苯并咪唑衍生物的晶型及制备方法
阅读说明：本技术 苯并咪唑衍生物的晶型及制备方法 (Crystal form of benzimidazole derivative and preparation method thereof ) 是由 叶景泉 周先强 邵启云 冯君 贺峰 于 2020-10-26 设计创作，主要内容包括：本公开涉及苯并咪唑衍生物的晶型及制备方法。具体地,本公开涉及式I化合物的A晶型以及其制备方法。本公开涉及的式I化合物的A晶型稳定性、吸湿性方面具有优势,更适合于药物开发,能够满足生产运输储存的药用要求,生产工艺稳定、可重复可控,能够适应于工业化生产。(The present disclosure relates to crystalline forms of benzimidazole derivatives and methods of preparation. In particular, the disclosure relates to form a of the compound of formula I and methods of making the same. The A crystal form of the compound of the formula I has advantages in stability and hygroscopicity, is more suitable for drug development, can meet the medicinal requirements of production, transportation and storage, has stable production process, can be repeatedly controlled, and can be suitable for industrial production.)
技术领域
本公开属于药物化学领域，涉及一种苯并咪唑衍生物的晶型，具体的，涉及式I化合物的A晶型，以及其制备方法。
背景技术
核受体是配体调节的转录因子，其调节发育、免疫和细胞代谢，是人类疾病的主要药物靶标类别之一。类视黄醇相关的孤儿受体γ(RORγ)蛋白是核受体的NR1亚家族的成员，并且具有典型的核受体结构域结构，由DNA结合结构域、配体结合域、铰链结构域和激活功能2结构域组成(Benoit G，等，Pharmacological Reviews，58(4)：798-836,2006；Zhang，Y.，et al.，Acta Pharmacogica Sinica，36：71-87,2015)。与大多数其他作为二聚体结合的核受体相反，RORγ识别并作为单体结合。它与特定的DNA序列结合，通常由TAAA/TNTAGGTCA组成，称为ROR反应元件(RORE)。
有两种亚型的RORγ，RORγ1和RORγ2(也被称为RORγt)，它们是由相同的RORC基因产生的，可能是通过选择其它启动子而产生的(Villey I等，Eur.J.Immunol.，29(12)：4072-80，1999年)。因为RORγ两个亚型(RORγ1和RORγt)由相同的mRNA产生，具有相同的配体结合域，仅仅它们蛋白N-末端不同(Jetten,A.M.,2009；Ivanov,I.I.et al.,2006)。小分子抑制剂结合在配体结合域，抑制受体的功能，因此对RORγ两个亚型无法达到有选择性，均称RORγ小分子抑制剂(或调控剂)，不分亚型。
RORγ这两种亚型组织表达分布十分不同。RORγt主要在胸腺以及几种免疫细胞中表达，而RORγ1则在许多组织表达，比如，胸腺,肝脏，肌肉，睾丸，胰腺、前列腺、心脏等等组织(Jetten,A.M.,2009；Zhang,Y.et al.,2015)。文献报告RORγ1的功能之一是调节人生物钟，参与昼夜节律的调节(Jetten,A.M.,2009)。17型辅助性免疫调节T细胞(TH17)是引起自身免疫疾病的主要根源(Ivanov,I.I.et al.,2006)，RORγ两个亚型均在Th17细胞里表达，调节17型辅助性免疫调节T细胞分化和诱导基因转录(Ruan，Q.,et al.，2011)。细胞因子IL-6和TGF-β诱导未分化CD4 T辅助细胞分化成Th17细胞，Th17细胞表达高水平的RORγt，诱导未分化CD4 T辅助细胞中IL-23受体基因转录，IL23受体又促进和稳定TH17细胞的生成，形成正反馈回路的一部分(Ivanov,I.I.et al.,2006；Jetten,A.M.,2009)。同时RORγt能够诱导细胞因子IL-17A,IL-17F,IL-21，IL-22等促炎效应细胞因子的基因转录，增强炎症过程。与RORγt相似，RORγ1也在Th17细胞里有一些表达，也可以调节17型辅助性免疫调节T细胞(TH17)分化和诱导基因转录(Ruan，Q.,et al.，2011)。RORγ的药理学拮抗对自身免疫性疾病具有治疗潜力，使其成为一个有吸引力小分子抑制剂的靶点。
RORγ已被确定为几种疾病发病机制中的关键介质，如类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症、炎症性肠病、克罗恩病、干燥综合症和哮喘等。(Louten等，J.AllergyClin.Immunol.，123：1004-1011，(2009)；Annuziato，F.，et al，Nat.Rev.Rheumatol.，5(6)：325-331,2009；Lizuka，M.，et al.，J.Immunol.，194：56-67,2014)。一些其他疾病，例如慢性干眼症、川崎病、粘膜利什曼病和桥本氏甲状腺炎，其特征在于Th17比例增加和/或Th17标志细胞因子水平升高，例如IL-17、IL-22和IL-23。(Chen，Y.等，Mucosal.Immunol.，7(1)：38-45,2014；Jia，S.，et al.，Clin.Exp.Immunol.，162：131-137,2010；Boaventura，VS等，Eur.J.Immunol.，40：2830-2836,2010；Figueroa-Vega，N.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，95：953-62,2010)。在上述每个例子中，均可以通过同时抑制RORα来增强抑制作用。RORγt抑制剂目前正在开发用于治疗自身免疫疾病，例如牛皮癣和类风湿性关节炎。见Jun R.Huh和Dan R.Littman，Eur.J.Immunol.，42(9)：2232-2237(2012)、WO2012/027965、WO2013/029338和US2015/291607。
申请号为PCT/US19/30526的申请中提供了式I化合物：
该申请的全部内容并入本文。
药用活性成分的晶型结构往往影响到药物的化学稳定性，结晶条件及储存条件的不同有可能导致化合物的晶型结构的变化，有时还会伴随着产生其他形态的晶型。一般来说，无定型的药物产品没有规则的晶型结构，往往具有其它缺陷，比如产物稳定性较差，析晶较细，过滤较难，易结块，流动性差等。因此，改善上述产物的各方面性质是很有必要的，我们需要深入研究找到晶型纯度较高并且具备良好物化稳定性的晶型。
发明内容
本公开提供式I化合物的A晶型。
本公开提供式I化合物的A晶型，其X-射线粉末衍射图谱，在衍射角2θ为11.827、13.183、14.339、15.441、16.495、18.100、18.365、19.858处有特征峰。
进一步的，所述A晶型的X-射线粉末衍射图谱，在衍射角2θ为11.827、13.183、14.339、15.441、16.495、18.100、18.365、19.858、20.958、21.204、22.465、23.721、24.536处有特征峰。
进一步的，所述A晶型的X-射线粉末衍射图谱，在衍射角2θ为11.827、13.183、14.339、15.441、16.495、17.461、18.100、18.365、19.270、19.858、20.958、21.204、22.003、22.465、22.968、23.721、24.536、25.978、26.653、28.387、28.818、29.641、30.986、32.785处有特征峰。
本公开还涉及式I化合物的A晶型的制备方法，包括式I化合物用选自烃类溶剂、醚类溶剂、醇类溶剂、酯类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂、卤代烃类溶剂、含氮溶剂、水、二甲基亚砜的一种或者多种做溶剂，析出晶体的步骤。
本公开还涉及式I化合物的A晶型的制备方法，包括：取一定量的式I化合物，加入适量溶剂，析出固体，过滤、干燥，得到式I化合物的A晶型。在某些实施方案中，本公开所述式I化合物的A晶型的制备过程中所用溶剂选自烃类溶剂、醚类溶剂、醇类溶剂、酯类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂、卤代烃类溶剂、含氮溶剂、水、二甲基亚砜的一种或者多种。
所述烃类溶剂包括但不限于正己烷、正庚烷、对二甲苯；所述醚类溶剂包括但不限于乙醚、丙二醇甲醚、甲基叔丁基醚、异丙醚或1,4-二氧六环；所述醇类溶包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、异戊醇或三氟乙醇；所述酯类溶剂包括但不限于乙酸乙酯、乙酸异丙酯或乙酸丁酯；所述酮类溶剂包括但不限于丙酮、苯乙酮、4-甲基-2-戊酮；所述腈类溶剂包括但不限于乙腈、丙腈；所述卤代烃类溶剂包括但不限于氯甲烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述含氮溶剂包括但不限于硝基甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺。
在一些实施方案中，A晶型的制备中所用的溶剂选自异丙醇/异丙醚混合溶剂、乙酸异丙酯/正己烷混合溶剂、异丙醇/水混合溶剂、甲基叔丁基醚/异丙醇混合溶剂、乙腈、异丙醚/乙醇混合溶剂、甲基叔丁基醚、甲苯、异丙醇/正己烷混合溶剂或乙酸乙酯/正己烷混合溶剂。
本公开所述式I化合物的A晶型的析晶方式，选自室温析晶、冷却析晶、挥发析晶或加入晶种诱导析晶。
本公开还涉及式I化合物的A晶型的制备方法，包括：取一定量的式I化合物，加入适量异丙醇/异丙醚混合溶剂、乙酸异丙酯/正己烷混合溶剂、异丙醇/水混合溶剂、甲基叔丁基醚/异丙醇混合溶剂、乙腈、异丙醚/乙醇混合溶剂、甲基叔丁基醚、甲苯、异丙醇/正己烷混合溶剂或乙酸乙酯/正己烷混合溶剂，析出固体、过滤、干燥，得到式I化合物的A晶型。
本公开还涉及式I化合物的A晶型的制备方法，包括：取一定量的式I化合物，加入适量甲基叔丁基醚、甲苯、异丙醇/正己烷混合溶剂或乙酸乙酯/正己烷混合溶剂或者异丙醇/水混合溶剂，室温打浆(优选48h)，过滤、干燥，得到式I化合物的A晶型。
本公开还涉及式I化合物的A晶型的制备方法，包括：取一定量的式I化合物，加入适量异丙醇/异丙醚混合溶剂、乙酸异丙酯/正己烷混合溶剂、异丙醇/水混合溶剂、甲基叔丁基醚/异丙醇混合溶剂、乙腈或者异丙醚/乙醇混合溶剂，加热搅拌溶清，室温搅拌12-24h，优选16-20h，析出固体、过滤、干燥，得到式I化合物的A晶型。
本公开还涉及包括式I化合物A晶型和任选的一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物。所述药物组合物可以制成药学上可接受的任一剂型。例如，本公开所述包含式I化合物A晶型的药物制剂可以配制为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂(该制剂为利用本公开所述式I化合物A晶型制备得到或者注射剂本身包含本公开所述的式I化合物A晶型，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、栓剂、吸入剂或喷雾剂。
此外，本公开所述药物组合物还可以以任何合适的给药方式，例如口服、肠胃外、直肠、经肺或局部给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。当用于口服给药时，所述药物组合物可制成口服制剂，例如口服固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；或，口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。当制成口服制剂时，所述药物制剂还可包含适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。当用于肠胃外给药时，所述药物制剂可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。当制成注射剂时，所述药物组合物可采用现有制药领域中的常规方法来进行生产。当配制注射剂时，所述药物制剂中可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。当用于直肠给药时，所述药物制剂可制成栓剂等。用于经肺给药时，所述药物制剂可制成吸入剂或喷雾剂等。在某些实施方案中，本公开式I化合物的A晶型以治疗和/或预防有效量存在于药物组合物或药物中。在某些实施方案中，本公开所述式I化合物的A晶型以单位剂量的形式存在于药物组合物或药物中。
本公开进一步涉及一种药物组合物，其是由式I化合物的A晶型与至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂制备得到的。
本公开进一步涉及一种制备药物组合物的方法，包括使本公开的式I化合物的A晶型与至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
本公开进一步涉及所述式I化合物的A晶型在制备用于治疗RORγ介导的疾病或病症的药物中的用途。所述的RORγ介导的疾病或病症包括但不限于炎症和自身免疫疾病和癌症，其中炎症和自身免疫疾病包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、银屑病关节炎、骨关节炎、区域性脓性、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、自身免疫性糖尿病、I型糖尿病、自身免疫性眼病、自身免疫性甲状腺疾病、I型免疫性多分泌综合征、II型自身免疫性多内分泌综合征、多发性硬化症、炎症性肠病、炎症性肠综合征、幼年特发性关节炎、综合征、克罗恩病、哮喘、川崎病、桥本氏甲状腺炎、传染病、强直性脊柱炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺部疾病、肾小球肾炎、心肌炎、甲状腺炎、干眼症、葡萄膜炎、Behcet病、哮喘、特应性皮炎、接触性皮炎、等移植物排斥反应、多发性肌炎、GVHD、痤疮、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、支气管炎、皮肌炎和过敏性鼻炎；其中癌症包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、滑膜肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胃癌、直肠癌、胰腺癌、脑癌、皮肤癌、口腔癌、前列腺癌、骨癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、输卵管肿瘤、卵巢肿瘤、腹膜肿瘤、黑色素瘤、实体瘤、胶质瘤、神经胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳突肾肿瘤、头颈肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和非小细胞肺癌。
发明详述
在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本公开，下面提供了部分相关术语的定义和解释。另外，当本申请所提供的术语的定义和解释与本领域技术人员所通常理解的含义不一致时，以本申请所提供的术语的定义和解释为准。
本公开所述的“醚类溶剂”包括但不限于：四氢呋喃、乙醚、丙二醇甲醚、甲基叔丁基醚、异丙醚或1,4-二氧六环。
本公开所述的“醇类溶剂”具体实例包括但不限于：甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、异戊醇或三氟乙醇。
本公开所述的“酯类溶剂”包括但不限于：乙酸乙酯、乙酸异丙酯或乙酸丁酯。
本公开所述的“酮类溶剂”具体实例包括但不限于：丙酮、苯乙酮、4-甲基-2-戊酮。
本公开所述的“腈类溶剂”具体实例包括但不限于：乙腈或丙腈。
本公开所述的“卤代烃类溶剂”具体实例包括但不限于：氯甲烷、二氯甲烷、氯仿或四氯化碳。
本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是经Cu-Kα射线衍射得到。
本公开所述的“差示扫描量热分析或DSC”是指在样品升温或恒温过程中，测量样品与参考物之间的温度差、热流差，以表征所有与热效应有关的物理变化和化学变化，得到样品的相变信息。
本公开所述的“2θ或2θ角度”是指衍射角，θ为布拉格角，单位为°或度，所述2θ的误差范围可以是±0.3、±0.2或±0.1。
发明的有益效果
本公开提供的式I化合物的A晶型稳定性、吸湿性方面具有优势，更适合于药物开发，能够满足生产运输储存的药用要求，生产工艺稳定、可重复可控，能够适应于工业化生产。
附图说明
图1为式I化合物无定型物的XRPD图；
图2为式I化合物A晶型的XRPD图；
图3为式I化合物A晶型的DSC谱图；
图4为式I化合物A晶型的TGA谱图；
图5为式I化合物A晶型的DVS吸湿谱图；
图6为式I化合物A晶型的DVS检测前后XRPD对比图；
具体实施方式
以下将结合实施例更详细地解释本公开，本公开的实施例仅用于说明本公开的技术方案，本公开的实质和范围并不局限于此。
以下将结合实施例更详细地解释本公开，本公开的实施例仅用于说明本公开的技术方案，并非限定本公开的实质和范围。
实验所用仪器的测试条件：
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
XRPD为X射线粉末衍射检测：测定使用BRUKER D8型X射线衍射仪进行，具体采集信息：Cu阳极(40kV，40mA)，Cu-Kα射线扫描方式：：θ/2θ，扫描范围：10-48°。
DSC为差示扫描量热：测定采用METTLER TOLEDO DSC 3+示差扫描量热仪，升温速率10℃/min，温度具体范围参照相应图谱(多为25-300或25-350℃)，氮气吹扫速度50mL/min。
TGA为热重分析：检测采用METTLER TOLEDO TGA 2型热重分析仪，升温速率10℃/min，温度具体范围参照相应图谱(多为25-300℃)，氮气吹扫速度20mL/min。
DVS为动态水分吸附：采用Surface Measurement Systems advantage 2，在25℃，湿度从50％起，考察湿度范围为0％-95％，步进为10％，判断标准为每个梯度质量变化dM/dT小于0.002，TMAX小于360min，循环两圈。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：正己烷/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
对比例1、式I化合物制备例(申请号为PCT/US19/30526的申请中实施例152,153的制备方法)
3-(6-氯-5-(2-(二氟甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酰胺的制备
第一步 6-氯-2’-(二氟甲氧基)-[1,1’-二苯基]-3,4-二胺的制备
4-溴-5-氯苯-1,2-二胺(1.5g，6.78mmol)、2-(2-(二氟甲氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷(2.2g，8.15mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(620mg)、三叔丁基磷四氟硼酸盐(393mg)、碳酸钠(1.7g，13.7mmol)、1,4-二氧六环(50mL)和水(10mL)混合物去氧，加热到90℃，搅拌反应3小时。反应液减压浓缩，残余物直接加载到ISCO固体柱上，用正己烷/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，得到白色固体产物(1.0g，收率51.9％)，MS(+)ES:285(M+H)+。
第二步 4-((4-氨基-6-氯-2’-(二氯甲氧基)-[1,1’二苯基]-3-基)氨基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-氧代丁酸乙酯的制备
4-((5-氨基-2-氯-2’-(二氯甲氧基)-[1,1’二苯基]-4-基)氨基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-氧代丁酸乙酯的制备
6-氯-2’-(二氟甲氧基)-[1,1’-二苯基]-3,4-二胺(543mg，1.9mmol)、2-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-乙氧基-4-氧代丁酸(500mg，1.47mmol)和DMF(5mL)溶液中加入EDCl(560mg，2.93mmol)，HOBT(447mg，2.93mmol)和DIPEA(380mg，2.94mmol)，反应液室温搅拌2小时。反应液用5g硅胶吸附，加载到硅胶柱，用45％乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，得到4-((4-氨基-6-氯-2’-(二氯甲氧基)-[1,1’二苯基]-3-基)氨基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-氧代丁酸乙酯和4-((5-氨基-2-氯-2’-(二氯甲氧基)-[1,1’二苯基]-4-基)氨基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-氧代丁酸乙酯的混合物为白色固体(600mg，收率：62.3％)MS(ESI):607(M+H)+.
第三步 3-(6-氯-5-(2-(二氟甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酸乙酯的制备
4-((4-氨基-6-氯-2’-(二氯甲氧基)-[1,1’二苯基]-3-基)氨基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-氧代丁酸乙酯和4-((5-氨基-2-氯-2’-(二氯甲氧基)-[1,1’二苯基]-4-基)氨基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)-4-氧代丁酸乙酯的混合物(800mg)的乙酸(15mL)溶液加热到80℃搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，所得残余物柱层析纯化，用60％乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，得到3-(6-氯-5-(2-(二氯甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酸乙酯为灰白色固体(600mg，收率：77.3％)。MS(ESI):589(M+H)+.
第四步 (S)-3-(6-氯-5-(2-(二氟甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酰胺的制备
(R)-3-(6-氯-5-(2-(二氟甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酰胺的制备
3-(6-氯-5-(2-(二氟甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酸乙酯(400mg，0.68mmol)的甲醇(5mL)溶液中加入7N氨甲醇溶液(4.8mL，33.9mmol)，反应液升温至60℃搅拌反应12小时。反应液减压浓缩，粗品产物用柱层析纯化，洗脱体系为正己烷和乙酸乙酯，得到3-(6-氯-5-(2-(二氟甲氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-(4-((环丙基甲基)磺酰基)苯基)丙酰胺(177mg，式I化合物)。
MS(+)ES:560(M+H)+
1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.91(d,2H)7.64(d,3H)7.38-7.52(m,2H)7.19-7.36(m,3H)6.64(s,1H)4.92-5.00(m,1H)3.38(d,1H)3.07-3.21(m,3H)0.83-1.01(m,1H)0.37-0.63(m,2H),0.11(q,2H)
经鉴定，所得到的产物为式I化合物的无定型物，其XRPD图谱如图1所示。
测试实施例1.LanthaScreen TR-FRET RORγ-LBD和共激活肽的生化实验
材料和试剂
1.RORγLBD-GST tagged(Cat No.RORC-114H，Creative Biomart)
2.Fluorescein-D22 coactivator，(Cat No.PV4386，Invitrogen)
3.LanthaScreenTM Tb anti-GST antibody(目录号PV3550，Invitrogen)
4.TR-FRET coregulatory buffer D(Cat No，PV4420，Invitrogen)
5.DTT(Cat No.P2325，Fisher)
6. 384孔测定板(Cat No.6008280，Perkin Elmer)
7.Tecan Infinite M1000读板仪(Tecan)
实验步骤
通过向TR-FRET Coregulator Buffer D中加入1M DTT至终浓度为5mM DTT，制备Complete TR-FRET Coregulator BufferD。在Complete TR-FRET Coregulator BufferD中进行化合物稀释。最高剂量为3μM，7倍稀释，总共7个剂量。向384孔板的每个孔中加入10μL。对于阴性和阳性对照，加入10μL CompleteTR-FRET Coregulator Buffer D.
使用Complete TR-FRET Coregulator BufferD制备RORγLBD溶液。RORγLBD溶液在每个反应的最终浓度为25ng。除了添加5μL Complete TR-FRET Coregulator Buffer D的阴性孔之外，将5μL RORγLBD溶液添加到384孔测定板的所有孔中。
使用Complete TR-FRET Coregulator Buffer D制备含有0.6μM Fluorescein-D22和8nM Tbanti-GST antibody的溶液，然后向384孔测定板的所有孔中各加入5μL所制备的溶液。
将384孔板简单地轻轻混合在平板振荡器上，在室温下避光反应1小时。用塑料膜密封384孔板以使避免蒸发。
在Tecan Infinite M1000读板仪上波长为520nm和495nm读板。使用GraphPadPrism通过绘制化合物浓度的对数与抑制百分比的关系来计算IC50值。表1中显示了式I化合物的IC50值。
测试实施例2.在人外周血单核细胞中抑制IL-17A细胞因子产生的测定
实验材料及仪器
1.Human PBMC(Stemcell,Cat No.70025.1)
2.Lymphocyte medium(Zenbio,Cat No.LYMPH-1)
3.TexMACS(Miltenyi Biotec,Cat No.130-097-196)
4.Human Cytostim(Miltenyi Biotec,Cat No.130-092-173)
5.Human IL-17ELISA，人IL-17酶联免疫试剂盒(R&D Systems,D1700)
6. 96孔细胞培养板(Fisher Scientific,Cat No.07-200-80)
7.Tecan SPARK读板仪(Tecan)
实验步骤
将冻存的人外周血单核细胞(PBMC)在预热的淋巴细胞培养基中快速复苏，离心1000rpm，10min，除去细胞培养上清，将细胞轻轻悬浮于TexMACS培养基中，计数细胞。在细胞悬液中按比例加入T细胞激活试剂cytostim(10μL/mL)，然后以1×105个外周血单核细胞/孔的密度将细胞种植于96孔细胞培养板中。使用TexMACS培养基梯度稀释待测化合物，分别加入各实验孔中，每组2-3个平行孔。准备只含细胞不加cytostim的阴性对照孔，以得到背景读数。将细胞培养板放置于5％二氧化碳37℃培养箱孵育3天。药物处理3天后收取细胞培养上清液，离心去除悬浮物。然后使用IL-17A酶联免疫试剂盒定量上清液中IL-17A。使用GraphPad Prism 6.0的log(inhibitor)vs.response--Variable slope(fourparameters)算法来计算化合物抑制率的IC50值。抑制率计算式如下:
计算式中，Inhibition％为抑制率；OD(NC)为细胞不加cytostim和不加化合物的阴性对照的读数；OD(PC)为细胞加cytostim但不加化合物的阳性对照的读数；OD(compound)为细胞加cytostim和加化合物的读数。
实验结果
LanthaScreen TR-FRET RORγ-LBD和共激活肽的生化实验结果表明，式I化合物与RORγ-LBD的结合引起其构象变化，导致RORγ-LBD对共激活肽的亲和力减弱，抑制RORγ的活性，IC50为10nM(表1)。除此之外，RORγ抑制剂可抑制17型免疫辅助性T细胞(Th17)和17型免疫毒性T细胞(Tc17)的活性，包括抑制IL-17A细胞因子产生，来减少免疫系统的过度活性。为了测定RORγ抑制剂在细胞里功能性的活性，在人PBMC细胞中用人工超抗原(Cytostim)激活T细胞，促进T细胞分化，从而分泌细胞因子，包括IL-17。实验结果表明式I化合物在人外周血单核细胞中可以抑制IL-17A细胞因子的产生，IC50为21nM(表1)。总之，式I化合物可以通过抑制RORγ的活性减少IL-17A细胞因子产生。
表1.式I化合物抑制对RORγ的结合和在人外周血单核细胞中IL-17产生
实施例1、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(1.5g，2.67mmol)加入到35mL异丙醇和异丙醚(V:V＝13:22)混合溶剂中，加热到70℃，搅拌溶清，缓慢降至室温，室温搅拌18小时，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(1.37g，收率：91.3％)。经X-射线粉末衍射检测，将该产物定义为晶型A，谱图如图2。DSC谱图如图3，第一吸热峰峰值251.58℃，第二吸热峰峰值285.55℃；TGA谱图如图4。
DVS检测显示在正常存储条件下(即25℃、60％RH)，该样品吸湿增重约为0.37％；在加速实验条件(即70％RH)，吸湿增重约为0.42％；在极端条件下(90％RH)，吸湿增重约为0.54％。在0％-95％RH湿度变化过程中，该样品的解吸附过程与吸附过程重合。DVS检测后复测晶型，晶型未转变。DVS谱图如图5，DVS检测前后X-射线粉末衍射对比谱图如图6。
表2、式I化合物A晶型的特征峰
实施例2、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL乙酸异丙酯和正己烷(V:V＝1:1)混合溶液中，加热到70℃，搅拌溶清，缓慢降至室温，室温搅拌16小时析出白色固体，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例3、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL异丙醇和水(V:V＝4:1)混合溶液中，加热到70℃，搅拌溶清，缓慢降至室温，室温搅拌16小时析出白色固体，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例4、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1.5mL甲基叔丁基醚和异丙醇(V:V＝2:1)混合溶液中，加热到70℃，搅拌溶清，缓慢降至室温，室温搅拌16小时析出白色固体，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例5、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL乙腈中，加热到70℃，搅拌溶清，缓慢降至室温，室温搅拌16小时析出白色固体，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例6、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1.25mL异丙醚和乙醇(V:V＝4:1)混合溶液中，加热到70℃，搅拌溶清，缓慢降至室温，室温搅拌16小时析出白色固体，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例7、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL甲基叔丁基醚中，为混悬液，室温打浆搅拌48小时，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到标题产物(40mg，收率：80％)。
经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例8、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL甲苯中，为混悬液，室温打浆搅拌48小时，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例9、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL异丙醇和正己烷(V:V＝1:1)混合溶液中，为混悬液，室温打浆搅拌48小时，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例10、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL乙酸乙酯和正己烷(V:V＝1:1)混合溶液中，为混悬液，室温打浆搅拌48小时，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例11、式I化合物A晶型的制备
将式I化合物(50mg，89.3μmol)加入到1mL异丙醇和水(V:V＝1:1)混合溶液中，为混悬液，室温打浆搅拌48小时，过滤，收集滤饼，真空干燥，得到产物(40mg，收率：80％)。经X-射线粉末衍射检测，该产物为A晶型。
实施例12、式I化合物A晶型影响因素实验
将式I化合物A晶型样品敞口平摊放置，考察在加热(40℃、60℃)、光照(4500Lux)、高湿(RH 75％、RH 90％)条件下样品的稳定性，取样考察期为30天。
实验结果：
表3、式I化合物A晶型影响因素实验结果
实验结论：
由表3的影响因素实验结果表明：在光照、高温40℃、高温60℃、高湿75％、高湿90％条件下，放置30天，式I化合物A晶型样品的物理化学稳定性较好。
实施例13、式I化合物A晶型长期加速稳定性实验
对式1化合物A晶型样品进行3个月的长期(25℃、60％RH)、加速(40℃、75％RH)稳定性考察。
表4、式I化合物A晶型样品长期加速稳定性实验结果：
由表4的长期加速稳定性实验结果显示：式I化合物A晶型样品长期(25℃、60％RH)、加速(40℃、75％RH)稳定性条件下放置3个月的物理化学稳定性好。
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