发明详述

本文公开了一种植物的果实和/或叶的植物提取物，其包含多种原花青素和生物类黄酮，其中所述果实提取物已被标准化至以所述果实提取物中花青素-3-半乳糖苷、花青素-3-阿拉伯糖苷、甲基花青素-3-半乳糖苷、甲基花青素-3-阿拉伯糖苷和二甲花翠素-3-半乳糖苷的总重量计约1.90mg/g的花青素含量，并且其中所述植物提取物至少包含来自于越橘属的提取物。

本发明还基于下述令人吃惊的发现，即蔓越橘植物(蔓越橘(Vacciniummacrocarpon))的叶与蔓越橘的果实相比某些类黄酮的含量明显更高。具体来说，所述来自于叶的提取物具有比蔓越橘植物的果实的类黄酮含量高至少20倍的类黄酮含量。在另一个实施方式中，所述来自于叶的提取物包含的原花青素三聚体和原花青素四聚体的含量，分别比蔓越橘植物的果实的原花青素三聚体和原花青素四聚体含量高至少23倍和700倍。因此，在一个实施方式中，所述植物提取物至少来自于蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)的叶。此外，所述植物提取物至少来自于蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)的叶，并表现出抗氧化活性。

当所述植物提取物至少是所述植物的叶时，所述植物提取物可以以约1.0μg/mL或更高的量存在于所述组合物中。例如，所述叶提取物可以以约1.0μg/mL至约1000.0μg/mL的量存在于所述组合物中。

对于本申请来说，术语“组合物”是指治疗、改善、促进、提高、管理、控制、维持、优化、修改、减轻、抑制或阻止与天然状态、生物过程或疾病或障碍相关的特定状况的产品。例如，组合物在对象中改善氧化的抑制和/或减轻炎症等。术语组合物包括但不限于包含有效量的提取物、其至少一种组分或其混合物的药品(即药物)、非处方药(OTC)、化妆品、食品、食品成分或膳食补充剂组合物。示例性的组合物包括霜剂、化妆用洗剂、面膜或粉剂，或作为乳液、洗剂、搽剂泡沫、片剂、膏药、颗粒剂或软膏。组合物还可以包括饮料，例如加入有效量的提取物的饮料或含有有效量的提取物的茶包。含有有效量的提取物的食品组合物的非限制性实例包括烘焙食品、蛋白粉、肉制品、乳制品和糖食。

当在本文中使用时，术语“提取物”或“植物提取物”是指包含至少越橘属植物(例如蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)和/或红莓苔子(Vaccinium oxycoccos))的物质的一种或多种活性成分的固体、半流体或液体物质或制剂。优选地，所述活性成分源自于所述植物的叶的提取物。所述提取物可以使用溶剂例如水、1至4个碳原子的短链醇类(例如甲醇、乙醇、丁醇等)、乙烯、丙酮、己烷、醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(“DMF”)、二甲基亚砜(“DMSO”)、1,3-丁二醇、丙二醇及其组合来制备，但是也可以使用所述粗提取物在此类溶剂中的级分制备。可以使用任何提取方法，只要它确保所述活性成分的提取和保护即可。

当在本文中使用时，术语纯化合物、组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性药剂或成分或其组合的“有效量”或“治疗有效量”，是指在剂量和时间长度上足以有效实现所需结果的量。例如，所述“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的纯化合物、组合物、提取物、植物提取物、提取物混合物、植物提取物混合物、提取物组分和/或活性药剂或成分或其组合的在给药到对象(例如哺乳动物例如人类)时，足以在对象中实现治疗例如改善氧化的抑制和/或减轻炎症等的量。本公开的组合物、提取物、植物提取物、提取物混合物、植物提取物混合物、提取物组分和/或活性药剂或成分的构成“有效量”或“治疗有效量”的量，将随着所述活性药剂或化合物、待治疗的病症及其严重程度、给药方式、给药持续时间或待治疗对象的年龄而变，但可以由本领域普通技术人员根据自己的知识和本公开内容常规地确定。

术语“可药用”意味着那些药物、医药、提取物或惰性成分适合于与人类和较低等动物相接触使用而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激性等，并与合理的利益/风险比相称。

术语“给药”被定义为通过本领域中已知的途径，包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、颊、局部、透皮、直肠、肌肉内、皮下、骨内、透粘膜或腹膜内给药途径将组合物提供给对象。在优选实施方式中，给药组合物的口服途径是适合的。

当在本文中使用时，术语“对象”或“个体”包括可能向其给药组合物的哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人类、非人类灵长动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、啮齿动物(包括转基因和非转基因小鼠)等。在某些实施方式中，所述对象是非人类哺乳动物，并且在某些实施方式中，所述对象是人。

当在本文中使用时，术语“载体”是指有助于将一种或多种植物提取物在适合于给药的形式中维持在可溶且均匀状态下的组合物，其无毒并且不以有害方式与其他组分相互作用。

除非另有指明，否则整个本公开中叙述的所有比例和百分率均以重量计。

本发明提供了能够抑制由氧化胁迫造成的DNA损伤的基于植物的抑制剂。更具体来说，本发明针对来自于越橘属的蔓越橘植物的叶的植物提取物。已发现此类植物提取物能够通过中和自由基来抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤，从而终止由所述自由基产生的链反应。通过终止所述链反应，阻止或抑制了由所述自由基通过它们与重要大分子例如DNA、蛋白质、脂类或细胞膜的反应造成的损伤。

根据本发明的能够抑制由氧化胁迫造成的DNA损伤的有用植物提取物包括来自于越橘属的植物提取物。更具体来说，所述植物提取物可以从选自Vacciniumarctostaphylos、蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)、红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)、小果红莓苔子(Vaccinium microcarpum)、小果红莓苔子(Vaccinium microcarpum)、南方蔓越橘(Vaccinium erythrocarpum)、Vaccinium arboretum、Vaccinium crassifolium、狭叶越橘(Vaccinium angustifolium)、Vaccinium boreale、Vaccinium caesariense、Vaccinium caespitosum、高丛越橘(Vaccinium corymbosum)、Vaccinium darrowii、Vaccinium deliciosum、Vaccinium elliotii、Vaccinium floribundum、Vacciniumhirsutum、膜质越橘(Vaccinium membranaceum)、Vaccinium myrsinites、Vacciniummyrtilloides、欧洲越橘(Vaccinium myrtillus)、Vaccinium ovalifolium、常青越桔(Vaccinium ovatum)、Vaccinium padifolium、Vaccinium pallidum、Vacciniumparvifolium、Vaccinium praestans、Vaccinium reticulatum、Vaccinium scoparium、Vaccinium stamineum、Vaccinium tenellum、笃斯越橘(Vaccinium uliginosum)、细枝越桔(Vaccinium virgatum)和/或红豆越橘(Vaccinium vitis-idaea)的植物获得。优选地，所述植物提取物至少来自于蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)、红莓苔子(Vacciniumoxycoccos)、小果红莓苔子(Vaccinium microcarpum)和/或小果红莓苔子(Vacciniummicrocarpum)。更优选地，所述植物提取物至少来自于蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)，甚至更优选地植物提取物来自于蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)的叶。

根据本发明的能够抑制由氧化胁迫造成的DNA损伤的组合物可以包括能够作为活性成分起作用并且是所述植物提取物的组分的一种或多种化合物。例如，所述化合物可以是获得所述植物提取物的植物中存在的植物化学成分。所述化合物可能至少部分负责抑制由氧化胁迫造成的DNA损伤。所述化合物可以是能够抑制由氧化胁迫造成的DNA损伤的任何化合物。在一个实施方式中，所述化合物选自植物化学成分异槲皮素、槲皮素-3-糖苷、山柰酚糖苷和/或原花青素(例如A、B、三聚体、四聚体)。

通常，植物的一个或多个部位可用于生产植物提取物，包括但不限于根、茎、叶、花、果实、种子和种子的种皮。在本发明中，单独地或与其他植物部位、特别是果实一起至少使用所述植物的叶来生产所述植物提取物。来自于越橘属植物的果实和叶可以从各种不同来源商购。所述果实和叶的提取物可以使用任何适合的提取技术获得。

就此而言，可以收集并粉碎所述植物的一个或多个部位，特别是所述越橘属植物的叶。然后可以使用适合的溶剂提取所述粉碎的材料。所述溶剂可以在浓缩步骤中除去。例如，可以将所述提取过的材料过筛或过滤，以产生上清液和滤饼。所述滤饼可以被压榨以除去显著部分的液体，所述液体可以添加到所述上清液中。然后可以将所述滤饼脱水并用作纤维来源。所述上清液可以被蒸馏以除去所述溶剂或其一部分，以形成植物提取物液体浓缩物。所述被除去的溶剂可以循环利用。所述浓缩物可以被干燥(例如通过喷雾干燥)，以提供干燥的植物提取物。这种干燥的植物提取物可以如本文中所述进行化验和/或标准化。优选地，所述干燥的植物提取物源自于蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)，特别是蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)植物的叶。

适合用于提取过程的溶剂包括水、醇或其混合物。示例性的醇性溶剂包括但不限于C₁-C₇醇类(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇)、水-醇类或醇与水的混合物(例如水性乙醇)、多元醇(例如丙二醇和丁二醇)和脂肪醇。任何这些醇性溶剂可以以混合物的形式使用。在一个实施方式中，所述植物提取物使用乙醇、水或其组合(例如约70％乙醇与约30％水的混合物)来提取。在另一个实施方式中，所述植物提取物仅使用水来提取。

在一个实施方式中，所述植物提取物可以使用有机溶剂提取技术来获得。在另一个实施方式中，可以使用溶剂顺序分离技术来获得所述植物提取物。全水-乙醇提取技术也可用于获得所述植物提取物。通常，这被称为一次性提取。

也可以使用全乙醇提取。这种技术使用乙醇作为溶剂。这种提取技术可以产生除了水溶性化合物之外还具有脂溶性和/或亲脂性化合物的植物提取物。

可用于获得所述植物提取物的提取技术的另一个实例是超临界流体提取(“SFE”)。在这种提取过程中，待提取的材料可以不被暴露于任何有机溶剂。相反，可以使用含有或不含改性剂的处于超临界条件(>31.3℃和>73.8巴)下的二氧化碳作为提取溶剂。本领域技术人员将会认识到，可以改变温度和压力条件以获得提取物的最佳得率。这种技术与全己烷和乙酸乙酯提取技术相似，可以产生脂溶性和/或亲脂性化合物的提取物。

在所述过程中产生的植物提取物可以包括在所述被提取的材料中存在的广泛种类的植物化学成分。所述植物化学成分可以是脂溶性或水溶性的。在收集所述提取物溶液后，可以将溶剂蒸发，得到所述提取物。

所述植物提取物可以被标准化至规定量的特定化合物。例如，所述植物提取物可以被标准化至规定量的所述提取物中存在的活性成分或植物化学成分。

在所述抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤的组合物中存在的植物提取物的量可以取决于几种因素，包括所需的氧化胁迫诱导的DNA损伤的抑制水平、特定植物提取物或其组分抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤的水平和其他因素。优选地，所述植物提取物以所述组合物的总重量计约0.005重量％或更高、例如约0.005重量％至约99.00重量％的量存在。

所述抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤的组合物可以包括一种或多种可接受的载体。所述载体可以帮助将所述植物提取物并入到具有适合于给药到对象的形式的抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤的组合物中。大量可接受的载体在本领域中是已知的，并且所述载体可以是任何适合的载体。所述载体优选地适合于给药到动物包括人类，并且能够作为载体起作用而不显著影响所述植物提取物和/或任何活性成分的所需活性。所述载体可以在所需的给药途径和所述组合物的剂型的基础上选择。

适合的剂型包括液体和固体形式。在一个实施方式中，所述组合物采取凝胶、糖浆、浆液或悬液的形式。在另一个实施方式中，所述组合物采取液体剂型，例如口服液(drink shot)或液体浓缩物。在另一个实施方式中，所述组合物以固体剂型存在，例如片剂、丸剂、胶囊、糖衣丸剂或粉剂。当采取液体或固体剂型时，所述组合物可以采取适合于掺入到食品中以备递送的食品递送形式。适合用于固体形式(特别是片剂和胶囊形式)中的载体的实例包括但不限于有机和无机惰性载体材料例如明胶、淀粉、硬脂酸镁、滑石、树胶、二氧化硅、硬脂酸、纤维素等。所述载体可以是基本上惰性的。

作为实例，硅化微晶纤维素可用作载体或粘合剂。硅化微晶纤维素是微晶纤维素和胶体二氧化硅的物理混合物。一种此类适合形式的硅化微晶纤维素是可以从PenwestPharmaceutical Co.,Patterson,N.J获得的ProSolv90。二氧化硅除了由所述硅化微晶纤维素提供的之外，也可以作为加工助剂添加到所述组合物。例如，可以包括二氧化硅作为助流剂，以在固体剂量单元例如片剂的制造中在压片期间改善粉末的流动性。

在另一个实施方式中，所述载体至少是功能性载体例如荞麦或斯佩耳特小麦。通过在所述组合物中添加功能性载体，可以提供额外的益处，例如与例如上文提到的标准载体相比更低的血糖生成指数。此外，功能性载体可以是无过敏原的(例如荞麦)，并且通过将它们添加到生产过程中，本发明的植物提取物可能从这些功能性载体的类黄酮例如芸香苷和槲皮素获益。这些功能性载体的高纤维含量也可以促进并调节肠道通过。最后，斯佩耳特小麦中存在的硒的附加的矿物质益处可能有助于代谢。

所述抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤的组合物可以包含其他惰性成分例如润滑剂和/或助流剂。润滑剂有助于制造过程中例如从模具弹出的过程中片剂的操控。助流剂在压片期间改善粉末流动性。硬脂酸是可接受的润滑剂/助流剂的实例。

所述抑制氧化胁迫诱导的DNA损伤的组合物可以被制造成固体剂型例如片剂和胶囊。这种形式提供了可以由个体容易地运输到进餐场所例如餐厅，并在进食食物之前、期间或之后服用的产品。所述组合物可以被配制成含有适量所述植物提取物和/或活性成分的剂量单元，允许个体根据适合的参数例如体重、食物量或碳水化合物(例如糖)含量来确定服用的单元的适合数量。

在一个实施方式中，所述植物提取物以治疗有效量存在于所述组合物中，例如约1.0μg/mL或更高、优选地约1.0μg/mL至约1000.0μg/mL、更优选地约15.0μg/mL至约1000.0μg/mL、甚至更优选地约25.0μg/mL至约500.0μg/mL、甚至更优选地约40.0μg/mL至约150.0μg/mL的量。所述组合物可以作为单剂或在多剂中给药。在一个实例中，所述化合物每天给药至多三剂。例如，所述化合物可以在餐前、餐中或餐后给药。在一个实施方式中，所述组合物是具有抗氧化性质的膳食补充剂，含有治疗有效量的蔓越橘叶提取物。

所述剂量可以被选择成在单个单元中提供可能对某些个体和/或某些食品有效的抑制作用水平，同时也允许相对简单的剂量增加，以提供可能对其他个体和/或其他食品有效的其他抑制作用水平。

所述抑制性组合物可以采取适合于口服摄取的形式。这种形式可以被配置成旨在提供规定剂量的所述植物提取物的单一剂型。例如，所述单一剂型可以是粉剂、丸剂、片剂、胶囊或口服液。所述单一剂型可以包含例如约1.0μg/mL至约1000.0μg/mL的所述植物提取物。其他形式包括含有所述植物提取物的食品或饮料组合物。

实施例

实施例-材料和化学物质剖测

实施例1–来自于蔓越橘果实和蔓越橘叶的70％乙醇提取物的制备

将干燥的蔓越橘果实粉末(蔓越橘(Vaccinium macrocarpon))(60g)装入3个100ml不锈钢试管中，并使用Thermo Scientific^TM Dionex^TM ASE 350加速溶剂提取器在80℃的温度和1500psi的压力下用DI水中的70％乙醇溶剂提取两次。所述提取物溶液被自动过滤并收集。将合并的乙醇提取物溶液用旋转蒸发仪在真空下蒸发，以给出粗品70％乙醇果实提取物(E1)。

将干燥的磨碎的蔓越橘叶粉末(蔓越橘(Vaccinium macrocarpon))(140g)装入7个100ml不锈钢试管中，并使用Thermo Scientific^TM Dionex^TM ASE 350加速溶剂提取器在80℃的温度和1500psi的压力下用DI水中的70％乙醇溶剂提取两次。所述提取物溶液被自动过滤并收集。将合并的乙醇提取物溶液用旋转蒸发仪在真空下蒸发，以给出粗品70％乙醇叶提取物(E2)。

提取结果提供在下述表1中。

表1–蔓越橘果实和蔓越橘叶的提取

实施例2–蔓越橘果实和蔓越橘叶提取物的化学物质剖测

使用超高压液相色谱(“HPLC”)和质谱(UPLC I类和GS-XT-QTof系统，两者均可以从Water Corporation,Milford,Massachusetts USA获得)，确定了蔓越橘果实提取物E1和蔓越橘叶提取物E2中存在的类黄酮化合物。使用的柱是UPLC HSS T3 2.1x100 mm，1.8μm，柱温为40℃，样品温度为15℃。对于流动相来说，溶剂A是含有10％乙腈(“ACN”)的水(含有0.1％甲酸)，溶剂B是ACN。采集范围是100-1500道尔顿(“Da”)，采集模式是电喷雾电离(“ESI”)(-)。下面的表2提供了HPLC条件。

表2-用于分析E1和E2提取物的HPLC条件

峰的鉴定仅仅基于准确质量。由于数据库的限制，多种异构体可能已被鉴定为同一化合物。例如，具有578.528的相同分子量的八(8)种原花青素B1-B8化合物在这项分析中未被区分。

在准确质量的基础上，在E1中检测和鉴定到相对低含量的原花青素类和类黄酮糖苷例如槲皮素、异槲皮素和杨梅素3-呋喃阿拉伯糖苷。在E1中检测到的化合物E1(非穷举性)的化学结构示出在图1中。下面的表列出了在准确质量的基础上在E1中鉴定到的化合物。

表3–在E1中鉴定到的化合物

在E2中鉴定到丰富的生物类黄酮，包括广寄生苷、异槲皮素、山柰酚、糖苷等。在E2中检测到的化合物(非穷举性)的化学结构示出在图2中。下面的表列出了在准确质量的基础上在E2中鉴定到的化合物。

表4–在E2中鉴定到的化合物

在E2中发现多种原花青素含量明显比E1中更高。基于质荷比(“m/z”)在575.11和577.13处的检测器计数，发现在E2中包括A和B两种类型的原花青素二聚体比E1中高大约五十(50)倍。观察到的m/z在863.18处的原花青素三聚体在E2中的存在比E1中高大约二十三(23)倍，而m/z在1152.24处的原花青素四聚体在E2中比E1中高超过七百(700)倍，

基于LCMS分析，包括异槲皮素、槲皮素-3-呋喃阿拉伯糖苷、山柰酚糖苷等在内的类似生物类黄酮也在E2中以高得多的丰度被鉴定到。观察到的m/z在463.093处、鉴定到的分子式为C₂₁H₂₂O₁₀的类黄酮，E2中的峰与E1中检测到的相应峰相比，保留时间(“RT”)为6.38min的峰高出二十(20)倍，RT为6.78min的峰高出三十六(36)倍。基于LCMS分析，在E2中类黄酮的总检测器计数比E1中的类黄酮高超过二十(20)倍。

E1和E2的LCMS TIC、PDA 280nm和PDA 350nm色谱图分别提供在图3和图4中。图5中示出的E2与E1之间的LCMS TIC色谱图比较清楚地显示E2中原花青素类和生物类黄酮的含量更高，而在E1中看到更高的有机酸含量(图3)。

实施例3–花青素类定量

花青素类定量方法改变自已发表的HPLC分析方法(J.A_GRIC.F_OOD C_HEM.，“通过HPLC和HPLC-MS进行的植物补充剂原材料中花青素类的分离、鉴定、定量和方法验证”(Separation,identification,quantification,and method validation ofanthocyanins in botanical supplement raw materials by HPLC and HPLC-MS)，Vol.49(8),pp.3515-3521(2001))。使用的HPLC系统是日立D7000 HPLC系统，所述系统有柱尺寸为4.6x250 mm的Phenomenex Luna 10μm C18柱。在流动相中使用的溶剂是H₂O中的0.5％磷酸(溶剂A)和H₂O/ACN/乙酸/H₃PO₄(50％:48.5％:1.0％:0.5％)(溶剂B)。UV波长为480nm。

参比标准品花青素-3-葡萄糖苷购自ChromaDex(Chicago,Illinois US)。在5mL容量瓶中，将花青素-3葡萄糖苷以1mg/mL的浓度制备在含有2％(v/v)HCl的甲醇溶液中。将所述储用溶液用含有2％(v/v)HCl的甲醇进一步稀释1/5、1/10、1/20和1/100倍，以分别提供1.00、0.20、0.10、0.05和0.01mg/mL五种浓度的花青素-3-葡萄糖苷溶液。利用所述五种溶液产生校准曲线。每种样品以10μL进样三份平行样。所述校准曲线在积分峰面积的基础上确定。花青素-3-葡萄糖苷的相关系数(R2)值被确定为0.9985。

如下制备用于分析的样品。称量出12.5、25.0、50.0和100.0mg E1。向每种样品添加1mL含有2％(v/v)HCl的甲醇，然后将每种样品通过超声处理混合十五(15)分钟并以10,000rpm涡旋振荡五(5)分钟。将每种溶液的20μL上清液以三份平行样进样到HPLC。不同浓度下的五(5)种花青素化合物的定量分析表现出线性，相关系数R²为0.9953至0.9982(图7)。对于浓度为25mg/mL和50mg/mL的样品，针对0.05mg/mL的花青素-3-葡萄糖苷，在积分峰面积的基础上分别计算每一种花青素的量。

E1中的五种花青素被定量，总含量为1.903mg/g E1干重。基于分析和与所述分析方法文章和文章J.AOAC I_NT.，“通过带有紫外检测的高效液相色谱确定蔓越橘果实和蔓越橘果实产品中的花青素，单一实验室验证”(Determination of anthocyanins inCranberry fruit and Cranberry fruit products by High-Performance LiquidChromatography with Ultraviolet Detection；Single-Laboratory Validation)，Vol.94(2)；pp.459-466(2011)中公开的数据的比较，这些花青素包括花青素-3-半乳糖苷(“C3Gla”)、花青素-3-阿拉伯糖苷(“C3-Ara”)、甲基花青素-3-半乳糖苷(“P3-Gla”)、甲基花青素-3-阿拉伯糖苷(“P3-Ara”)和二甲花翠素-3-半乳糖苷(“Mal3-Gla”)。这些化合物示出在图6中。在E2中没有检测到花青素。

表3–E1中计算的五种花青素的量

实施例-生物测定法

使用食品级乙醇制备蔓越橘果实和蔓越橘叶的提取物，然后如上所述过滤和干燥。对于测定法准备的其余部分，使用研究级试剂。将提取物溶解在二甲基亚砜(“DMSO”)中至终浓度为50mg/mL，然后在适合于每种生物测定法的缓冲液中稀释到工作浓度。

实施例4-DNA损伤测定法

当不论是内源还是外源的DNA损伤形成双链断裂(“DSB”)时，它总是跟随着组蛋白H2AX的磷酸化。H2AX是作为核小体中组蛋白八聚体的组分的H2A蛋白家族的一种变体。它被激酶例如PI3K途径中的毛细血管共济失调突变蛋白(“ATM”)和ATM-Rad3相关蛋白(“ATR”)磷酸化。蛋白γ-H2AX是召集和集中DNA修复蛋白的第一步。DSB可以被诸如电离辐射或细胞毒性剂的机制诱导，并且随后γ-H2AX病灶快速形成。这些病灶以1:1的方式代表了所述DSB，并且可用作损伤的生物标志物。可以针对γ-H2AX产生抗体，其因此可以通过第二抗体通过免疫荧光进行可视化。通过流式细胞术对γ-H2AX进行检测和可视化允许评估DNA损伤、相关的DNA损伤蛋白和DNA修复。

将人类皮肤成纤维细胞以8000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。24小时后，将细胞用测试化合物处理48小时，然后将所述细胞用1mM过氧化氢处理4小时以诱导DNA损伤。过氧化氢通过在DNA中产生断裂来诱导DNA损伤。然后将细胞固定并用针对生物标志物γ-H2AX的抗体染色，所述γ-H2AX是在双链断裂处发现的一种磷酸化的组蛋白变体。在双链断裂位点处，所述组蛋白被磷酸化，表明所述DNA受损并需要修复。用于磷酸化组蛋白变体γ-H2AX的抗体可用于鉴定DNA损伤的位点。将细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(“DAPI”)这种结合到DNA的荧光染料染色。使用Image Xpress获取图片并使用Meta Xpress进行分析，以计算每种条件下的荧光强度除以细胞总数。

对过氧化氢处理做出响应的DNA损伤通过细胞中存在的γ-H2AX的量来测量。在用过氧化氢处理以诱导DNA损伤后检测到的γ-H2AX的量的基础上，测试50和100μg/mL的蔓越橘果实E1和蔓越橘叶E2提取物的DNA损伤抑制。使用25μg/mL的儿茶素和soliprin作为阳性对照。如图10中所示，100μg/mL的蔓越橘叶提取物E2表现出DNA损伤的显著抑制。相对于未用提取物处理但暴露于过氧化氢的孔来计算抑制百分数。从这个实施例看出，用100mg/mL的E2预处理成纤维细胞显著降低了检测到的γ-H2AX的量，显示出E2保护DNA免于损伤的能力。

使用细胞计数试剂盒-8(“CCK-8”)确定在每种处理中活细胞相对于未处理对照的百分率。将CCK-8试剂添加到培养基(终浓度为10％的总体积)，并在37℃和5％CO₂下温育一(1)小时，然后在多模式读板器上在460nm处读取吸光度，以确定相对于未处理对照孔的活细胞数目。所述处理与所述未处理的对照均没有统计显著的差异(图11)。

上述数据说明蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)叶的植物提取物具有一种或多种表现出抗氧化活性的化合物。更具体来说，所述蔓越橘叶提取物可能在改善γ-H2AX活性方面具有合理的活性。

上面的描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于在材料和方法方面做出修改，并易于在制造方法和设备方面做出改变。对于本领域技术人员来说，考虑到本公开或本文公开的发明的实践，此类修改将变得显而易见。此外，除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。因此，本发明不打算限于本文公开的

具体实施方式

，而是打算覆盖落入随附的权利要求书中体现的本发明的真正范围和精神之内的所有修改和替换方案。