其在移植部位及移植方式上有更多的选择空间，并使其在组织工程领域有更广阔的应用范围。
实施例4
观察细胞在PDA-PLGA细胞支架上的增殖情况。
将制备好的PDA-PLGA和PLGA细胞支架裁剪为直径约6.5mm的圆片，将圆片浸泡在70％乙醇中灭菌2h，之后用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)冲洗 3次，并在超净工作台内风干。分别将单核巨噬细胞(RAW264.7)，骨骼肌细胞 (C2C12)，脐静脉内皮细胞(HUVEC)等多种细胞制成密度为1x104/mL的细胞悬液，将灭菌后的材料放入96孔细胞培养板中，然后取200μL细胞悬液，将细胞以2x103细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞恒温培养箱中培养7天，每隔2天换一次液，为了检测细胞在支架上的增殖情况，分别在接种后第1，3，5和7天，使用MTT 法检测细胞活力。向待测的96孔细胞培养板中20μLMTT(5mg/mL)，并孵育4 小时。随后，吸去上清液，并向每个孔中加入200μLDMSO，振荡10分钟，通过使用酶标仪在570nm处观察吸光度值。检测PDA-PLGA和PLGA细胞支架对细胞的增殖是否有影响。
MTT(图5)测量结果显示与未修饰的PLGA细胞支架相比，经过PDA表面改性的PDA-PLGA细胞支架上的细胞活力显着增加。由于PDA-PLGA表面形成PDA 涂层，其支架表面的粗糙程度大大增加，有利于细胞的粘附和贴壁，另外PDA 涂层产生大量的胺和羟基，有助于细胞的粘附，扩散和生长。这些结果表明， PDA-PLGA细胞支架具有良好的生物相容性，PDA涂层能够促进细胞在PLGA细胞支架上的生长和增殖。
实施例5
观察细胞在PDA-PLGA细胞支架上的粘附形态。
将聚合物PLGA固体颗粒称取1.0g溶解在4.2mLCHCL3和1.4mLC3H6O (v/v＝3:1)的混合溶液中，随后加入280μg罗丹明(≈50μg/mL)，在25℃下搅拌1h至完全溶解，制得含有罗丹明的静电纺丝原液。静电纺丝过程及PDA涂层处理过程同实施例1，即可得到含有红色荧光的PDA-PLGA和PLGA细胞支架，将制备好的PDA-PLGA和PLGA细胞支架裁剪为直径约14mm的圆片，将圆片浸泡在70％乙醇中灭菌2h，之后用PBS冲洗3次，并在超净工作台内风干。分别将 RAW264.7，C2C12，HUVEC细胞制成密度为2x104/mL的细胞悬液，将灭菌后的材料放入24孔细胞培养板中，然后取500μL细胞悬液，将细胞以1x104细胞/孔的密度接种在24孔细胞培养板中，将24孔细胞培养板中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞恒温培养箱中培养。24h后取出24孔细胞培养板，将样品用 PBS洗涤1次，在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟，固定后将样品用PBS洗涤3次，然后用0.1％Triton X-100(碧云天)透化细胞3分钟，透化后将样品用PBS洗涤3次。然后向每个孔中加入200μL Phalloidin-iFluor 488试剂 (1:1000稀释；abcam)，室温避光孵育40分钟，并用PBS冲洗3次以去除多余染料。将PDA-PLGA和PLGA细胞支架置于载玻片上，在支架上滴加含DAPI的抗荧光衰减封片剂(Solarbio)，盖上盖玻片，通过正置荧光显微镜(Carl Zeiss,Axio Imager.Z2)观察细胞在细胞支架上培养24h后细胞的粘附形态。
细胞粘附(图6)结果显示细胞可以粘附在细胞支架上，且观察到细长的伪足延伸在3D的细胞支架纳米纤维结构中。细胞通过延长的丝状伪足附着于表面，并且在其表面倾向于沿着聚合物纳米纤维生长。与PLGA细胞支架相比，经过PDA 表面改性的PDA-PLGA细胞支架，显示出更多的细胞粘附和增殖。由于其良好的亲水性，粗糙的表面结构和及更大的比表面积，PDA-PLGA支架有帮于细胞粘附，帮助细胞浸润。
实施例6
通过实施例1制得的PDA-PLGA细胞支架进行大鼠动物实验对PDA-PLGA细胞支架进行安全性评价。
取SPF级SD大鼠12只，腹腔注射10％水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉，在大鼠后肢皮肤表面作切口，暴露肌肉组织，将12只大鼠随机分为2组，假手术组只进行大鼠后肢处切口和缝合，不植入材料，实验组将材料裁成1.5x3cm大小，卷成棒状移植在大鼠肌肉内，并进行缝合。术后对动物进行常规的喂养及观察。术后大鼠动物恢复良好，切口愈合良好，无感染发生。大鼠进食进水正常，活动正常，没有发生运动障碍。
动物实验结果显示术后第28天，大鼠生长活动完全正常，切口基本愈合，仅见缝合的细线，未见明显充血，出血等排异反应。在第28天对材料的肌肉移植部位1cm范围切取标本，进行组织切片和HE染色，染色结果显示，第28天大鼠移植部位的巨噬细胞浸润主要集中在PDA-PLGA支架的边缘，与之相邻的肌肉组织的炎性细胞浸润基本消失(图7a)，并在移植的PDA-PLGA支架内发现新血管形成(图7b)，其有利于原位组织的修复及再生。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
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