一种三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法
阅读说明：本技术 一种三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法 (Preparation method of three-dimensional bionic elastic nanofiber scaffold ) 是由 陈苏 崔婷婷 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法,其具体步骤如下：先将AgNO-3滴加到羧甲基壳聚糖溶液中反应获得CMC/Ag纳米粒子溶液；然后将PCL纺丝液和PCE纺丝溶液进行纺丝,获得PCL/PCE纳米纤维组成的纳米纤维支架；再以相同的纺丝方法将PCL纺丝溶液气喷在PCL/PCE纳米纤维支架上,将其在一定温度下真空干燥以去除残留的甲酸,得到由PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架；最后,将CMC/Ag纳米粒子溶液刮涂在PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架上,将其真空干燥获得三维的PCL/PCE-PCL-CMC/Ag纳米纤维复合支架。该方法易于操作和通用,通过模拟皮肤的三层结构和组成,克服细菌感染并促进全层皮肤伤口的愈合。(The invention relates to a preparation method of a three-dimensional bionic elastic nanofiber scaffold, which comprises the following specific steps: first AgNO 3 Dropwise adding the solution into a carboxymethyl chitosan solution to react to obtain a CMC/Ag nano particle solution; then spinning the PCL spinning solution and the PCE spinning solution to obtain a nano fiber support consisting of PCL/PCE nano fibers; spraying the PCL spinning solution on the PCL/PCE nano-fiber support in the same spinning method, and drying the PCL spinning solution in vacuum at a certain temperature to remove residual formic acid to obtain a PCL-PCL/PCE double-layer nano-fiber support; and finally, scraping the CMC/Ag nano particle solution on a PCL-PCL/PCE double-layer nanofiber support, and drying the PCL/PCE-PCL-CMC/Ag nano particle solution in vacuum to obtain the three-dimensional PCL/PCL-CMC/Ag nanofiber composite support. The method is easy to operate and versatile, overcomes bacterial infection and promotes healing of full-thickness skin wounds by simulating the three-layer structure and composition of the skin.)
技术领域
本发明涉及一种三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法，尤其涉及一种具有克服细菌感染并促进全层皮肤伤口愈合-再生的三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法。
背景技术
近年来，每年因热化学物质，电辐射和其他事故而导致的30万人死亡或遭受皮肤伤害。然而，由于皮肤伤口缺损的发生率高，治疗成本高，伤口面积大，形状不规则和渗出液多，伤口的治疗和管理已成为需要解决的主要医学和社会亟待解决的问题。尽管一些新兴技术(手术切除，厚皮移植)和某些功能性材料(纳米纤维支架，多孔泡沫，生物相容性膜和功能性水凝胶)已成为使用最广泛和首选的治疗方法大面积皮肤修复的方法。但是，这些技术并没有产生最有效的治疗作用，并且常常伴随着一些缺点，例如价格昂贵，耗时，二次损坏和制备复杂。这些材料很难在伤口愈合的四个独特且相互关联的阶段(止血，抗菌，增殖和重塑)中同时发挥作用。因此，迫切需要构建具有仿生结构，生物相容性，抗感染效果和力学性能的多功能生物材料，从而在伤口愈合的四个阶段产生协同作用，并迅速构建皮肤再生。
通过微流体气喷纺丝法制备的具有网络结构的大面积纳米纤维薄膜可以很好地模拟细胞外基质(ECM)成分并刺激细胞的自然功能，从而为细胞提供大的表面积-体积比和高孔隙率，增强氧气和养分的运输。此外，纳米纤维支架在加速伤口愈合方面显示出独特的优势。一方面，从结构上讲，天然皮肤中的细胞要么嵌入纠缠的三维(3D)纤维基质(真皮成纤维细胞)中，要么嵌入微纤维网络(即(基底膜)表面(表皮角质形成细胞)。另一方面，作为精细的3D纳米纤维结构和特定化学组成的锚定平台，它也提供了线索来调节细胞对独特功能的响应。因此通过L-B-L组装方法改变3D纳米纤维支架的组成和结构，3D纳米纤维支架在结构和成分的相互协同作用下完成了包括止血，炎症，增殖和重塑在内的伤口愈合过程，最终实现了皮肤再生
发明内容
本发明的目的在于为了改进现有技术的不足而提供了一种构建具有克服细菌感染并促进全层皮肤伤口愈合-再生的三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法，该方法易于操作和通用，通过模拟皮肤的三层结构和组成，克服细菌感染并促进全层皮肤伤口的愈合。
本发明的技术方案为：一种三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法，其具体步骤如下：
a.将羧甲基壳聚糖(CMC)溶解在蒸馏水中，升至到反应温度，使用碱将溶液调至碱性pH条件下，连续搅拌获得羧甲基壳聚糖溶液；
b.将AgNO3滴加到羧甲基壳聚糖溶液中反应一段时间获得CMC/Ag纳米粒子溶液；
c.将聚己内酯(PCL)加入到有机溶剂中，然后充分搅拌均匀直PCL完全溶解获得PCL纺丝溶液，把PCL纺丝液当做A纺丝溶液；将聚柠檬酸-ε-聚懒氨酸(PCE)溶解在甲酸中直PCE完全溶解获得PCE纺丝溶液作为B纺丝溶液；然后将A纺丝溶液液，B纺丝溶液液分别注射在两个相同的注射器中连接上Y型微流体芯片的两个入口,并调节A，B两相流速；然后进行纺丝，将其在一定温度下真空干燥以去除残留的甲酸，在纺丝过程中，设置一定的空气压力，一定的喷射距离，获得PCL/PCE纳米纤维组成的纳米纤维支架；
d.然后，以相同的纺丝方法(MBS)将PCL纺丝溶液(A纺丝液)气喷在PCL/PCE纳米纤维支架上，将其在一定温度下真空干燥以去除残留的甲酸，得到由PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架；
e.最后，将步骤b获得的溶液通过刮涂法刮涂在PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架上，将其在一定温度下真空干燥以去除残留的溶剂，形成上层为CMC/Ag抗菌层，中间层为PCL纳米纤维支架层，最下层为PCL/PCE纳米纤维支架层的三维的PCL/PCE-PCL-CMC/Ag纳米纤维复合支架。
优选步骤a中所述的反应温度为50-65℃；所述的碱为NaOH或者KOH溶液；碱性溶液的pH值为10-12；所述的羧甲基壳聚糖溶液的质量浓度为0.3-0.6％。
优选步骤b中所述的AgNO3溶液的摩尔浓度为0.1mol/L-0.2mol/L；滴加AgNO3溶液的质量占羧甲基壳聚糖溶液的质量为0.4-0.8％；所述的反应时间为2-4h。
优选步骤c中所述的有机溶剂为甲酸或者六氟异丙醇；所述的PCL纺丝溶液的质量浓度为14-20％；所述的PCE纺丝溶液的质量浓度为14-20％；所述的Y型微流体芯片通道的内径为0.5-1mm；所述的Y型微流体芯片通道的长度为5-7cm。
优选步骤c和步骤d中气喷纺丝的参数均为：空气压力范围为0.01-0.5MPa；筛网距注射器喷嘴的距离范围为23-37cm；纺丝液的流速均为0.1-5mL/h。
优选步骤c中所述的PCL-PCE纳米纤维支架的纤维直径为44-250nm；所述的PCL-PCE纳米纤维支架的拉伸强度范围在18.65±1.07MPa。
优选步骤c、步骤d和步骤e中所述的真空干燥的温度均为25-35℃；真空干燥时间均为6-12h。
优选步骤d中所述的PCL-PCL-PCE双层纳米纤维支架的机械强度范围23.89±2.23MPa。
优选步骤e中所述的刮涂方法为丝棒刮涂法，刮涂速度为200-400mm/h。
优选步骤e中所述的三维的PCL-PCE-PCL-CMC-Ag纳米纤维复合支架的拉伸强度为26.36±1.77MPa。
优选本发明所述的聚己内酯PCL的重均分子量为80000-160000；步骤a中所述的PCE预聚物按照文献中制备(文献：M.Wang,Y.Guo,M.Yu,P.X.Ma,C.Mao,B.Lei,Photoluminescent and biodegradable polycitrate-polyethyleneglycol-polyethyleneimine polymers as highly biocompatible andefficient vectors forbioimaging-guided siRNA and miRNA delivery.Acta Biomaterialia 54(2017)69-80)。
我们开发了一种逐层纺丝(LBL)方法来制造3D仿生弹性多功能(PCL/PCE-PCL-CMC/Ag)纳米纤维支架，该支架具有优异的机械性能，优化的亲水性，强大的抗菌活性，可克服耐药性细菌感染和伤口愈合。通过L-B-L组装方法改变三维纳米纤维支架的组成和结构，三维纳米纤维支架在结构和成分的相互协同作用下完成了包括止血，炎症，增殖和重塑在内的伤口愈合过程，并最终实现了皮肤再生。此外，该三维纳米纤维支架不仅表现出优异的细胞粘附能力，而且具有良好的透氧性，高的表面体积比和生物相容性。因此，三维(PCL/PCE-PCL-CMC/Ag)组织工程支架为细胞的粘附和增殖提供了有效的抗菌和合适的环境，这是一种可行的伤口修复策略。重要的是，可能还会进行更多并行工作，包括大面积皮肤损伤和皮肤烧伤。
有益效果：
1、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架具有直径大小可调，形貌可控的特点。
2、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架的制备方法设备简单，操作方便，且能够实现大规模制备。
3、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架的机械强度和弹性分别可以达到26.36±1.77MPa，270±10％；其拉伸强度和弹性与人类皮肤ECM一致。
4、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架具有很高的抗菌活性，特别是对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这类主要病原体的伤口感染。
5、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架具有优良的生物相容性和组织相容性。
6、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架具有丰富的多孔结构和高表面积，可以促进细胞的招募。
7、本发明制备的三维仿生弹性纳米纤维支架可以促进血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成，有效预防全层皮肤缺损创面感染。
附图说明
图1为实施例1制备的PCL/PCE纳米纤维支架的SEM图；
图2为实施例2制备的三维仿生弹性纳米纤维支架的拉伸强度和弹性曲线图；
图3为实施例3制备的三维仿生弹性纳米纤维支架抗菌活性图；
图4为实施例3制备的三维仿生弹性纳米纤维支架具有优良的生物相容性和组织相容性图。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅限于以下实例。
实施例中所用的PCE是按照文献所制备，具体制备方法如下：将柠檬酸和1.8-辛二醇按照质量比为10:9的比例加入到四口烧瓶中搅拌，然后将油浴锅加热到165℃，直至柠檬酸和1.8-辛二醇熔融掉，然后将油浴锅温度降温到140℃反应一段时间，加入少量的去离子水进行洗涤溶解，最后常温干燥成固体得到聚柠檬酸以备待用。将上述干燥好的聚柠檬酸固体称取2g加入到25ml的烧杯中，然后将2g聚懒氨酸和12ml的DMSO也加入到烧杯中搅拌，最后加入0.1g的EDC和0.08g的NHS作为催化剂进行反应72h，最终获得PCE弹性体聚合物。
实施例1
将0.3g羧甲基壳聚糖溶解在99.7g蒸馏水中，将反应温度升至50℃，使用NaOH将溶液调至碱性pH为10条件下，连续搅拌获得质量浓度为0.3wt％羧甲基壳聚糖溶液。将0.8g的0.1mol/L的AgNO3溶液添加到羧甲基壳聚糖溶液中反应4h。通过监测颜色变化来观察银纳米颗粒溶液的形成(目视观察，当溶液的颜色开始从其原始颜色变为不同程度的黄色时，还原反应开始起作用，并且银纳米颗粒开始变为种子)。然后将2.8g PCL(重均分子量：80000)加入到装有17.2g甲酸的烧杯中，然后充分搅拌均匀直PCL完全溶解获得14wt％的PCL纺丝溶液，把PCL纺丝溶液当做A溶液。类似地，将2.8g PCE溶解在17.2g甲酸中直PCE完全溶解获得14wt％的PCE纺丝溶液作为B溶液。将A纺丝溶液，B纺丝溶液分别注射在两个10mL注射器中连接上通道直径为0.5mm，长度为5cm的Y型微流体芯片的两个入口,并调节A(0.1mL/h)，B(0.1mL/h)两相流速。然后进行纺丝，在纺丝过程中，设置空气压力为0.01MPa，纳米纤维收集在尼龙66筛网上，筛网距注射器喷嘴23cm的距离，然后将其在25℃下真空干燥12小时以去除残留的甲酸，如图1所示，获得的纳米纤维支架由250nm PCL/PCE纳米纤维组成，其拉伸强度为17.58MPa；然后用微流体气喷纺丝法，以相同的参数(空气压力为0.01MPa，筛网距注射器喷嘴23cm的距离，进样速度为0.1mL/h)将制备好的PCL纺丝溶液(质量浓度为14wt％)气喷在PCL/PCE纳米纤维支架上，并将其在25℃下真空干燥12h以去除残留的甲酸，得到由PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架。最后，将CMC/Ag离子溶液以200mm/h的刮涂速度通过丝棒刮涂法刮涂在PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架上，形成上层为CMC/Ag抗菌层，中间层为PCL纳米纤维支架层，最下层为PCL/PCE纳米纤维支架层的三维的PCL/PCE-PCL-CMC/Ag纳米纤维复合支架，将其在25℃下真空干燥12h以去除残留的溶剂，得到的纤维复合支架的拉伸强度为24.59MPa。最终将其应用在大鼠创面上，通过抗菌实验、动物实验和组织分析实验结果发现，三维仿生纳米纤维支架不仅可以有效防止伤口受到大肠杆菌和葡萄球菌的感染，其中，对大肠杆菌和葡萄球菌的杀死率分别可以达到88％，92％。同时，对成纤维细胞具有优良的生物相容性，在第7天时，成纤维细胞的存活率达到了160％。而且能加速表皮，真皮和毛囊组织的形成促进皮肤伤口的愈合和皮肤再生。
实施例2
将0.5g羧甲基壳聚糖溶解在99.5g蒸馏水中，将反应温度升至60℃，使用KOH将溶液调至碱性pH为11条件下，连续搅拌获得质量浓度为0.5wt％羧甲基壳聚糖溶液。将0.6g的0.15mol/L的AgNO3溶液添加到羧甲基壳聚糖溶液中反应3h。通过监测颜色变化来观察银纳米颗粒溶液的形成(目视观察，当溶液的颜色开始从其原始颜色变为不同程度的黄色时，还原反应开始起作用，并且银纳米颗粒开始变为种子)。然后将10.8g PCL(重均分子量：160000)加入到装有49.2g六氟异丙醇的烧杯中，然后充分搅拌均匀直PCL完全溶解获得18wt％的PCL纺丝溶液，把PCL纺丝溶液当做A溶液。类似地，将10.8g PCE溶解在49.2g六氟异丙醇中直PCE完全溶解获得18wt％的PCE纺丝溶液作为B溶液。将A纺丝溶液，B纺丝溶液分别注射在两个50mL注射器中连接上通道直径为0.7mm长度为6cm的Y型微流体芯片的两个入口,并调节A(2mL/h)，B(2mL/h)两相流速。然后进行纺丝，在纺丝过程中，设置空气压力为0.2MPa，纳米纤维收集在尼龙66筛网上，喷射距离为29cm，然后将其在30℃下真空干燥10小时以去除残留的六氟异丙醇，用扫描电镜分析，表明所获得的纳米纤维支架由160nm PCL/PCE纳米纤维组成，其拉伸强度为18.65MPa。然后用微流体气喷纺丝方法，以相同的参数(空气压力为0.2MPa，喷射距离29cm，进样速度为2mL/h)将制备好的PCL纺丝溶液(质量浓度为18wt％)气喷在PCL/PCE纳米纤维支架上并将其在30℃下真空干燥10小时以去除残留的六氟异丙醇；得到由PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架。最后，将CMC/Ag离子溶液以300mm/h的刮涂速度通过丝棒刮涂法刮涂在PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架上，形成上层为CMC/Ag抗菌层，中间层为PCL纳米纤维支架层，最下层为PCL/PCE纳米纤维支架层的三维的PCL/PCE-PCL-CMC/Ag纳米纤维复合支架，将其在30℃下真空干燥10h以去除残留的溶剂，得到的纤维复合支架的拉伸强度为23.89MPa(如图2所示)。最终将其应用在大鼠创面上，通过抗菌实验、动物实验和组织分析实验结果发现，三维仿生纳米纤维支架不仅可以有效防止伤口受到大肠杆菌和葡萄球菌的感染，其中，对大肠杆菌和葡萄球菌的杀死率分别可以达到85％，91％。同时，对成纤维细胞具有优良的生物相容性，在第8天时，成纤维细胞的存活率达到了160％。而且能加速表皮，真皮和毛囊组织的形成促进皮肤伤口的愈合和皮肤再生。
实施例3
将0.6g羧甲基壳聚糖溶解在99.4g蒸馏水中，将反应温度升至65℃，使用NaOH将溶液调至碱性pH为12条件下，连续搅拌获得质量浓度为0.6wt％羧甲基壳聚糖溶液。将0.4g的0.2mol/L的AgNO3溶液添加到羧甲基壳聚糖溶液中反应2h。通过监测颜色变化来观察银纳米颗粒溶液的形成(目视观察，当溶液的颜色开始从其原始颜色变为不同程度的黄色时，还原反应开始起作用，并且银纳米颗粒开始变为种子)。然后将20g PCL(重均分子量：160000)加入到装有80g甲酸的烧杯中，然后充分搅拌均匀直PCL完全溶解获得20wt％的PCL纺丝溶液，把PCL纺丝溶液当做A溶液。类似地，将20g PCE溶解在80g甲酸中直PCE完全溶解获得20wt％的PCE纺丝溶液作为B溶液。将A纺丝溶液，B纺丝溶液分别注射在两个100mL注射器中连接上通道直径为1mm，长度为7cm的Y型微流体芯片的两个入口,并调节A(5mL/h)，B(5mL/h)两相流速。然后进行纺丝，在纺丝过程中，设置空气压力为0.5MPa，纳米纤维收集在尼龙66筛网上，筛网距注射器喷嘴37cm的距离，然后将其在35℃下真空干燥6小时以去除残留的甲酸，用扫描电镜分析，表明所获得的纳米纤维支架由44nm PCL/PCE纳米纤维组成，其拉伸强度为19.72MPa；然后用微流体气喷纺丝方法，以相同的参数(空气压力为0.5MPa，筛网距注射器喷嘴37cm的距离，进样速度为5mL/h)将制备好的PCL纺丝溶液(质量浓度为20wt％)气喷在PCL/PCE纳米纤维支架上并将其在35℃下真空干燥6h以去除残留的甲酸，得到由PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架。最后，将CMC/Ag离子溶液以400mm/h的刮涂速度通过丝棒刮涂法刮涂在PCL-PCL/PCE双层纳米纤维支架上，形成上层为CMC/Ag抗菌层，中间层为PCL纳米纤维支架层，最下层为PCL/PCE纳米纤维支架层的三维的PCL/PCE-PCL-CMC/Ag纳米纤维复合支架，将其在30℃下真空干燥10h以去除残留的溶剂，得到的纤维复合支架的拉伸强度为23.89MPa。最终将其应用在大鼠创面上，通过抗菌实验、动物实验和组织分析实验结果发现，三维仿生纳米纤维支架不仅可以有效防止伤口受到大肠杆菌和葡萄球菌的感染，其中，对大肠杆菌和葡萄球菌的杀死率分别可以达到86％，92％(如图3)。同时，对成纤维细胞具有优良的生物相容性，从图4可以看出，在第7天时，成纤维细胞的存活率达到了160％。而且能加速表皮，真皮和毛囊组织的形成促进皮肤伤口的愈合和皮肤再生。
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