一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法
阅读说明：本技术 一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法 (Efficient ultralow-temperature cryopreservation method for spring fish sperms ) 是由 胡鹏 吕云云 刘德 周晓莉 胡燕 谢尚君 于 2021-03-01 设计创作，主要内容包括：本发明属生物技术领域,具体地说是一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法。将泉水鱼的精液与抗冻液按体积比1:30的比例混合,混合后经过三步程序降温处理,最终投入到液氮(-196℃),分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成。本发明获得的冻精对于泉水鱼人工繁育、种质保存、遗传多样性保护及可持续养殖等方面有着重要意义。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a spring fish sperm efficient ultralow temperature cryopreservation method. Mixing the sperm of the spring fish with the anti-freezing liquid according to the volume ratio of 1:30, cooling through three steps of procedures after mixing, finally putting into liquid nitrogen (-196 ℃), subpackaging and storing; the antifreezing solution consists of diluent, antifreezing agent and additive. The frozen semen obtained by the invention has important significance for artificial breeding, germplasm preservation, genetic diversity protection, sustainable culture and the like of the spring fish.)
技术领域
本发明属生物技术领域，具体地说是一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法。
技术背景
泉水鱼(Semilabeoprochilus)属鲤形目，鲤科，野鲮亚科，泉水鱼属的一种鱼类。泉水鱼是中国特有的物种。体较长，前部圆，后部稍侧扁，腹前部较平，头的背部成弧形。吻圆钝；口裂略呈三角形，上、下唇在口角处相连，唇上有许多排列整齐的小角质凸起；唇部卷入口腔内，张口时，唇外翻扩展为喇叭形，借此吸附于其它物体上。唇后沟限于口角处。须2对，吻须较长，颌须短小。眼小，位于头侧稍后上方。鳞中等大，腹部鳞较小，且陷藏于皮下。背鳍无硬刺。体背部灰黑色，腹部灰白色，各鳍微黑；体侧鳞片绝大部分都有黑色边缘，从鳃孔之后至胸鳍前黑色的斑块较粗，故此联成一大形黑斑。
泉水鱼栖息于我国南方江河流速较大的水域的中下层，平时喜欢生活于山溪和具流水的岩洞，以及江河有泉源的地方。常以口在江底岩石上刮食附着的动植物及其它有机物质，很少进入地层为污泥的静水水体中，生殖季节游向上游产卵。一般长至重1-1.5公斤始达性成熟。产卵时间约在3-4月，卵产于石缝或石洞中。
泉水鱼分布于长江上游干、支流及珠江水系的西江中上游。泉水鱼是四川、广西、云南常见食用鱼类。生长速度比较慢，常见者大约0.5-1公斤，最大个体大约3.5-4公斤左右。产量也不大，惟其肉质细嫩，肉味十分鲜美，且富含脂肪为食用之珍品。鲜肉供药用。有补益元气、止血的功效。主治泄痢、吐血、崩漏等症，具有较高的营养价值。近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之对泉水鱼种质需求的不断扩大，泉水鱼的精子冷冻技术急需建立起来。鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义：可以使种质的长距离运输得以实现，有利于鱼类的杂交、选育以及基因多样性的保护。随着我国经济的飞速发展及海水污染的日益加剧，重要淡水养殖优良品种种质保存已成为我国淡水养殖业中亟待解决的问题。建立泉水鱼精子的超低温冷冻技术，无论是对其遗传多样性的保护，还是开展生物技术育种以及淡水养殖业的可持续发展，都有着迫切的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
将泉水鱼的精液与抗冻液按体积比1:30的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由NaCl、KCl、CaCl2·6H2O、NaHCO3、葡萄糖和果糖组成，抗冻剂为30％(V/V)甲醇，添加剂是15％(V/V)蜂蜜。
所述稀释液由NaCl、KCl、CaCl2·6H2O、葡萄糖和果糖组成：制备方法为取NaCl1.5g，KCl 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaHCO30.1g，葡萄糖8.5g，果糖3.0g，溶于800mL双蒸水，热压消毒，冷却，定容至1000mL，即成稀释液。
所述抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为30％甲醇(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
将新鲜的泉水鱼精液与抗冻液按照1:30的体积比混合均匀，移液枪吸取2mL混合液加入到2.5mL的冻存管中。
用移液枪吸取300μL新鲜蜂蜜加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷5min。
将分装后的精液采用三步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-40℃区间，-5℃/min；-40～-70℃区间，-10℃/min；-70～-130℃区间，-20℃/min。
将分装保存于液氮中的泉水鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，空气中停留3-5秒，然后迅速将冻存管放入25℃恒温水浴锅中水浴解冻，轻轻晃动至只剩一点冰核时取出。
吸取精液，在生理盐水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标，随机取3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子的比例，经检测解冻后精子运动率与鲜精差异不显著，90％以上的解冻后精子做快速的直线运动。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
一、本发明冷冻保存过程中采用甲醇作抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；
二、本发明冷冻保存过程中采用2.5mL冻存管，容积较大，保存精液量大；
三、降温前将抗冻保护剂与稀释液混合，制成混合液，并置于4℃冰箱备用，节省了时间，操作简便易行；
四、将新鲜的泉水鱼精液按照1:30的体积比混合均匀，移液枪吸取2mL混合液加入到2.5mL的冻存管中，用移液枪吸取300μL新鲜蜂蜜加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷5min。，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷15min，使抗冻保护剂充分渗入细胞中，使抗冻剂充分渗入细胞中起保护作用，具有重要生产意义。
五、本发明冷冻保存过程分段降温时，将分装后的精液采用三步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-40℃区间，-5℃/min，-40～-70℃区间，-10℃/min，-70～-130℃区间，-20℃/min。后直接投入到液氮中长期保存至激活，适宜的降温速度是精子可以充分脱水同时又可使冷冻精子安全度过“危险温度区”的关键，整个保存过程时间较短；冷冻保存降温程序简便易操作，重复性稳定性好，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于90％，与鲜精活力差异不显著；
六、本发明冷冻精子从液氮中取出后，空气中停留3-5秒，然后迅速将冻存管放入25℃恒温水浴锅中水浴解冻，轻轻晃动至只剩一点冰核时取出，既可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的精子结构损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)2020年03月，自长江上游捕获精巢发育良好的泉水鱼活体雄鱼20条，体重每条2.5kg-3.0kg，用手轻轻挤压腹部有精液流出。将其置于干燥纱布上，蒸馏水冲洗生殖孔三次至无尿液、黏液残留，干净卫生纸擦净，轻轻在腹部沿鱼头至鱼尾方向挤压，将未经污染的精液收集在50mL离心管中。用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测精子运动率，选择运动率高于90％的样品进行冷冻保存。
(2)将泉水鱼的精液与抗冻液按体积比1:30的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由NaCl、KCl、CaCl2·6H2O、NaHCO3、葡萄糖和果糖组成，抗冻剂为30％(V/V)甲醇，添加剂是15％(V/V)蜂蜜。稀释液由NaCl、KCl、CaCl2·6H2O、葡萄糖和果糖组成：制备方法为取NaCl1.5g，KCl 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaHCO30.1g，葡萄糖8.5g，果糖3.0g，溶于800mL双蒸水，热压消毒，冷却，定容至1000mL，即成稀释液。抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为30％甲醇(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
(3)将新鲜的泉水鱼精液与抗冻液按照1:30的体积比混合均匀，移液枪吸取2mL混合液加入到2.5mL的冻存管中。用移液枪吸取300μL新鲜蜂蜜加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷5min。
(4)将分装后的精液采用三步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-40℃区间，-5℃/min，-40～-70℃区间，-10℃/min，-70～-130℃区间，-20℃/min。
(5)将分装保存于液氮中的泉水鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，空气中停留3-5秒，然后迅速将冻存管放入25℃恒温水浴锅中水浴解冻，轻轻晃动至只剩一点冰核时取出。
(6)吸取精液，在生理盐水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。激活后用显微镜检测冻精运动率＞90％，接近鲜精水平。
实施例2
(1)2019年3-4月份正值泉水鱼生殖期，于四川省内江川西泉水鱼养殖基地，泉水鱼亲鱼养殖车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得鲜精。共采集泉水鱼40余尾，共计鲜精80mL，显微镜检测活力高于80％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存；
(2)将泉水鱼的精液与抗冻液按体积比1:30的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由NaCl、KCl、CaCl2·6H2O、NaHCO3、葡萄糖和果糖组成，抗冻剂为30％(V/V)甲醇，添加剂是15％(V/V)蜂蜜。稀释液由NaCl、KCl、CaCl2·6H2O、葡萄糖和果糖组成：制备方法为取NaCl1.5g，KCl 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaHCO30.1g，葡萄糖8.5g，果糖3.0g，溶于800mL双蒸水，热压消毒，冷却，定容至1000mL，即成稀释液。抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为30％甲醇(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
(3)将新鲜的泉水鱼精液与抗冻液按照1:30的体积比混合均匀，移液枪吸取2mL混合液加入到2.5mL的冻存管中。用移液枪吸取300μL新鲜蜂蜜加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷5min。
(4)将分装后的精液采用三步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-40℃区间，-5℃/min；-40～-70℃区间，-10℃/min；-70～-130℃区间，-20℃/min。
(5)将分装保存于液氮中的泉水鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，空气中停留3-5秒，然后迅速将冻存管放入25℃恒温水浴锅中水浴解冻，轻轻晃动至只剩一点冰核时取出。
(6)吸取精液，在生理盐水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。激活后用显微镜检测冻精运动率＞90％，接近鲜精水平。
(7)将冻精用于人工授精，受精率、孵化率均在80％以上，苗种成活率与鲜精无显著差异。
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