具体实施方式

以下，参照所附附图对本申请的实施例进行详细说明，以便使本申请所述技术领域的技术人员可轻易实施。但是，是本申请可以以多种不同形态体现，而并不仅限于在此说明的实施例。另外，为了在附图中更加明确地说明本申请，省略了与说明无关的部分，且在整个说明书中，对于相似的部分赋予了相似的附图标记。

本申请的整个说明书中，当说某个部分与其他部分“连接”时，其不仅包括“直接连接”的情况，还包括以在中间夹有连接物(linker)等物质的方式“间接连接”的情况。

本申请的整个说明书中，当一个构件位于另一构件“上”时，不仅包括构件与另一构件接触的情况，还包括在两个构件之间存在另一构件的情况。

本申请的整个说明书中，当说某个部分“包括”某种结构要素时，除非有明确相反的记载，否则应理解为并不排除其他结构要素，而是还可包括其他结构要素。本申请的整个说明书中使用的术语“约”、“实质上”等是为了在所提及的含义中提示存在固有的制备及物质允许误差时，使用为其数据或接近其数据的含义，这是为了防止其他人恶意不当地利用在本申请中为便于理解而给出准确或绝对数值的公开内容。本申请的整个说明书中使用的术语“进行～的步骤”或者“～的步骤”并不是指“用于～的步骤”。

本申请的整个说明书中，马库什方式的表达方式中包括的“它们的组合(多个组合)”的术语是指选自由马库什方式的表达方式所记载的结构要素构成的组中的一个以上的混合或者组合，换句话说，是指包括选自上述结构要素构成的组中的一种以上。

本申请的整个说明书中，“A及/或B”的记载是指“A或者B、或者A和B”。

以下，将参照所附的附图对本申请的体现例以及实施例进行详细说明。然而，本申请并不仅限于这些体现例以及实施例和附图。

本申请的第一实施方式提供一种包含鼠李糖乳杆菌LM1011(Lactobacillusrhamnosus LM1011，保藏机构：韩国典型培养物保藏中心，保藏号：KCTC12751BP，保藏日期：2019年4月18日)作为有效成分的皮肤美白用化妆品组合物。

在本申请的一体现例中，上述皮肤美白化妆品组合物可包含上述鼠李糖乳杆菌LM1011菌株、其死菌体、破碎物、培养产物、浓缩物或提取物作为有效成分，但不限于此。例如，上述皮肤美白用化妆品组合物可以包括经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011菌株作为有效成分，但不限于此。

在本申请的一体现例中，可以对上述鼠李糖乳杆菌LM1011菌株进行热处理以利用乳酸菌死菌体本身，并且当将上述鼠李糖乳杆菌LM1011菌株应用于化妆品产品时，可以减少由于异常发酵引起的产品不稳定性，但不限于此。

在本申请的一体现例中，当上述皮肤美白用化妆品组合物包含鼠李糖乳杆菌LM1011，对于其含量不做特别限制，例如包含的上述鼠李糖乳杆菌LM1011的浓度可以约为1×10¹¹细胞/mL至约为5×10¹¹细胞/mL，但不限于此。

在本申请的一体现例中，当上述皮肤美白用化妆品组合物包含的上述鼠李糖乳杆菌LM1011的浓度小于约1×10¹¹细胞/mL或者大于约5×10¹¹细胞/mL时，可能会降低上述皮肤美白效果，因此，上述鼠李糖乳杆菌LM1011的浓度可以为约1×10¹¹细胞/mL至约5×10¹¹细胞/mL、约1×10¹¹细胞/mL至约4×10¹¹细胞/mL、约1×10¹¹细胞/mL至约3×10¹¹细胞/mL、约1×10¹¹细胞/mL至约2×10¹¹细胞/mL、约2×10¹¹细胞/mL至约5×10¹¹细胞/mL或者约3×10¹¹细胞/mL至约5×10¹¹细胞/mL，但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述鼠李糖乳杆菌LM1011可减少黑色素的产生，但不限于此。例如，上述鼠李糖乳杆菌LM1011可减少由于暴露于紫外线而增加的皮肤中黑色素的产生，但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述鼠李糖乳杆菌LM1011可通过调整酪氨酸酶活性来降低黑色素生成，但不限于此。例如，上述鼠李糖乳杆菌LM1011将L-酪氨酸变为L-多巴，并通过将上述L-多巴变为多巴醌来调节用于产生黑色素的酶的酪氨酸酶的活性，具体地，通过抑制酪氨酸酶的表达水平和/或活性来减少皮肤中黑色素的产生，但不限于此。

在本申请的一个实施方案中，对于上述皮肤美白用化妆品组合物的剂型没有特别限制，例如，可以选自润肤露类、乳液类、精华类、乳霜类、面膜类、粉底类以及隔离霜类中的任何一种，但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述皮肤美白用化妆品组合物可以添加有根据化妆品的剂型或使用目的而任意选择的材料，但不限于此。例如，可以添加纯净水、油分、表面活性剂、保湿剂、高级醇、增稠剂、螯合剂、色素、脂肪酸、抗氧化剂、防腐剂、蜡、pH调节剂、香料等、但不限于此。

在本申请的一体现例中，当上述皮肤美白用化妆品组合物的剂型为糊剂、霜剂或凝胶剂时，载体(carrier)成分可以包括：动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等、但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述皮肤美白用化妆品组合物的剂型为粉末或喷雾剂时，载体成分可以包括：乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末、特别是在喷雾的情况下、可以另外包括推进剂、例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚、但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述皮肤美白用化妆品组合物的剂型为溶液或乳状液时，载体成分可以包括：溶剂、增溶剂或乳化剂，例如：水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述皮肤美白用化妆品组合物的剂型为悬浮液时，载体成分可以包括：液体稀释剂，例如：水、乙醇或丙二醇；混悬剂，例如：乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯以及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯；微晶纤维素；甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等，但不限于此。

在本申请的一体现例中，上述皮肤美白用化妆品组合物的剂型为含表面活性剂的清洁剂时，载体成分可以包括：脂族醇硫酸盐、脂族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等，但不限于此。

本申请的第二实施方式提供一种包括施用/适用皮肤美白用化妆品组合物的步骤的改善皮肤方法，上述皮肤美白用化妆品组合物包含鼠李糖乳杆菌LM1011(Lactobacillusrhamnosus LM1011，保藏机构：韩国典型培养物保藏中心，保藏号：KCTC12751BP，保藏日期：2019年4月18日)作为有效成分。其中，与第一实施方式重复的内容也适用于二实施方式。

最佳实施方式

在下文中，将通过本申请的实施例更详细地描述本申请，但是以下实施例仅是说明性的，以帮助理解本申请，并且本申请的内容不限于以下实施例。

1.乳酸菌死菌体的制造及细胞试验

1-1.包含鼠李糖乳杆菌LM1011的皮肤美白用化妆品组合物的制备

通过分批培养方法制备根据本实施例的鼠李糖乳杆菌LM1011死菌体。

上述乳酸菌的培养是在100L发酵罐(Cobiotech)中以总量为60L的培养液进行的，搅拌速度为30rpm，温度保持在35℃至37℃，pH为5至6.5。培养后，将培养液以13000rpm离心30分钟以回收菌体。将回收的细胞用生理盐水(0.9％NaCl)以2倍的重量比进行稀释，然后在高压灭菌器中，在110℃下进行10分钟的丁达尔过程，并通过冷冻干燥最终得到经热处理的乳酸菌死菌体(鼠李糖乳杆菌LM1011)。

1-2.黑色素生成减少效果(体外(in vitro))

对上述实施例中得到的经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011确认了黑色素生成减少效果。作为细胞系使用了B16-F10黑色素瘤细胞系，并在6孔细胞培养板(6-well cellculture plate)中将其以1×10⁴细胞/孔(cells/well)的浓度接种。培养24小时后，将上述细胞系中经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011的浓度分别调节至0细胞/mL(阴性对照组)、1×10⁴细胞/mL、1×10⁵细胞/mL、1×10⁶细胞/mL、1×10⁷细胞/mL和1×10⁸细胞/mL，并培养48小时。可使用EX-CYTOX(EZ-3000，Daeil lab service)并通过多板读取器(Multi-platereader)测量450nm的吸光度来测量细胞中表达的蛋白质量，之后通过比较相对于阴性对照组的黑色素合成抑制率来确判断是否有黑色素生成抑制效果。除了上述经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011菌株实验组之外，还将能体现美白功能的化合物β-熊果苷作为200ug/mL阳性对照组进行了比较。

如图2所示，与阴性对照群相比，经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011在1×10⁵细胞/mL至1×10⁸细胞/mL的浓度下表现出有效的黑色素生成减少效果，特别是在1×10⁸细胞/mL浓度下显示出比β-熊果苷高约20％的黑色素产生减少效果。

2.制造含有死菌体的化妆品及人体适用试验

2-1.化妆品制造

将以上实施例中制备的鼠李糖乳杆菌LM1011乳酸菌死菌体稀释至重量比为2至10倍以内，并将细胞浓度调节至1×10¹¹细胞/mL。

按照下表1所示的配合量，通过常规方法制备对照组和实验组精华素(serum)。

【表1】

2-2.对于黑色素过多症(hypermelanosis)的美白效果(体内(in vivo))

通过临床实验确认了以上述实施例得到的包含经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011作为有效成分的皮肤美白用化妆品组合物的美白效果。该实验针对23名符合选择标准且未纳入豁免标准的黑色素过多症患者进行，并施用了每天两次自行涂抹的方法。通过利用的M-值(色素沉着(hyperpigmentation)改善指数)评估、受试者的评估、皮肤科医生的皮肤刺激性评估以及皮肤科医生的视觉评估等确认了美白效果。

如图3所示，通过分别在对照部位和试验部位分别求出试验前的M-值和试验后的M-值之差，获得了上述皮肤美白用化妆品组合物的色素沉着改善率。该结果通过将其表示为测试前的测量值的百分比来表示时间上的改善率。与作为对照组的安慰剂组相比，本发明的皮肤美白用化妆品组合物在皮肤上施用后色素沉着的减少程度随施用时间的增加而增加。

如图4所示，根据对照部位和试验部位的测试前后的差，求出上述皮肤美白用化妆品组合物的视觉评估得分。与作为对照组的安慰剂组相比，本申请的皮肤美白用化妆品组合物随着施用时间增加了色素沉着减少的程度。

以上结果表明，包含本申请的经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011作为有效成分的皮肤美白用化妆品组合物在施用于皮肤时具有减少黑色素和随之带来的美白皮肤的效果。

2-3.增白效果(in vivo)

通过临床实验确认了以上述实施例得到的包含经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011作为有效成分的皮肤美白用化妆品组合物的美白效果。该实验针对23名符合选择标准且未纳入豁免标准的黑色素过多症患者进行，并施用了每天两次自行涂抹的方法。通过使用色度计(Chromameter)测量面部区域的亮度值(L-值)，将增白效果表示为皮肤亮度指数的改善率。

如图5所示，通过分别在对照部位和试验部位求出试验前的L值和试验后的L值之差，获得了上述皮肤美白用化妆品组合物的增白效果。该结果通过将其表示为测试前的测量值的百分比来表示时间上的改善率。与作为对照组的安慰剂组相比，本申请的皮肤美白用化妆品组合物显着提高了使用后的皮肤亮度指数的改善率。以上结果表明，包含本申请的经热处理的鼠李糖乳杆菌LM1011作为有效成分的皮肤美白用化妆品组合物在施用于皮肤时具有增白效果。

3.鼠李糖乳杆菌LM1011的酪氨酸酶(tyrosinase)抑制活性的评估

3-1.细胞毒性确认

为了比较并确认鼠李糖乳杆菌HK-9(以下称为HK-9)与作为调节鼠李糖乳杆菌LM1011的黑色素生成反应的关键酶的酪氨酸酶(tyrosinase)的抑制活性，进行了以下实验。

首先，为了确认LM1011和HK-9的细胞毒性并确定处理浓度，将B16F10细胞以5×10⁴个/孔接种在96孔板中。稳定24小时后，以1×10²至1×10⁸个/ml的乳酸菌进行处理。24小时后，将95ul的DMEM(gibco)和5ul的CCK-8试剂盒(Cell Counting kit-8)(CCK-8，Woongbee Meditech)混合并处理。2小时后，并通过多板读数器(Multi-plate reader)测量(450nm)，并转换为基于对照组的百分比，并比较细胞毒性。

结果，当观察图6和7所示的结果时，可证实根据LM1011和HK-9处理浓度的细胞毒性没有统计上的差异，并在下一个实验中，将LM1011和HK-9的处理浓度确定为1×10⁸个/ml。

3-2.抑制酪氨酸酶表达的评估

为了评估根据鼠李糖乳杆菌LM1011和鼠李糖乳杆菌HK-9的α-黑素生成促进激素(Melanocyte stimulating hormone，α-MSH)处理对酪氨酸酶表达的抑制作用，进行了以下试验。

首先，将B16F10细胞系以2×10⁵个/孔接种到6孔板中。稳定24小时后，将实验分为未处理组(Nor)、α-MSH处理组、α-MSH+HK-9处理组和α-MSH+LM1011处理组。处理24小时后，除去培养基，用PBS洗涤，然后用500ul的Trizol处理以破坏细胞。充分破坏细胞后，用100ul的氯仿(chloroform)处理并离心分离(13000rpm，15分钟，4℃)以分离细胞碎片(celldebris)和RNA。取240ul上清液后，通过用等量的异丙醇(Isopropyl alcohol，IPA)处理，使RNA沉淀并离心分离(13000rpm，15分钟，4℃)。除去上清液，并用700ul的75％乙醇(13000rpm，5分钟，4℃)处理并进行离心分离。充分干燥后，将RNA溶于30ul的超纯水(Ultrapure water)中。

接下来，在分离出的RNA进行定量并取1μg后，使用iScript cDNA合成试剂盒(iScript cDNAsynthesis kit)(BIO-RAD)进行cDNA合成。如下表2所示进行PCR反应。

【表2】

cDNA合成完成后，以260ng为模板(template)，使用TaqMan探针(TaqMan probe)(Tyrosinase，Mm00495817_m1，Applied Biosystems)，并通过Real-time PCR(viia 7，Applied Biosystems)对酪氨酸酶的表达量进行了评估。其结果，证实了在α-MSH刺激下，与HK-9处理组相比，LM1011处理组中酪氨酸酶的表达量显着降低(图8，*p＜0.05)。

综合以上结果，证实了在没有细胞毒性的浓度下，本发明的LM1011相比于相同的鼠李糖乳杆菌菌株HK-9，能够更加显着抑制基于黑素生成促进激素刺激的酪氨酸酶表达，并认为本发明的LM1011对皮肤中黑色素合成的抑制作用明显优于现有的鼠李糖乳杆菌菌株。因此，本发明的LM1011菌株可以用作改善美白的组合物，并且适用于化妆品，食品等的功能材料。

上述描述用于本申请进行说明，并且本申请所属领域的普通技术人员应当能够理解，可以在不改变本申请的技术精神或基本特征的情况下容易地将其转换为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。例如，被描述为单一类型的每个构成要素可以以分布式的方式来实现，并且类似地，被描述为分布式的构成要素也可以以组合的形式来实现。

相比于以上进行的详细说明，本申请的保护范围由以下权利要求指示，并且从权利要求的含义和范围以及同等概念得出的所有改变或修改形式应被解释为包括在本申请的保护范围内。

【保藏号】

保藏机构：韩国典型培养物保藏中心

保藏号：KCTC12751BP

保藏日期：2019年4月18日

PCT/RO/134表