胃粘膜损伤相关生物标志物、筛选方法及用途
阅读说明：本技术 胃粘膜损伤相关生物标志物、筛选方法及用途 (Gastric mucosa injury related biomarker, screening method and application ) 是由 孙晶 王凤忠 范蓓 佟立涛 刘鹏飞 刘佳妮 卢聪 刘佳萌 孙玉凤 金诺 于 2021-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种胃粘膜损伤相关生物标志物、筛选方法及用途,所述生物标志物,包括γ-L-glutamyl-putrescine、cytosine、thymine、Ckm,Arg1,Ctps2,Pycr3,Cmpk2中的一种或多种。通过检测胃病患者胃组织中γ-L-glutamyl-putrescine、cytosine、thymine、Ckm,Arg1,Ctps2,Pycr3,Cmpk2的表达水平,可以对胃病患者的胃粘膜损伤程度以及修复情况进行判断。本发明公开了胃粘膜损伤生物标志物的筛选方法,公开了生物标志物的用途,为诊断和治疗胃粘膜损伤患者提供理论支撑,实现胃病人群早发现早治疗,具有较大的经济价值和社会效益。(The invention discloses a gastric mucosa injury related biomarker, a screening method and application, wherein the biomarker comprises one or more of gamma-L-glutamyl-putrescine, cytosine, thymine, Ckm, Arg1, Ctps2, Pycr3 and Cmpk 2. By detecting the expression levels of gamma-L-glutamyl-putrescine, cytosine, thymine, Ckm, Arg1, Ctps2, Pycr3 and Cmpk2 in the stomach tissue of a patient with gastric diseases, the degree of damage to the gastric mucosa and the repair condition of the patient with gastric diseases can be judged. The invention discloses a method for screening a gastric mucosa injury biomarker, discloses application of the biomarker, provides theoretical support for diagnosis and treatment of patients with gastric mucosa injury, realizes early discovery and early treatment of gastric disease crowds, and has great economic value and social benefit.)
技术领域
本发明归属于生物
技术领域
，涉及胃粘膜损伤的生物标志物，还涉及胃粘膜损伤的生物标志物的筛选方法，以及胃粘膜损伤的生物标志物的用途。背景技术
随着生活水平的提高，人们的饮食结构发生了翻天覆地的变化。胃粘膜是胃的重要生理屏障，胃粘膜损伤是导致多种胃病的主要因素。吸烟、饮酒、压力和饮食不健康、不规律，都可能会危害到胃粘膜由刺激和防御因素维持的胃粘膜完整性平衡，发生胃溃疡的风险增加以及增加胃癌的发生率。因此在早期诊断出胃粘膜损伤并配合治疗有利于降低胃溃疡和胃癌的风险。
石斛是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）植物，Dendrobium 是由希腊文dendro（树）及 bios（生命）组合而来，有附生于树上之意。《中国植物志》收录我国石斛 74种和 2 变种。石斛味甘，性微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热的功效，用于热病津伤、口干烦渴、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸痨热、目暗不明等症状。现代药理作用有抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤、增强免疫机制和抗胃粘膜损伤等。石斛化学成分复杂，种类繁多，主要包括多糖类、生物碱类、黄酮类、菲类、联苄类、挥发油类、酚酸类、香豆素类、氨基酸及微量元素等。
代谢组学是一门对生物体内所有代谢物进行定量分析，研究生物体在不同状态下机体内代谢物变化的学科。生物体中许多生命过程都是发生在小分子代谢物层面，例如细胞之间信号的释放、能量之间的传递、细胞之间通信识别等均是通过小分子代谢物相互调控而完成的。基于代谢组学层面研究机体受外界扰动刺激后的变化，对于揭示其内在机制具有重要的前瞻性意义通过结合证候研究，以寻找该变化与证候特征的内在联系，从而揭示机体生命活动的代谢本质。本研究基于代谢组学，寻找体内代谢物与胃粘膜损伤之间联系的特征信号及用途。
蛋白质组学是一门通过分析蛋白质的表达、蛋白质结构及蛋白质与蛋白质相互作用，了解细胞或生物体蛋白质组成及变化规律的学科。蛋白质组学主要分为化学蛋白质组学、差异蛋白质组学和定量蛋白质组学。在疾病方面，该组学对阐明肾病、肿瘤、糖尿病、心血管疾病和呼吸系统疾病的发病机制、病程进展、疾病分具有重要意义。在药物方面，蛋白质组学的应用为药物有效成分的筛选以及中药新药的研发提供了新思路。本研究中应用的是差异蛋白质组学，该组学是从整体角度比较在不同状态下体内蛋白质表达前后的动态变化，通过比较不同药物干预、不同剂量药物干预前后生物体的效应相关差异表达蛋白，再进行药效与差异表达蛋白的相关性分析，探索石斛有效成分和胃粘膜靶点蛋白的作用机制。
代谢组学和蛋白质组学联合分析，蛋白质组学能够动态地描述基因调节，代谢组学可以批量获得基因表达的最终产物。因此，将蛋白质组学和代谢组学进行关联分析，对基因表达的蛋白质和代谢物进行定量测定，有助于进一步揭示基因表达调控的内在机制。本研究借助R语言将代谢组学和蛋白质组学结果进行关联分析，构建整体调控网络，最终聚焦到石斛胃粘膜保护关联最密切的通路上。
发明内容
本发明基于代谢物、蛋白质组学的重要作用，研究与胃粘膜损伤相关的生物标志物，尤其是石斛预防胃粘膜损伤相关的生物标志物。
本发明另一个目的是提供胃粘膜损伤相关的生物标志物的筛选方法。
本发明再有一个目的是提供胃粘膜损伤相关的生物标志物的用途。
为此，本发明提供的技术方案为：
胃粘膜损伤的生物标志物，所述生物标志物包括γ-L-glutamyl-putrescine、cytosine、thymine、Ckm、Arg1、Ctps2、Pycr3、Cmpk2等。
优选的是，所述的胃粘膜损伤的生物标志物中，所述γ-L-glutamyl-putrescine、cytosine、thymine、Ckm、Arg1、Ctps2、Pycr3、Cmpk2的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：步骤一、收集样品：收集石斛干预动物后10天，取胃组织和血清样本；步骤二、利用试剂盒测定血清中NF-kB、MDA、5-HT、PGE2、No的含量，评估石斛的作用效果；步骤三、取胃组织进行HE染色，做病理组织切片评估石斛的作用效果；步骤四、采用UHPLC -Q Exactive-MS采集小鼠胃组织代谢物和蛋白质信息，基于非靶向代谢组学和蛋白质组学方法系统筛选并分析石斛预防胃粘膜损伤的差异生物标志物及其代谢通路和调控网络。
优选的是，所述的胃粘膜损伤的生物标志物的筛选方法中，所述动物为小鼠。
优选的是，所述的胃粘膜损伤的生物标志物的筛选方法中，步骤一中，为进行实验，对空白组动物采用灌胃0.9%NaCl无菌液，对模型组动物采用灌胃0.9% NaCl无菌液和腹腔注射80 mg/kg的环磷酰胺溶液。
优选的是，所述的胃粘膜损伤的生物标志物的筛选方法中，步骤一中，取胃组织的详细步骤：在喂养的第11天，摘除胃组织，沿胃大弯剖开，用冰生理盐水清洗胃粘膜，留样。
所述的生物标志物在科学和医学研究领域中有确诊胃粘膜损伤的用途。
本发明的一个方面是，提供一种胃粘膜损伤相关生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、收集样品：建立胃黏膜损伤小鼠模型，进行石斛干预，石斛灌胃小鼠10天后，收集胃粘膜损伤模型组、空白组、石斛给药组和阳性药组的血清和胃组织样本；
步骤二、利用试剂盒测定血清中炎症因子的含量，评估石斛的作用效果；
步骤三、取胃组织进行HE染色，做病理组织切片评估石斛的作用效果；
步骤四、利用UHPLC -Q Exactive-MS测定不同组别小鼠胃组织的代谢物和蛋白质，基于非靶向代谢组学和蛋白质组学方法系统筛选并分析胃粘膜损伤的差异生物标志物及其代谢通路和调控网络，其中所述差异生物标志物即为胃粘膜损伤相关生物标志物。
优选的，炎症因子包括NF-kB、MDA、5-HT、PGE2、No；优选的，病理组织切片包括空白组、模型组、石斛给药组和阳性药组。
优选的，步骤二中试剂盒为ELISA试剂盒。
优选的，石斛为石斛提取物，阳性药为CTX。
优选的，生物标志物包括γ-L-glutamyl-putrescine、cytosine、thymine、Ckm,Arg1, Ctps2, Pycr3, Cmpk2中的一种或多种。
本发明的一个方面是，提供的生物标志物用于制备诊断和/或评估胃病患者胃粘膜损伤程度的试剂中的应用。
优选的，用于诊断和/或评估石斛预防或治疗胃病患者胃粘膜的损伤程度。
本发明的另一个方面是，本发明中的生物标志物用于制备预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物中的应用。
本发明的另一个方面是，本发明中的生物标志物作为胃粘膜损伤的特异性分子靶标，在筛选预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物中的应用。
优选的，上述预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物为石斛类药物。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明首次公开了基于病理组织学和细胞因子系统评价环磷酰胺对胃粘膜的损伤作用，并在此基础上利用非靶向代谢组学和蛋白质组学联合分析技术筛选了石斛预防胃粘膜损伤的生物标志物，进一步明确了其代谢通路和调控网络，从整体水平全面、高效、系统评价了石斛预防胃粘膜损伤的作用。该发明为诊断胃粘膜损伤提供了相关参照数据，为系统评价石斛预防胃粘膜损伤作用和开发具有胃粘膜保护作用的石斛产品提供了理论支撑。
附图说明
图1为本发明中空白组、模型组、石斛组、阳性药组小鼠胃组织HE染色组织病理切片结果图；（A）空白组，（B）模型组，（C）阳性药组，（D）石斛组；（a）上皮细胞损失；（b）炎性细胞渗透；（c）腺体结构紊乱；（d）胃黏膜出血。
图2为本发明中空白组、模型组、石斛组、阳性药组小鼠血浆中MDA、NO、 PGE2、NF-κB、5-HT含量图。
图3 为空白组、模型组、石斛组、阳性药组小鼠胃组织代谢物总离子流图；（A）空白组，（B）模型组，（C）阳性药组，（D）石斛组。
图4为空白组、模型组、石斛组、阳性药组小鼠胃组织代谢物主成分分析得分图。
图5 为空白组、模型组、石斛组、阳性药组小鼠胃组织代谢物OPLS-DA得分图和s-plot图。
图6 为代谢通路图；图中方框表示基因产物，圆圈表示代谢物；Ckm，EC 2.7.3.2；Argl，EC 3.5.3.1；Ctps2，EC 6.3.4.2为下调蛋白，Pycr3，EC 1.5.1.2；Cmpk2，EC 2.7.4.14为上调蛋白；γ-L-Glutamyl-putrescine、Cytosine、Thymine为下调代谢物。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式加以说明。
实施例1
1、建立胃黏膜损伤小鼠模型，进行石斛提取物干预。取昆明小鼠（18+2g）40只，分空白组、模型组、石斛组、阳性药组各10只。空白组：取0.9% NaCl 无菌液0.18ml灌胃10 d。模型组：取0.9% NaCl无菌液0.18ml灌胃10天，在第4 d、第6 d、第8 d腹腔注射化疗药CTX80 mg/kg。石斛组：取石斛提取物+ CMCNa混悬液400 mg/kg灌胃10 d，在第4 d、第6 d、第8d腹腔注射化疗药CTX 80 mg/kg。阳性给药组：取奥美拉唑4 mg/kg 灌胃10 d，在第4 d、第6d、第8 d腹腔注射化疗药CTX 80 mg/kg。10天后，采集胃组织和血清样本。
2、病理组织学分析：采样后将各组胃粘膜病变的标本固定在10%甲醛溶液中，参照相关文献的方法，进行病理切片包埋和染色，用200倍光学显微镜观察，并用成像系统对胃粘膜的病理变化进行成像，具体如图1所示。
从图1可以看出，空白组胃粘膜具有正常的腺体结构。模型组存在炎性细胞渗透，上皮细胞损失，腺体结构紊乱，胃黏膜出血。以上说明环磷酰胺对胃组织粘膜有损伤作用，并且模型组造模成功。但与模型组相比C组阳性药组、D组石斛组腺体结构和上皮细胞基本恢复正常，无明显胃黏膜出血和炎性细胞渗透，胃黏膜损伤状态均有减轻。
3、细胞因子测定：将血清样本加入PBS至PH为7.4后将样本匀浆充分，以3000 r/min转速离心20分钟后收集上清液。按照ELISA试剂盒（均购自北京绿源伯德生物科技有限公司）说明书操作。细胞因子测定实验结果如图2所示，模型组的MDA、NF-kB、5-HT较空白组相比呈现显著升高的趋势；模型组中的NO、PGE2低于空白组。NO是胃粘膜保护因子之一，PGE2是胃粘膜防御屏障中的重要因子之一，两种因子皆在模型组中减少，说明模型组的胃粘膜失去了保护屏障，遭到损伤。与模型组相比，阳性药组和石斛组中MDA、NF-κB和5-HT含量显著降低，且变化趋势一致；与模型组相比，阳性药组和石斛组中NO、PGE2含量显著升高，且变化趋势一致。
4、代谢组学：建立UHPLC -Q Exactive-MS分析方法，将小鼠胃组织样品分为空白组（Control）、模型损伤组（Model）、阳性药组（OPZ)、石斛组（DF）、质控组（QC)（质控组为将4个组的样本等量混合）。色谱条件为：色谱柱：BEH C18 柱(100 mm × 2.1 mm i.d., 1.7 μm; Waters, Milford,USA)；流动相A：水(含 0.1%甲酸)，流动相B：乙腈/异丙醇(1/1)(含0.1%甲酸)；流速为 0.40 mL/min，进样量为 2 μL，柱温为 40°C。
洗脱程序如下：
样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，离子喷雾电压。质谱条件具体参数见下表：
数据预处理：将原始数据导入Progenesis QI 2.3软件进行峰对齐、归一化等处理，用天然产物数据库、HMDB数据库等鉴定，结合PCA 、OPLS-DA、T检验、变异倍数分析、R语言等多元统计分析手段，筛选差异代谢物。其中，小鼠胃组织代谢物总离子流如图3所示，小鼠胃组织代谢物主成分分析得分图如图4所示，小鼠胃组织代谢物OPLS-DA得分图和s-plot图如图5所示。从图中可以看出空白组和模型组数据分布在两个不同的区域，说明环磷酰胺诱导的小鼠造模成功，石斛干预后有明显的效果。
多元统计分析及差异代谢物的筛选；将预处理的数据采用T检验结合多元分析等方法，筛选出同时满足VIP>1，P<0.05的代谢物为差异代谢物。通过对比HMDB等数据库，将同时满足VIP>1，p value<0.05的代谢物确定为差异代谢物。共鉴定74种代谢物。其中CTX模型组变化趋势是与正常组相比较，揭示了与胃黏膜损伤疾病有关的代谢物。DF组的变化趋势是与CTX模型组相比较，揭示了与石斛胃黏膜保护相关的代谢物。这74种代谢物在空白组与CTX模型组、模型组与石斛组之间同时变化，并且变化趋势相反。
5、蛋白质组学：
小鼠胃组织蛋白质的提取、纯化和定量。取小鼠胃组织样本，每组随机选取5个样本进行蛋白质组学研究，液氮研磨成粉末，装入离心管中。加入适量蛋白裂解液，涡旋混匀后冰上裂解30 min（每5 min混匀一次），冰上超声2 min，再于4°C、12000r离心20min，收集蛋白上清液。取牛血清白蛋白（BSA）0、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，每个孔加尿素裂解液补足到20 μL，相当于标准品浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，每2μL各样品加入18μL水，加入200ulBCA工作液混匀，于37°C反应30分钟，用酶标仪读取562nm吸光度，制作标准曲线。
多肽样品的制备：取组检测样品的蛋白溶液各100μg，参考（王嵘晔 等, 2018）的方法进行多肽样品的制备，于37°C反应过夜。
谱图库的建立：将已酶解好的多肽样品取等量混合后真空离心浓缩至干，用缓冲液复溶，利用超高效液相（Thermo Scientific Vanquish Flex ）进行分析。色谱条件为：色谱柱，（ACQUITY UPLC BEH C18 Column 1.7 μm， 2.1 mm × 150 mm）；流动相A相为2%乙腈（氨水调至 pH10），B相为80%乙腈（氨水调至 pH10）；洗脱梯度，0-16 min，0%B;16-17min，0-3.8%B；17-34 min，3.8-24%B；34-37min，24-30%B；37-38 min，30-43%B；38-39 min，43-100%B；39-44 min，100-0%B；44-47，0%B；流速为200 μL/min。
根据峰型和保留时间共收取 20 个流分，每个流分真空离心浓缩至干后，用缓冲液溶解，按比例添加10×iRT肽段并混匀进行第二维的质谱分析。色谱条件为：C18色谱柱（75μm×25cm ， Thermo ，USA）；流动相A相为2%ACN-0.1%甲酸，B相为80%ACN-0.1%甲酸，洗脱条件为0-1 min，0-6%B；1-63 min，6-23%B；63-77 min，23-29%B；77-8 6min，29-38%B；86-88 min，38-48%B；88-89 min，48-100%B；89-95 min，100%B；95-96min，100-0%B；96-120min，0%B。流速为300 nL/min。质谱条件为：MS扫描范围为m/z 350-1300。采集模式为DDA模式，二级碎裂选取母离子信号Top 20。使用ProteomeDiscovererTM Software 2.4进行数据库搜索。
个体样品SWATH质谱检测：建库完成之后，将肽段脱盐定量后以同样的梯度条件进行个体样品 SWATH 质谱检测，用质谱上样缓冲液溶解等量的肽段，按比例添加 10×iRT肽段并混匀后进行SWATH检测分析。
数据分析：采用ProteomeDiscovererTM Software 2.4 对分级建库数据进行搜索并建立数字化谱图库作为后续SWATH定量分析的定性依据，将谱图库导入SpectronautTM对SWATH原始数据进行子离子峰提取，iRT校正保留时间，每个蛋白选择6个肽段及每个肽段选择3个子离子进行定量分析，Protein FDR≤0.01，Peptide FDR≤0.01，PeptideConfidence ≥99%，XIC width≤75ppm，排除共享肽段及修饰肽段，计算峰面积加合得出定量结果。iRT非线性矫正大多数数据点均匀分布在拟合曲线上。将鉴定到的蛋白定量结果用总峰面积比值进行归一化后用于差异蛋白筛选及统计。本实验中，将p<0.05，FC<0.67或FC>1.50的蛋白质筛选为目标差异蛋白质。
通过小鼠胃组织蛋白质的提取、纯化和定量，多肽样品的制备、谱图库建立，样品SWATH质谱检测，共鉴定107种差异蛋白质。模型组的变化趋势是与正常组作比较，揭示了与胃黏膜损伤疾病有关的靶点蛋白；DF组的变化趋势是与CTX模型组作比较，揭示了石斛提取物胃黏膜保护作用有关的靶点蛋白。这107种差异蛋白质同时在CTX模型组和正常组、CTX模型组和DF组呈现相反的变化趋势。
6、代谢组学和蛋白质组学联合分析：
使用KEGG数据库注释，对KEGG通路可视化分析，分别将蛋白组学得到的差异蛋白与代谢组学得到的差异代谢物同时MAP到一张KEGG通路图片里，直观全面的对通路数据进行整合。将参与同一代谢通路的蛋白与代谢物进行标注，可视化KEGG通路。最终将主要代谢通路上的差异代谢物和差异蛋白作为生物标志物。经分析，差异蛋白和差异代谢物名称、变化倍率、对应代谢通路数据如表1所示，代谢通路图如图6所示。
从表1中可以看出，石斛胃黏膜保护和CTX诱导胃黏膜损伤最为相关的代谢途径包括肌酸途径、精氨酸和脯氨酸代谢、嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢。其中3种差异蛋白Ckm、Arg1、Ctps2和3种差异代谢物γ-L-Glutamyl-putrescine、Cytosine、Thymine在石斛组下调并且在模型组上调；与之相反， 2种差异蛋白Pycr3和Cmpk2在DF组上调并且在模型组下调。
由此可见，γ-L-glutamyl-putrescine、cytosine、thymine、Ckm, Arg1, Ctps2,Pycr3, Cmpk2为胃粘膜损伤的差异性生物标志物，其可作为胃粘膜损伤的特异性分子靶标，应用于胃粘膜损伤的诊断和评估，以及胃粘膜损伤疾病的预防和治疗。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但是本发明不限于上述实施例，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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