具体实施方式

在下文中说明一个优选实施例。

在本文所用的术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”及其语法变化形式是包含性的或开放性的，不排除其它未列举的元素和/或方法步骤。当在本文中与产物、用途或方法结合使用时，术语“基本上由......组成”表示可存在另外的元素和/或方法步骤，但是这些增加的项目不会实质性地影响所述方法或用途的作用方式。当在本文中与产物、用途或方法结合使用时，术语“由......组成”排除附加元素和/或方法步骤的存在。在本文中说明的包括某些元素和/或步骤的产品、用途或方法在某些实施例中也可基本上由这些元素和/或步骤组成，而在其它实施例中由这些元素和/或步骤组成，不论这些实施例是否被具体提及。此外，除非另有说明，否则单数的使用包括复数，并且“或”意味着“和/或”。除非在本文中另行限定，否则在本文中所用的所有技术和科学术语应理解为具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。在本文中所用的术语“大约”指大致与给定值相差+/-10％。应理解，无论是否具体提及，在本文中提供的任何给定值中始终包含这种差异。当在本文中与术语“包括”结合使用时，词语“一”或“一个”的使用可表示“一个”，但也符合“一个或多个”、“至少一个”、以及“一个或不止一个”的含义。

本文所用的术语“植物”、“植物部分”、“植物部分”、“植物物质”、“植物生物质”、“植物材料”、“植物提取物”或“植物叶”可包括能够为本文所述的一种或多种核酸的表达提供转录、转译和转译后机制和/或可从中提取并纯化所表达的蛋白质或VLP的完整的植物、组织、细胞或其任何部分、细胞内植物成分、细胞外植物成分、植物的液态或固态提取物、或者它们的组合。植物可包括但不限于草本植物。此外，植物可包括但不限于农作物，包括油菜、芸苔属植物、玉米、烟草属植物(烟草)等，例如本氏烟、黄花烟、花烟草、红花烟、茄科烟草、拟南芥、苜蓿、马铃薯、甘薯(Ipomoea batatus)、人参、豌豆、燕麦、大米、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花、玉米、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghumvulgare)、红花(Carthamus tinctorius)。

本文中所使用的术语“植物部分”是指植物的任何部分，包括但不限于叶、茎、根、花、果实、从叶、茎、根、花、果实获得的植物细胞、从叶、茎、根、花、果实获得的植物提取物、或者它们的组合。本文中所用的术语“植物提取物”是指在经过物理处理(例如冷冻，然后在适当的缓冲液中提取)、机械处理(例如研磨或均质化植物或植物部分，然后在适当的缓冲液中提取)、酶处理(例如使用细胞壁降解酶)、化学处理(例如使用一种或多种螯合剂或缓冲液)、或者它们的组合之后获得的植物衍生产品。还可对植物提取物进行加工，以除去不需要的植物成分，例如细胞壁碎片。可获得植物提取物以帮助从植物、植物部分或植物细胞回收一种或多种成分，例如来自植物、植物部分或植物细胞的蛋白质(包括蛋白质复合物、蛋白质超结构和/或VLP)、核酸、脂质、碳水化合物、或者它们的组合。如果植物提取物包括蛋白质，那么可称为蛋白质提取物。蛋白质提取物可以是来自植物组织的粗植物提取物、部分纯化的植物或蛋白质提取物，或者是包括一种或多种蛋白质、蛋白质复合物、蛋白质超结构和/或VLP的纯化产物。如果需要，可使用本领域技术人员已知的技术对蛋白质提取物或植物提取物进行部分纯化，例如可对提取物进行盐或pH沉淀、离心、梯度密度离心、过滤、层析，例如尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、或者它们的组合。也可使用本领域技术人员已知的技术来纯化蛋白质提取物。

在本文中使用的术语“构建体”、“载体”或“表达载体”指用于将外源核酸序列转移到宿主细胞(例如植物细胞)中并指导外源核酸序列在宿主细胞中的表达的重组核酸。“表达盒”指包含感兴趣的核酸的核苷酸序列，该感兴趣的核酸受负责该感兴趣的核酸在宿主细胞中的转录的适当启动子或其它调节元件的控制，并可操作地联接至该启动子或其它调节元件。本领域技术人员应理解，所述表达盒可包括终止(终止子)序列，该终止序列是在植物宿主中有活性的任何序列。例如，所述终止序列可源自二分RNA病毒(例如豇豆花叶病毒)的RNA-2基因组片段，该终止序列可以是NOS终止子，或者该终止子序列可从苜蓿质体蓝蛋白基因的3′UTR获得。

本公开的构建体还可包括3′非转译结构域(UTR)。3′非转译结构域包含聚腺苷酸化信号以及能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号。所述聚腺苷酸化信号的特征通常是在mRNA前体的3′端添加聚腺苷酸轨道。多聚腺苷酸化信号通常通过与标准形式5′AATAAA-3′的同源性来识别，当然，变化形式也并不少见。适当的3′结构域的非限制性例子有3′转录的非转译结构域，该结构域包含土壤杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因的聚腺苷酸化信号，例如胭脂碱合酶(Nos基因)和植物基因，例如大豆贮藏蛋白基因、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶基因的小亚基(ssRUBISCO；US4,962,028；该文献通过引用结合在此)，它是用于调节质体蓝蛋白表达的启动子。

“调节结构域”、“调节元件”或“启动子”指通常但不总是在基因的蛋白质编码区的上游的核酸部分，它可由DNA或RNA组成，或者由DNA和RNA组成。在调节结构域处于活性并与感兴趣的核苷酸序列可操作地关联或可操作地联接时，这可能导致感兴趣的核苷酸序列的表达。调节元件能够调节器官特异性，或者控制发育或时间基因激活。“调节结构域”包括启动子元件、表现出基础启动子活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激诱导的元件、以及调节启动子活性的元件，例如负调节元件或转录增强子。本文中所用的“调节结构域”还包括在转录后具有活性的元件，例如调节基因表达的调节元件，如转译和转录增强子、转译和转录阻遏子、上游激活序列、以及mRNA不稳定性决定子。后几个元件可位于编码区附近。

在本公开的背景下，术语“调节元件”或“调节结构域”一般指通常但不总是在结构基因编码序列的上游(5′)的DNA序列，它通过实现对RNA聚合酶和/或使转录在特定位点开始所需的其它因子的识别来控制编码区的表达。但是，应理解，位于基因内区内或序列的3′端处的其它核苷酸序列也可能有助于调节感兴趣的编码区的表达。实现对RNA聚合酶或其它转录因子的识别以确保在特定位点的引发的调节元件的一个例子是启动子元件。大多数(但不是全部)真核启动子元件包含TATA盒，该TATA盒是由通常位于转录起始位点上游大约25个碱基对处的腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列。启动子元件可包括负责引发转录的基础启动子元件、以及修饰基因表达的其它调节元件。

有多种类型的调节结构域，包括发育调节型、诱导型或组成型调节结构域。在特定器官或该器官的组织的发育期间的特定时间，在该器官或组织中激活受发育调节或在其控制下控制基因的差异表达的调节结构域。但是，某些受发育调节的调节结构域可能在特定发育阶段的某些器官或组织内优先变得活跃，它们也可能以受发育调节的方式变得活跃，或者在植物内的其它器官或组织内保持基础水平的活性。组织特异性调节结构域(例如种子特异性调节结构域)的例子包括Napin启动子和十字花科植物启动子(Rask等人，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等人，1994，Plant Cell 14：125-130)。叶特异性启动子的一个例子包括质体蓝蛋白启动子(参见US 7,125,978，该文献通过引用结合在此)。

诱导型调节结构域是一种能够响应于诱导物而直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因的转录的结构域。在没有诱导物的情况下，DNA序列或基因不会被转录。通常，特异性地结合至诱导型调节结构域以激活转录的蛋白质因子可以非活跃形式存在，然后被诱导物直接或间接地转化为活跃形式。但是，该蛋白质因子也可能不存在。所述诱导物可以是化学试剂，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或者是由热、冷、盐或有毒元素直接施加或通过病原体或疾病因子(例如病毒)的作用间接施加的生理应激。通过在外部向细胞或植物施用诱导物(例如通过喷雾、浇灌、加热或类似方法)，可使包含诱导型调节结构域的植物细胞暴露于诱导物。诱导型调节元件可源自植物或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，I.R.P.，1998，Trends Plant Sci.3，352-358)。潜在诱导型启动子的例子包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108)、类固醇诱导型启动子(Aoyama，T.和Chua，N.H.，1997，Plant J.2，397-404)和乙醇诱导型启动子(Salter，M.G.等人，1998，Plant Journal 16，127-132；Caddick，M.X.等人，1998，Nature Biotech.16，177-180)、细胞分裂素诱导型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和Kieber，J.J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science274，982-985)、以及生长素诱导元件DR5(Ulmasov，T.等人，1997，Plant Cell 9，1963-1971)。

组成型调节结构域指导基因在植物的不同部位的表达，并在植物发育过程中持续表达。已知的组成型调节元件的例子包括与CaMV 35S转录子关联的启动子(p35S；Odell等人，1985，Nature，313：810-812；该文献通过引用结合在此)、水稻肌动蛋白1(Zhang等人，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等人，1996，Plant J.，10：107-121)、或tms2(U.S.5,428,147)、以及磷酸丙糖异构酶1(Xu等人，1994，Plant Physiol.106：459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejo等人，1993，Plant Mol.Biol.29：637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等人，1995，Plant Mol.Biol.29：637-646)，烟草转译起始因子4A基因(Mandel等人，1995Plant Mol.Biol.29：995-1004)、木薯脉花叶病毒启动子pCAS(Verdaguer等人，1996)；核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的启动子PRBCs(Outhkourov等人，2003)、pUbi(针对单子叶植物和双子叶植物)。

本文中使用的术语“组成型”不一定表示核苷酸序列在组成型调节结构域的控制下在所有类型的细胞中以相同水平表达，而是表示该序列在很多类型的细胞中表达，即使经常观察到丰度的变化。

如上所述的表达构建体可存在于载体中。所述载体可包括允许表达盒转移和整合到生物体或宿主的基因组中的边界序列。所述构建体可以是植物双元载体，例如基于pPZP的双元转化载体(Hajdukiewicz等人，1994)。其它的示例性构建体包括pBin19(参见Frisch，D.A.，L.W.Harris-Haller等人，1995，Plant Molecular Biology 27：405-409)。

在本文中使用的术语“天然”、“天然蛋白质”或“天然结构域”指具有与野生型相同的主氨基酸序列的蛋白质或结构域。天然蛋白质或结构域可由与野生型序列有100％序列相似性的核苷酸序列编码。与野生型核苷酸序列相比，天然氨基酸序列也可由人类密码子(hCod)优化的核苷酸序列或包括提高的GC含量的核苷酸序列编码，前提是由HCoD-核苷酸序列编码的氨基酸序列显现出与天然氨基酸序列100％相同的序列同一性。

“人类密码子优化的”核苷酸序列或“hCod”核苷酸序列指选择适当的DNA核苷酸，使得寡核苷酸序列或其片段的合成方式接近在人类核苷酸序列的寡核苷酸序列中常现的密码子使用方式。“提高的GC含量”指为寡核苷酸序列或其片段的合成选择适当的DNA核苷酸，以接近与相应的天然寡核苷酸序列相比在寡核苷酸序列的编码部分的长度上包括提高的GC含量(例如从大约1％至大约30％、或者这些数值之间的任何量)的密码子使用方式。例如，在寡核苷酸序列的编码部分的长度上，GC含量大约为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30％、或这些数值之间的任何量。如下文所述，与非人类优化的(或较低GC含量的)核苷酸序列的表达相比，人类密码子优化的核苷酸序列或包括提高的GC含量的核苷酸序列(与野生型核苷酸序列相比)在植物、植物部分或植物细胞中表现出增强的表达。

在本文说明了一种经过修饰的流感病毒血凝素(HA)蛋白(又称为经过修饰的HA蛋白、经过修饰的流感病毒HA蛋白、经过修饰的HA、经过修饰的流感病毒HA、突变体HA、流感病毒突变体HA、流感病毒HA变异体或HA变异体)以及一种在植物中产生经过修饰的流感病毒血凝素蛋白的方法。与野生型血凝素或未经修饰的血凝素蛋白相比，本文所公开的经过修饰的流感病毒血凝素蛋白包括已发现会导致血凝素特性改善的修饰或突变。例如，与相应的野生型氨基酸序列相比，所述经过修饰的流感病毒血凝素蛋白可具有带有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。

经过修饰的血凝素蛋白的改善特性的例子包括：当在植物细胞中表达时，与不包括修饰或突变的相同流感毒株或亚型的野生型或未经修饰的血凝素相比，血凝素蛋白产量增加；与野生型或未经修饰的血凝素蛋白相比，经过修饰的血凝素蛋白的血凝效价提高；与包括不包含修饰或突变的野生型血凝素的VLP的完整性或稳定性或者完整性和稳定性相比，包括经过修饰的血凝素蛋白的VLP的完整性、稳定性或者完整性和稳定性提高；当在植物细胞中表达时，与不包含修饰或突变的野生型VLP的产量相比，VLP的产量增加；以及这些优点的组合。

流感病毒亚型和毒株

在本文中使用的术语“流感病毒亚型”指以血凝素(H或HA)和神经酰胺酶(N)病毒表面蛋白的各种组合为特征的甲型流感病毒变异体。根据本说明书，流感病毒亚型和来自这种病毒亚型的血凝素(HA)可按其H数字来指代，例如“H1亚型的HA”、“H1 HA”或“H1流感病毒”。术语“亚型”具体包括每个亚型中的所有个体“毒株”，它们通常是由突变引起的，并且可能表现出不同的致病特征。这种毒株也可称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，在本文中所用的术语“菌株”和“分离株”可互换使用。

传统上，不同的流感毒株例如是按照流感病毒凝集红细胞的能力分类的。特定流感病毒株的特异性抗体可与病毒结合，从而防止这种凝集。基于这种抑制作用确定菌株类型的试验通常称为血凝素抑制试验(HI试验或HAI试验)，并且在本领域中是表征流感毒株的众所周知的标准方法。

但是，来自不同毒株的血凝素蛋白在核酸和氨基酸水平上也表现出显著的序列相似性。在比较不同亚型的菌株时会发现，这种相似性水平有所不同，某些毒株明显显现出比其它毒株更高的相似性水平(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，78：7643)。不同亚型的毒株之间的氨基酸相似性水平不同(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，78：7643)。这种变化足以确定不同毒株的各个亚型和演化谱系，但是不同毒株的DNA和氨基酸序列仍然很容易使用常规的生物信息学技术进行比对(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，78：7643；Suzuki和Nei，Mol.Biol.Evol.2002，19：501)。

可对多个核苷酸序列或对应的血凝素多肽序列进行比对，以确定一个亚型的“共有部分”或“共有序列”(参见图1)。

基于序列相似性，可通过参照流感病毒亚型的系统发育组来对流感病毒亚型进一步分类。系统发育分析(Fouchier等人，J Virol.2005Mar；79(5)：2814-22)表明血凝素可在两个大组内细分(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，78：7643)：即，系统发育组1中的H1、H2、H5和H9亚型、以及系统发育组2中的H3、H4和H7亚型。

新的流感病毒血凝素蛋白、血凝素修饰、血凝素蛋白变异体和突变体是通过对血凝素蛋白的氨基酸序列进行改变而产生的，这种改变导致如上所述的血凝素特性改善。编码这种血凝素分子的核酸的分离是常规的，用于在氨基酸序列中引入变化的核酸修饰也是常规的，例如通过定点诱变进行。

本文说明了一种经过修饰的流感病毒血凝素蛋白以及一种在植物中产生经过修饰的流感病毒血凝素蛋白的方法。已经观察到，与野生型血凝素蛋白或未经修饰的血凝素蛋白相比，修饰(例如通过取代血凝素蛋白(例如来自H1亚型的血凝素)中的特定氨基酸来进行)导致经过修饰的血凝素蛋白的特性改善。

本文所述的血凝素蛋白的一个或多个修饰、突变或取代不位于血凝素蛋白的已知表位区域，这些修饰、突变或取代也不增加或去除血凝素蛋白内的糖基化位点。

本文中所述的血凝素蛋白、突变型血凝素蛋白或经过修饰的血凝素蛋白经过修饰，并在其氨基酸序列中在与A/Michigan/45/15血凝素(序列号134；参见图1)或A/California/07/09血凝素(序列号130；参见图1)的位置97、374、380、390或429处的氨基酸对应的任何一个或多个氨基酸处包括一个或多个突变、修饰或取代。

“与一个氨基酸对应”或“对应于一个氨基酸”指在如下所述的与流感病毒参考株的序列比对中一个氨基酸与另一个氨基酸对应。

血凝素的氨基酸残基号或残基位置与流感病毒参考株的血凝素的编号一致。例如，在H1流感病毒的情况下，参考毒株可能是A/Michigan/45/15血凝素(序列号134；参见图1)或A/California/07/09血凝素(序列号130；参见图1)。对应的氨基酸位置可通过将血凝素(例如H1血凝素)的序列与其相应的参考毒株的血凝素的序列进行比对来确定。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。可进行用于比较的最佳序列比对，例如通过Smith和Waterman在Adv.Appl.Math.2：482(1981)中公布的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch在J.Mol.Biol.48：443(1970)中公布的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman在Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)中公布的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(位于美国威斯康辛州麦迪逊市科学区575号的Genetics ComputerGroup公司的Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过手动比对和目视检查(例如参见Ausubel等人编著的1995年增补版《分子生物学实验指南》)进行。在图1中示出了多个甲型流感病毒血凝素结构域的氨基酸序列比对，这些示例不应视为是限制性的。

在指代修饰、突变体或变异体时，在野生型氨基酸残基(又简称为“氨基酸”)后面加上残基号和新的或取代的氨基酸。例如，天冬氨酸(D，Asp)取代残基或氨基酸中的位置97处的天冬酰胺(N，Asn)被命名为N97D(参见表1)。

经过修饰的血凝素、血凝素突变体或变异体(例如经过修饰的H1血凝素)按照相同的方式通过使用野生型残基的单字母氨基酸代码随后加上其位置和替换残基的单字母氨基酸代码来命名。多个突变体通过由斜线(/)或加号(+)分隔的各个成分单突变体来表示。因此，例如，H1血凝素突变体N380A/L429M是一种双取代突变体，其中丙氨酸(A，Ala)在残基位置380处取代天冬酰胺(N，Asp)，并且蛋氨酸(M，Met)在残基位置429处取代亮氨酸(L，Leu)；H1血凝素突变体蛋白N380A/F390D是一种双取代变异体，其中丙氨酸(A，Ala)在H1血凝素中的位置380处取代天冬酰胺(N，Asn)，并且天冬氨酸(D，Asp)在位置处取代苯丙氨酸(F，Phe)。

表1.血凝素中的修饰的位置和H1和H5流感参考毒株中的对应的氨基酸/残基位置。示例性的修饰在括号中示出。

¹ A/Michigan/45/15或A/California/07/09

²A/Indonesia/05/05

与相应的野生型氨基酸序列相比，所述经过修饰的流感病毒血凝素(HA)蛋白可包括具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列。

“氨基酸取代”或“取代”指用不同的氨基酸替换蛋白质氨基酸序列中的某个氨基酸。术语“氨基酸”、“氨基酸残基”或“残基”在本公开中可互换使用。一个或多个氨基酸可被一个或多个与该位置的原始或野生型氨基酸不同的氨基酸替换，而不会改变蛋白质氨基酸序列的总长度。这种取代或替换可通过将在核苷酸序列中对蛋白质进行编码的密码子序列改变为与原始或野生型氨基酸相比不同的氨基酸的密码子序列来实验性诱导。得到的蛋白是经过修饰的蛋白，例如经过修饰的流感病毒血凝素蛋白。经过修饰的流感血凝素蛋白不是天然存在的。

经过修饰的血凝素包括非天然存在的血凝素蛋白，具有至少一个对天然存在的血凝素的修饰，并且与作为所述经过修饰的血凝素的氨基酸序列的来源的天然存在的血凝素蛋白相比具有改善的特性。经过修饰的血凝素蛋白具有在自然界中找不到的氨基酸序列，该氨基酸序列是通过使用一个或多个不同的氨基酸替换血凝素蛋白的一个或多个氨基酸残基而衍生出的。

因此，经过修饰的血凝素、突变体血凝素或重组血凝素指其中的对天然存在的血凝素进行编码的DNA序列被修饰以产生对血凝素氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的修饰、突变或取代进行编码的经过修饰的或突变的DNA序列的血凝素。

一些被确定为用于修饰、突变或取代的残基与保守残基对应，而另一些则不是。在非保守残基的情况下，一个或多个氨基酸的替换仅限于产生具有与自然界中发现的氨基酸序列不对应的氨基酸序列的经过修饰的血凝素的取代。在保守残基的情况下，这种修饰、取代或替换也不应导致天然存在的血凝素序列。

保守取代

如本文所述，血凝素蛋白中的残基可被识别和修饰、取代或突变，以产生经过修饰的血凝素蛋白或血凝素蛋白变异体。特定位置处的取代或突变不限于在本文中说明的或在实施例中给出的氨基酸取代。例如，血凝素变异体可包含所述氨基酸取代的保守型取代。

在本文中所用的术语“保守取代”及其语法变化形式指在血凝素蛋白的序列中存在与所述取代或所述残基不同但属于同一类氨基酸的氨基酸残基(即，取代非极性残基的非极性残基、取代芳香族残基的芳香族残基、取代极性不带电荷残基的极性不带电荷残基、取代带电荷残基的带电荷残基)。此外，保守取代可涵盖与取代野生型残基的残基具有相同符号和大致相似的量级的界面亲水性值的残基。

在本文中所用的术语“非极性残基”指甘氨酸(G，Gly)、丙氨酸(A，Ala)、缬氨酸(V，Val)、亮氨酸(L，Leu)、异亮氨酸(I，Ile)和脯氨酸(P，Pro)；术语“芳香族残基”指苯丙氨酸(F，Phe)、酪氨酸(Y，Tyr)和色氨酸(W，Trp)；术语“极性不带电荷的残基”指丝氨酸(S，Ser)、苏氨酸(T，Thr)、半胱氨酸(C，Cys)、蛋氨酸(M，Met)、天冬酰胺(N，Asn)和谷氨酰胺(Q，Gln)；术语“带电荷的残基”指带负电荷的氨基酸天冬氨酸(D，Asp)和谷氨酸(E，Glu)，以及带正电荷的氨基酸赖氨酸(K，Lys)、精氨酸(R，Arg)和组氨酸(H，His)。氨基酸的其它分类如下：

·具有疏水侧链的氨基酸(脂肪族)：丙氨酸(A，Ala)、异亮氨酸(I，Ile)、亮氨酸(L，Leu)、蛋氨酸(M，Met)和缬氨酸(V，Val)；

·具有疏水侧链的氨基酸(芳香族)：苯丙氨酸(F，Phe)、色氨酸(W，Trp)、酪氨酸(Y，Tyr)；

·具有极性中性侧链的氨基酸：天冬酰胺(N，Asn)、半胱氨酸(C，Cys)、谷氨酰胺(Q，Gln)、丝氨酸(S，Ser)和苏氨酸(T，Thr)；

·具有带电荷的侧链的氨基酸(酸性)：天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酸(E，Glu)；

·具有带电荷的侧链的氨基酸(碱性)：精氨酸(R，Arg)；组氨酸(H，His)；赖氨酸(K，Lys)、甘氨酸G，Gly)和脯氨酸(P，Pro)。

保守的氨基酸取代可能对所得到的血凝素蛋白变异体或经过修饰的血凝素蛋白的活性具有与原始取代或修饰相似的影响。关于保守取代的更多信息例如可在Ben Bassat等人(J.Bacteriol，169：751-757，1987)、O′Regan等人(Gene，77：237-251，1989)、Sahin-Toth等人(Protein ScL，3：240-247，1994)、Hochuli等人(Bio/Technology，6：1321-1325，1988)的论文以及广泛使用的遗传学和分子生物学教科书中找到。

通常使用Blosum矩阵来确定多肽序列的相关性。Blosum矩阵是使用大型可信比对数据库(BLOCKS数据库)创建的，其中计入了相关性低于某个同一性阈值百分比的成对序列的比对(Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)。对于BLOSUM90矩阵的高度保守的目标频率，使用90％同一性阈值。对于BLOSUM65矩阵，使用65％同一性阈值。Blosum矩阵中的零分以上的分值被视为在所选的百分比同一性下的“保守替换”。下面的表2示出了示例性的保守氨基酸取代。

表2.示例性的保守氨基酸取代

可针对人类密码子的使用、提高的GC含量、或者它们的组合优化对经过修饰的血凝素蛋白编码的核苷酸序列。经过修饰的血凝素蛋白可在植物、植物部分或植物细胞中表达。

H1血凝素的修饰

本文说明了一种经过修饰的H1流感病毒血凝素蛋白以及一种在植物中产生经过修饰的H1流感病毒血凝素蛋白的方法。已经观察到，与野生型H1血凝素蛋白或未经修饰的H1血凝素蛋白相比，来自H1亚型的血凝素蛋白中的特定氨基酸的修饰导致经过修饰的H1血凝素蛋白的特性改善。

为了改善H1血凝素蛋白的特性，总共测试了42种单修饰、双修饰和/或三修饰。如本文所述和示例所示，只有特定位置处的修饰或修饰的组合改善了H1血凝素蛋白的特性。32个位置或这些位置的组合处的修饰对H1血凝素蛋白的特性有不良影响(数据未示出)。

H1血凝素突变体蛋白的改善特性的例子包括：当在植物细胞中表达时，与不包含修饰或突变的相同流感毒株或亚型的野生型或未经修饰的H1血凝素相比，血凝素蛋白的产量或积累量增加；与野生型或未经修饰的H1血凝素蛋白相比，经过修饰或突变的血凝素蛋白的血凝效价提高；与包括不包含突变的野生型血凝素的VLP的完整性或稳定性或者完整性和稳定性相比，包括经过修饰的H1血凝素蛋白的VLP的完整性、稳定性或者完整性和稳定性提高；当在植物细胞中表达时，与不包含修饰或突变的野生型VLP的产量相比，VLP的产量增加；以及这些优点的组合。

本文所述的经过修饰的H1血凝素蛋白或突变的H1血凝素蛋白经过修饰，并且在与A/California/07/09血凝素(序列号130；参见图1)的位置97、374、380、390和/或429序列对位的任何一个或多个残基处包括一个或多个突变或修饰。因此，提供了一种H1流感病毒血凝素多肽、蛋白和/或蛋白复合物，例如病毒样微粒(VLP)，该VLP在氨基酸位置97、374、380、390和/或429中的一个或多个处包括修饰或突变(这种氨基酸编号基于如图1所示的A/California/07/09血凝素的序列(序列号130))，或者在与这种氨基酸位置对应的氨基酸位置处包括修饰或突变，这例如是通过H1血凝素氨基酸序列与序列号130的比对来确定的。包括一个或多个此类突变的H1流感病毒血凝素氨基酸序列的非限制性例子包括序列号131、132、133、134、135、138和139。

本文所述的经过修饰的H1血凝素蛋白包括具有与对来自H1的血凝素进行编码的氨基酸序列(序列号130、131、132、133、134、135、138或139)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或这些数值之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列的H1血凝素蛋白，其中所述氨基酸序列在与A/California/07/09血凝素(序列号130)的位置97、374、380、390和429序列对位的任何一个或多个残基处具有一个或多个突变或修饰，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

此外，所述H1血凝素蛋白可由与对来自H1的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号130、131、132、133、134、135、138或139)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或这些数值之间的任何量的序列同一性或序列相似性的核苷酸序列编码，其中所述H1氨基酸序列在与A/California/07/09血凝素的位置97、374、380、390和429序列对位的任何一个或多个残基处具有一个或多个突变或修饰，并且其中所述核苷酸序列对在表达时形成VLP的血凝素蛋白进行编码。

可从其衍生出H1血凝素的毒株的非限制性例子有A/California/07/09(H1N1，序列号130)、A/Michigan/45/15(H1N1，序列号134)、A/Massachusetts/06/17(H1N1，序列号135)、A/Costa Rica/0513/16(H1N1，序列号133)、A/Honduras/17734/16(H1N1，序列号131)、A/Darwin/11/15(H1N1，序列号132)、A/Paris/1227/2017(序列号138)或A/Norway/2147/2017(序列号139)。

所述经过修饰的或突变的H1血凝素在位置97、374、380、390或429的残基处可以是单取代、双取代、三取代或四取代的。在单取代的H1血凝素中，一个残基可在位置97、374、380、390或429处突变。在双取代的H1血凝素中，两个残基可被取代，例如位置380和429、97和374或390和429处的残基可被取代。在三取代的H1血凝素突变体中，三个残基可被取代。例如，位置97、390和429处的残基或位置97、374和429处的残基可被取代。在四取代的H1血凝素突变体中，四个残基可被取代。例如，位置97、374、390和429处的残基可被取代。(所有H1血凝素编号是根据与参考毒株A/California/07/09血凝素的序列比对确定的)。

经过修饰的H1血凝素蛋白的非限制性例子与H1血凝素野生型序列相比在血凝素序列中包括以下修饰或突变(按照A/California/07/09血凝素编号)：

·单取代的H1血凝素突变体.：N97D、K374E、F390D或L429M；

·双取代的H1血凝素突变体：N390A/L429M、N97D/K374E或N380/1 429M；

·三取代的H1血凝素突变体：N97D/F390D/L429M或K374E/F390D/1 429M；

·四取代的H1血凝素突变体：N97D/K374E/F390D/L429M。

本文所述的一种或多种突变特异性地增加了植物中的流感病毒血凝素蛋白的产量和VLP产量。已观察到，其它位置处的突变显著减少流感病毒血凝素蛋白在植物细胞中的积累量或VLP产量，或者对其没有显著影响。

单取代的H1血凝素

位置97处的修饰

在本公开的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置97处具有经过修饰的残基。该残基不参与血凝素的受体结合，并且已证明，该残基位于血凝素的球状头部的残留酯酶(VE)亚结构域之一中。X光晶体学分析表明，该残基埋在血凝素三聚体中。因此，该残基不是抗原位点的一部分，不参与抗原变化，也不被广泛中和抗体识别。

在甲型(H1N1)pdm09流感病毒中，该残基被预测为与血凝素的稳定性有关(参见Castelán-Vega等人，2014)。但是，Castelán-Vega等人指出单点突变似乎对血凝素的稳定性影响不大，并引用了Yang等人的论文(甲型(H1N1)pdm09流感病毒血凝素的结构稳定性，J.Virol.2014；88(9)：4828-4838)。Yang等人采用重组血凝素外域的尺寸排阻色谱分析来比较2009年早期流行的H1N1病毒的重组三聚体血凝素蛋白(可分解为单体)与最近的病毒的重组三聚体血凝素蛋白(可表达为三聚体)之间的差异。Yang等人发现A/Texas/1/2011(Tex 11)与针对序列差异研究的四种其它A(H1N1)pdm09病毒株相比在血凝素中具有独特的Asp97Asn(D97N)取代。但是，此后进化的H1血凝素流感病毒株在位置97处有天冬酰胺(N，Asn)(参见图1，H1序列比对)，这表明H1血凝素病毒株在此位置有天冬酰胺(N，Asn)的进化优势。因此，意想不到的是，从位置97处的天冬酰胺(N，Asn)到非天冬酰胺的修饰导致了本文所述的H1血凝素蛋白特性的改善。

如图3A、3B、4A和4B所示，在位置97处具有例如从天冬酰胺(N，Asn)变为天冬氨酸(AspD)(以下称为N97D)的残基的H1血凝素与在该位置具有天冬酰胺(N，Asn)的H1血凝素相比显现出高达1200％的血凝效价提高(参见表5A)。图3A表明，与A/Michigan/45/15 HA野生型(又称为H1Michigan)相比，来自带有N97D取代的A/Michigan/45/15的血凝素显现出大约1100％的血凝效价提高。与野生型A/Honduras/17734/16血凝素相比，来自带有N97D取代的A/Honduras/17734/16的血凝素的血凝效价提高了大约375％(参见图4A和4B)。此外，如图4A和4B所示，与野生型A/Darwin/11/15血凝素相比，来自带有N97D取代的A/Darwin/11/15的血凝素的血凝效价提高了大约300％。

因此，在一个方面中，可对H1血凝素的位置97处的残基(按照A/California/07/09血凝素编号进行编号)进行修饰，以在位置97处使用极性氨基酸替换带电荷的氨基酸，从而产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置97处包含天冬氨酸(D，Asp)或任何其它极性氨基酸，例如谷氨酰胺(Q，Gln)、组氨酸(H，His)、丝氨酸(S，Ser)、苏氨酸(T，Thr)、酪氨酸(Y，Tyr)、半胱氨酸(C，Cys)或色氨酸(W，Trp)。

可对H1血凝素进行修饰，用位置97处的非天冬酰胺替换位置97处的天冬酰胺。例如，血凝素蛋白可突变为在位置97处包含天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守取代例如可以是谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。此外，可对H1血凝素进行修饰，在位置97处用天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代替换非天冬氨酸(D，Asp)。该保守的天冬氨酸取代例如可以是谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1的血凝素的氨基酸序列(序列号134)具有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本说明书还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置97处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与对来自H1的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基97进行编码的核苷酸密码子对位置97处的天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，并且其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基97如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是单取代、双取代、三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置97处的残基被修饰。在非限制性示例中，所述经过修饰的H1血凝素可在位置97处具有取代残基，并在位置374、390、429或者它们的组合处具有一个或多个取代基，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置97处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置97处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置97处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本公开提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

位置374处的修饰

在本公开的一个方面中，可取代H1血凝素中的位置374处的残基(按照A/California/07/09血凝素编号进行编号)。该残基位于H1血凝素的茎部中。

Cotter等人(PLoS Pathog.2014；10(1)：e1003831)确定，在A/California/7/2009血凝素的茎部结构域中的E47K(HA2编号)突变稳定了三聚体结构，降低了膜融合的pH值，并提高了病毒的热稳定性和酸稳定性。Cotter中的H1N1的HA2柄部结构域的位置47相当于本公开中的位置374(A/California/7/2009的HA0编号)。Cotter等人还观察到，A/California/7/2009 E47K突变体血凝素在雪貂中比其野生型对应物更具传染性。Yang等人也在2014年得到了类似的结果(J.Virol.May 2014 vol.88 NO.，94828-4838)，他表明，通过在位置374将谷氨酸改变为赖氨酸而在位置374处引入碱性侧链改变，有可能形成横跨与相邻链上的Glu 21的单体接口的新盐桥，从而提高在较低pH下的稳定性。杨等人发现位置374处的赖氨酸的存在将突变型Tex09外域三聚体抵抗热和酸度变化的能力增强到与Wash11 recHA的能力相当的水平。

但是，意外地发现，与表达野生型H1血凝素的植物提取物相比，例如在H1Michigan流感病毒(A/Michigan/45/15(H1N1))的血凝素的位置374(K374E)处用谷氨酸(E，Glu)替换赖氨酸(K，Lys)会导致血凝效价提高大约1200％(参见图3A、3B、4A、4B和表5A)。

因此，在一个方面中，可对H1血凝素的位置374处的残基(按照A/California/07/09血凝素编号进行编号)进行修饰，以在位置374处使用谷氨酸替换非谷氨酸，从而产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。可对该H1血凝素进行修饰，用谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))代替非谷氨酸。此外，在位置374处可使用非赖氨酸取代赖氨酸(K，Lys)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，在位置374处可使用谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))取代赖氨酸(K，Lys)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 Michigan的血凝素的氨基酸序列(A/Michigan/45/15，序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本说明书还提供了一种核酸，该核酸包括对在位置374处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1Michigan的血凝素进行编码的核苷酸序列(A/Michigan/45/15，序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Ash)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))的血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对氨基酸残基374进行编码的核苷酸密码子对谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基374如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是单取代、双取代、三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置374处的残基被修饰。在非限制性示例中，所述经过修饰的H1血凝素可在位置374处具有取代残基，并在位置97、390、429或者它们的组合处具有一个或多个取代基，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的。

此外，本说明书提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括在位置374处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置374处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置374处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置374处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置374处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

位置390处的修饰

在本公开的一个方面中，可取代H1血凝素中的位置390处的残基(按照A/California/07/09血凝素编号进行编号)。

Lu等人的WO2013/177444及其配套文献(Proc Natl Acad Sci USA.2014；111(1)：125-30)报告了一种使用基于大肠杆菌的无细胞蛋白质表达系统和简单的重折叠方案从A/California/05/2009(H1N1)产生正确折叠的血凝素茎结构域的方法。为了诱导血凝素茎结构域的三聚化，将氯霉素乙酰转移酶(CAT)或折叠结构域融合到血凝素的碳末端上。为了减轻新暴露的疏水性和/或导致表达的血凝素茎蛋白聚集的分子间离子配对，评估了五组突变：M1(I69T+I72E+I74T+C77T)；M2(I69T+I72E+I74T+C77T+F164D)；M3(I69T+I72E+I74T+C77T+F164D+L174D)；M4(F164D)；以及M5(F164D+L174D)。Lu指出，突变体的可溶性产量很低，并且形成了不溶性包涵体。Lu还指出，与野生型的其它变异体相比，突变型M3和M5产生的聚集体少得多，因此进一步发展出了突变型M5(F164D+L174D)。Lu观察到，M5(F164D+L174D)突变似乎是对提高血凝素茎蛋白溶解度影响最大的突变。Lu的位置164相当于本公开中的位置390。Lu的M4(F164D)突变并没有显现出优于所测试的其它突变的优势，实际上不如突变型M3(I69T+I72E+I74T+C77T+F164D+L174D)和M5(F164D+L174D)。

当在本公开的H1血凝素中改变与Lu的M5(F164D+L174D)的位置164处的苯丙氨酸和位置174处的亮氨酸对应的位置390处的苯丙氨酸(F，Phe)和位置400处的亮氨酸(L，Leu)(H1血凝素编号)时，没有观察到VLP产量的增加，并且H1 F390D+L400D突变体显现出完全丧失血凝活性(数据未示出)。因此，Lu中的M5突变体的等同突变没有导致在植物中表达的血凝素的特性的改善。

出乎意料地发现，当H1血凝素中的位置390处的疏水型氨基酸被带电荷的氨基酸取代时，与用野生型构建体浸润的植物相比，在碘克沙醇梯度纯化后，从表达在位置390处具有取代的H1血凝素的植物观察到VLP产量增加了大约60％(参见图3B、4A、4B、表5A、5B)。此外，如表5C所示，全过程产量增加到226％。但是，来自H5的血凝素(F393D)中的等同修饰导致血凝效价降低(参见图5、表6)。

因此，在一个方面中，可对H1血凝素的位置390处的残基(按照A/California/07/09血凝素编号进行编号)进行修饰，以在位置390处使用带电荷的氨基酸替换疏水性氨基酸，从而产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置390处包含天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守的天冬氨酸取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)取代。

可对所述H1血凝素进行修饰，在位置390处用天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代替换非天冬氨酸。该保守的天冬氨酸取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)取代。此外，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置390处用非苯丙氨酸替换苯丙氨酸(F，Phe)。例如，可对血凝素蛋白进行修饰，使其在位置390处包含天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守的天冬氨酸取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)取代。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 A/Michigan/45/15的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本公开还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置390处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基390进行编码的核苷酸密码子对位置390处的天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基390如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是单取代、双取代、三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置390处的残基被修饰。在非限制性示例中，所述经过修饰的H1血凝素可在位置390处具有取代残基，并在位置97、374、380、429或者它们的组合处具有一个或多个取代基。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置390处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置390处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置390处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置390处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置390处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

位置429处的修饰

在本公开的一个方面中，可对H1血凝素中的位置429处的残基(按照H1 A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)进行修饰。

Antanasijevic等人(J Biol Chem.2014；289(32)：22237-45)通过在14个不同位置处的定点诱变研究了H5血凝素的茎环结构域的结构-功能特性。Antanasijevic观察到HA1-D26K、HA1-M102L、HA2-V52A和HA2-I55A突变体(基于H3编号)表现出显著降低的总血凝素水平，这表明血凝素在病毒微粒中的表达和/或组装减少。与野生型病毒相比，HA1-D26K、HA2-T49A和HA2-M102L突变体还表现出较低的血凝效价。Antanasijevic的H5的血凝素中的位置102与本说明书的H1血凝素中的位置429对应。

在对H1的血凝素进行修饰以在V19I(HA1-I28V)、L20M(HA1-M31L)、T368A(HA2-T41A)、N380A(HA2-N53A)或L429M(HA2-M102L)处引入改变时，发现T368A导致活性完全丧失，V19I和L20M具有较低的活性，而N380A和L429M显现出比H1 A/California野生型血凝素高的活性。

因此，由Antanasijevic确定的对来自H5的血凝素的表达和/或组装或血凝效价具有重要意义的大多数残基似乎没有转化为在来自H1的血凝素中具有类似的重要性。

但是，如图2A、2B、2C、3B、4A和4B所示，当H1血凝素中的残基429从亮氨酸(L，Leu)突变为蛋氨酸(M，Met)时，与野生型H1血凝素相比，经过修饰的H1血凝素显现出血凝效价提高(100-160％)(参见表5A)。此外，如图2C所示，与用野生型构建体浸润的植物相比，在蔗糖梯度纯化后，在位置429处具有取代的表达H1血凝素的植物显现出大约30％的VLP产量增加(参见表5B)。此外，如表5C所示，全过程产量增加到260％。

此外，与未经修饰的H1血凝素(参见图2B)相比，位置390处的苯丙氨酸被修饰为天冬氨酸并且位置429处的亮氨酸被修饰为蛋氨酸的双取代H1血凝素表现出大约60％的血凝效价提高。

因此，在一个方面中，可对H1血凝素的位置429处的残基(按照H1A/Michigan/45/15氨基酸序列(序列号134)进行编号)进行修饰，用亮氨酸之外的另一种疏水型氨基酸取代位置429处的亮氨酸(L，Leu)，从而产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

此外，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置429处用非亮氨酸替换亮氨酸。例如，所述血凝素蛋白可突变为在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代。所述保守的蛋氨酸取代例如可以是异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。此外，可对所述血凝素蛋白进行修饰，在位置429处用蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代替换非蛋氨酸。所述保守的蛋氨酸取代例如可以是异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1Michigan的血凝素的氨基酸序列(A/Michigan/45/15(H1N1)，序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本公开还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基429进行编码的核苷酸密码子对位置429处的蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基429如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是单取代、双取代、三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置429处的残基被修饰。在非限制性示例中，所述经过修饰的H1血凝素可在位置429处具有取代残基，并在位置97、374、380、390或者它们的组合处具有一个或多个取代基。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置429处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

双取代的H1血凝素

还提供了一种包括至少一个双取代或双修饰的H1血凝素蛋白。因此，所述H1血凝素蛋白具有至少两个来自野生型H1血凝素蛋白的修饰。例如，所述H1血凝素可具有下列经过修饰的残基的任何两种组合：97、374、380、390和429(按照A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)。

位置380和429的修饰

在本说明书的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置380和429处具有经过修饰的残基。

如图3B所示，与野生型H1血凝素相比，在位置380处具有从天冬酰胺修饰为丙氨酸的残基并在位置429处具有从亮氨酸修饰为蛋氨酸的残基的H1血凝素的血凝效价大约提高了800％(参见表5A)。

因此，在一个方面中，可修饰所述H1血凝素的位置380和429处的残基(按照H1A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)，在位置380处用非天冬酰胺替换天冬酰胺(N，Asn)，在位置429处用非亮氨酸替换亮氨酸(L，Leu)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置380处用疏水型氨基酸替换极性氨基酸，在位置429处用除了亮氨酸之外的另一种疏水型氨基酸替换亮氨酸(L，Leu)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。

例如，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置380处包含丙氨酸或保守的丙氨酸取代。所述保守的丙氨酸取代例如可以是丝氨酸(S，Ser)、甘氨酸(G，Gly)、苏氨酸(T，Thr)、半胱氨酸(C，Cys)或缬氨酸(V，Val)。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置380处具有丙氨酸或保守的丙氨酸取代，例如丝氨酸(S，Ser)、甘氨酸(G，Gly)、苏氨酸(T，Thr)、半胱氨酸(C，Cys)或缬氨酸(V，Val)，并且所述氨基酸序列在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本说明书还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置380和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置380处具有丙氨酸或保守的丙氨酸取代(例如丝氨酸(S，Ser)、甘氨酸(G，Gly)、苏氨酸(T，Thr)、半胱氨酸(C，Cys)或缬氨酸(V，Val))并且在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基380进行编码的核苷酸密码子对丙氨酸或保守的丙氨酸取代(例如丝氨酸(S，Ser)、甘氨酸(G，Gly)、苏氨酸(T，Thr)、半胱氨酸(C，Cys)或缬氨酸(V，Val))进行编码，并且所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基429进行编码的核苷酸密码子对蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置380和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置380和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置380和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置380和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置380和429处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

位置390和429的修饰

在本公开的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置390和429处具有经过修饰的残基。

如图2B、3B、4A、4B和表5A所示，与野生型H1血凝素相比，在位置390处具有从苯丙氨酸修饰为天冬氨酸的残基并在位置429处具有从亮氨酸修饰为蛋氨酸的残基的H1血凝素的血凝效价大约提高了400-1200％。此外，如表5C所示，全过程产量增加到633％。

因此，在一个方面中，可修饰所述H1血凝素的位置390和429处的残基(按照H1A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)，在位置390处用非苯丙氨酸替换苯丙氨酸(F，Phe)，在位置429处用非亮氨酸替换亮氨酸(L，Leu)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置390处用带电荷的氨基酸替换疏水型氨基酸，在位置429处用除了亮氨酸之外的另一种疏水型氨基酸替换亮氨酸(L，Leu)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。

例如，可对H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置390处包含天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))，并且所述氨基酸序列在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本说明书还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))并且在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基390进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，并且所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基429进行编码的核苷酸密码子对蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基390和429如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是双取代、三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置390和429处的残基被修饰。在非限制性示例中，所述经过修饰的H1血凝素可在位置390和429处具有取代残基，并在位置97、374、380或者它们的组合处具有一个或多个取代基。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置390和429处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

位置97和374的修饰

在本公开的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置97和374处具有经过修饰的残基。

如图3B和表5A所示，与野生型H1血凝素相比，在位置97处具有从天冬酰胺修饰为天冬氨酸的残基并在位置374处具有从赖氨酸修饰为谷氨酸的残基的H1血凝素表现出大约1200％的血凝效价提高。

因此，在一个方面中，可修饰所述H1血凝素的位置97和374处的残基(按照H1A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)，在位置97处用非天冬酰胺替换天冬酰胺(N，Asn)，在位置374处用非赖氨酸替换赖氨酸(K，Lys)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置97处用极性氨基酸替换带电荷的氨基酸，在位置374处用除了赖氨酸(K，Lys)之外的另一种带电荷的氨基酸替换带电荷的氨基酸，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。

例如，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置97处包含天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守取代例如可以是谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置374处包含谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)，并且所述氨基酸序列在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本说明书还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置97和374处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))并且在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基97进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，并且所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基374进行编码的氨基酸密码子对谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基97和374如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是双取代、三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置97和374处的残基被修饰。在非限制性示例中，所述经过修饰的H1血凝素可在位置97和374处具有取代残基，并在位置380、390和429或者它们的组合处具有一个或多个取代基。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置97和374处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97和374处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置97和374处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97和374处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置97和374处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

三取代的H1血凝素

位置97、390和429处的修饰

还提供了一种包括至少一个三取代或三修饰的H1血凝素蛋白。因此，所述H1血凝素蛋白具有至少三个来自野生型H1血凝素蛋白的修饰。例如，所述H1血凝素可具有下列经过修饰的残基的任何三种组合：97、374、390和429(按照A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)。

在本说明书的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置97、390和429处具有经过修饰的残基。

例如，如图3B、4A和4B所示，与野生型H1血凝素相比，在位置90处具有从天冬酰胺修饰为天冬氨酸的残基、在位置390处具有从苯丙氨酸修饰为天冬氨酸的残基、并且在位置429处具有从亮氨酸修饰为蛋氨酸的H1血凝素表现出大约2600％的血凝效价提高。此外，如表5C所示，全过程产量增加到647％。

因此，在一个方面中，可修饰所述H1血凝素的位置97、390和429处的残基(按照H1A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)，在位置97处用非天冬酰胺替换天冬酰胺(N，Asn)，在位置390处用非苯丙氨酸替换苯丙氨酸(F，Phe)、并且在位置429处用非亮氨酸(L，Leu)替换亮氨酸，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置97处用带电荷的氨基酸替换极性氨基酸，在位置390处用待电荷的氨基酸替换疏水型氨基酸，并且在位置429处用除了亮氨酸之外的另一种疏水型氨基酸替换亮氨酸，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。

例如，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置97处包含天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守的天冬氨酸取代例如可以是谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。所述经过修饰的血凝素蛋白还可在位置390处包含天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守的天冬氨酸取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)取代。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)，所述氨基酸序列在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸Ser)，并且所述氨基酸序列在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本公开还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置97、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))，在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸Ser))，并且在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基97进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基390进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸Ser))进行编码，并且所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基429进行编码的核苷酸密码子对位置429处的蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基97、390和429如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置97、390和429处的残基被修饰。在非限制性实例中，经过修饰的H1血凝素可在位置97、390、429和374处具有取代残基。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置97、390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置97、390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置97、390和429处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

位置374、390和429的修饰

在本公开的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置374、390和429处具有经过修饰的残基。

例如，如图3B所示，与野生型H1血凝素相比，在位置374处具有从赖氨酸修饰为谷氨酸的残基、在位置390处具有从苯丙氨酸修饰为天冬氨酸的残基、并且在位置429处具有从亮氨酸修饰为蛋氨酸的H1血凝素表现出大约2500％的血凝效价提高。此外，如表5C所示，全过程产量增加到689％。

因此，在一个方面中，可修饰所述H1血凝素的位置374、390和429处的残基(按照H1A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)，在位置374处用非赖氨酸替换赖氨酸(K，Lys)，在位置390处用非苯丙氨酸替换苯丙氨酸(F，Phe)、并且在位置429处用非亮氨酸替换亮氨酸，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置374处用除了赖氨酸之外的带电荷的氨基酸替换赖氨酸，在位置390处用带电荷的氨基酸替换疏水型氨基酸，在位置429处用除了亮氨酸之外的另一种疏水型氨基酸替换亮氨酸(L，Leu)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。

例如，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置374处包含谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)。所述经过修饰的血凝素蛋白还可在位置390处包含天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)，所述氨基酸序列在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸Ser)，并且所述氨基酸序列在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本发明书还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置374、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))、在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸Ser))、并且在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基374进行编码的核苷酸密码子对谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基390进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸Ser))进行编码，并且所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基429进行编码的核苷酸密码子对蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基374、390和429如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是三取代或四取代的H1血凝素，其中至少位置374、390和429处的残基被修饰。在非限制性实例中，经过修饰的H1血凝素可在位置374、390、429和97处具有取代残基。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置374、390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置374、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置374、390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置374、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置374、390和429处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

四取代的H1血凝素

位置97、374、390和429处的修饰

还提供了一种包括至少一个四取代或四修饰的H1血凝素蛋白。因此，所述H1血凝素蛋白具有至少四个来自野生型H1血凝素蛋白的修饰。例如，所述H1血凝素可在位置97、374、390和429处具有修饰(按照H1A/Michigan/45/15(序列号134)进行编号)。

因此，在本说明书的一个方面中，所述经过修饰的H1血凝素可至少在位置97、374、390和429处具有经过修饰的残基。

例如，如图3B所示，与野生型H1血凝素相比，在位置97处具有从天冬酰胺修饰为天冬氨酸的残基、在位置374处具有从赖氨酸修饰为谷氨酸的残基、在位置390处具有从苯丙氨酸修饰为天冬氨酸的残基、并且在位置429处具有从亮氨酸修饰为蛋氨酸的H1血凝素表现出大约3300％的血凝效价提高。

因此，在一个方面中，可修饰H1血凝素的位置97、374、390和429处的残基(按照A/California/07/09血凝素进行编号)，在位置97处用非天冬酰胺替换天冬酰胺(N，Asn)，在位置374处用非赖氨酸替换赖氨酸，在位置390处用非苯丙氨酸替换苯丙氨酸(F，Phe)、并且在位置429处用非亮氨酸替换亮氨酸，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。例如，可对所述H1血凝素进行修饰，在位置97处带电荷的氨基酸替换极性氨基酸，在位置374处用除了赖氨酸之外的带电荷的氨基酸替换赖氨酸，在位置390处用带电荷的氨基酸替换疏水型氨基酸，并且在位置429处用除了亮氨酸之外的另一种疏水型氨基酸替换亮氨酸(L，Leu)，以产生具有非天然存在的序列的经过修饰的H1血凝素。

例如，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置97处包含天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守的天冬氨酸取代例如可以是谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置374处包含谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)。所述经过修饰的血凝素蛋白还可在位置390处包含天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代。该保守的天冬氨酸取代例如可以是天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)取代。此外，可对所述H1血凝素蛋白进行修饰，使其在位置429处包含蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V，Val)或苯丙氨酸(F，Phe)。

例如，所述经过修饰的H1血凝素蛋白可具有与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素的氨基酸序列(序列号134)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)，所述氨基酸序列在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代，例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser)，所述氨基酸序列在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代，例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser)，并且所述氨基酸序列在位置429处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代，例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V、Val)或苯丙氨酸(F，Phe)，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

本发明书还提供了一种核酸，该核酸包括对如上所述的在位置97、374、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核苷酸序列。

例如，所述核苷酸序列可与来自H1 A/Michigan/45/15(H1N1)的血凝素进行编码的核苷酸序列(序列号136)有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列对在位置97处具有天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))、在位置374处具有谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))、在位置390处具有天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))、并且在位置390处具有蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V、Val)或苯丙氨酸(F，Phe))的经过修饰的H1血凝素蛋白进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

所述核苷酸序列可与序列号136的核苷酸序列有大约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性，其中所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基97进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或者除了天冬酰胺(N，Asn)之外的保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基374进行编码的核苷酸密码子对位置374处的谷氨酸(E，Glu)或者除了赖氨酸(K，Lys)之外的保守的谷氨酸(E，Glu)取代(例如天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酰胺(Q，Gln)、精氨酸(R，Arg)、天冬酰胺(N，Asn)、组氨酸(H，His)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基390进行编码的核苷酸密码子对天冬氨酸(D，Asp)或保守的天冬氨酸(D，Asp)取代(例如天冬酰胺(N，Asn)、谷氨酸(E，Glu)、谷氨酰胺(Q，Gln)或丝氨酸(S，Ser))进行编码，并且所述对经过修饰的H1血凝素的氨基酸残基429进行编码的核苷酸密码子对蛋氨酸(M，Met)或者除了亮氨酸(L，Leu)之外的保守的蛋氨酸(M，Met)取代(例如异亮氨酸(I，Ile)、谷氨酰胺(Q，Gln)、缬氨酸(V、Val)或苯丙氨酸(F，Phe))进行编码，其中所述经过修饰的H1血凝素序列不是天然存在的，并且其中所述血凝素蛋白在表达时形成VLP。

例如，所述经过修饰的H1血凝素可具有一个或多个修饰；其中至少H1血凝素的残基97、374、390和429如本文所述地被修饰。例如，所述经过修饰的H1血凝素可以是四取代的H1血凝素，其中位置97、374、390和429处的残基被修饰。

此外，提供了一种在植物中产生VLP的方法，该VLP包括如上所述的在位置97、374、390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97、374、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

此外，提供了一种增加植物中的VLP的产量的方法，该VLP包括如上所述的在位置97、374、390和429处具有取代的经过修饰的H1血凝素。该方法包括向植物或植物部分中引入对在位置97、374、390和429处具有取代并且可操作地联接至在植物中为活性的调节结构域的经过修饰的H1血凝素进行编码的核酸，并在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。

本说明书还提供了一种包括在位置97、374、390和429处具有取代的H1血凝素的VLP。该VLP可通过本说明书提供的方法产生。与包括未经修饰的H1血凝素蛋白的VLP相比，所述包括经过修饰的H1血凝素的VLP蛋白显现出改善的特性。

本文还提供了一种增加植物中的包括突变型流感病毒血凝素的VLP的产量或收获量的方法。例如，该方法可包括向植物、植物部分或植物细胞引入如本文所述的对突变型流感病毒血凝素进行编码的核酸。可针对人类密码子的使用、提高的GC含量、或者它们的组合优化对突变型流感病毒血凝素进行编码的核酸。可在植物、植物部分或植物细胞中表达一种或多种突变型流感病毒血凝素蛋白，以产生包括一种或多种突变型流感病毒血凝素蛋白的VLP。或者，所述方法可包括提供包括对突变型流感病毒血凝素蛋白进行编码的核酸的植物、植物部分或植物细胞，以产生包括一种或多种突变型流感病毒血凝素蛋白的VLP。

所述产生包括突变型流感病毒血凝素的VLP的方法还可包括向植物、植物部分或植物细胞引入第二个核酸序列的步骤，其中所述第二个核酸对与突变型流感病毒血凝素共表达的质子通道蛋白进行编码。例如，所述质子通道蛋白可以是甲型流感病毒M2亚型蛋白，例如A/New Caledonia/20/99 M2。所述质子通道蛋白的共表达可导致突变型流感病毒血凝素蛋白和/或包括该突变型流感病毒血凝素蛋白的VLP的积累量增加，例如如WO 2013/044390所述，该文献通过引用结合在此。

此外，所述突变型流感病毒血凝素还可包含如WO 2013/044390和WO 2014/153674所述的经过修饰的蛋白水解环或切割位点，这些文献通过引用结合在此。

“共表达”指在植物、植物或植物细胞中引入并表达两种或多种核苷酸序列，这两种或多种核苷酸序列中的每一种对感兴趣的蛋白质或感兴趣的蛋白质的片段进行编码。可在一个载体内向植物、植物部分或植物细胞引入所述两种或多种核苷酸序列，使得所述两种或多种核苷酸序列中的每一种都处于独立的调节结构域(例如包括双构建体)的控制之下。或者，可在独立的载体(例如包括单构建体)内引入所述两种或多种核苷酸序列，并且每个载体包括用于相应核酸的表达的适当调节结构域。例如，分别位于独立的载体上并被引入到独立的根癌土壤杆菌宿主中的两种核苷酸序列可通过在真空渗入之前将每个根癌土壤杆菌宿主的所需量的悬浮液(例如相等量，或者可改变每个根癌土壤杆菌宿主的比例)进行混合来实现共表达。通过这种方式，多种根癌土壤杆菌宿主悬浮液的共渗允许多种转基因的共表达。

对如本文所述的突变型流感病毒血凝素进行编码的核酸还可包括增强突变型流感病毒血凝素在植物、植物部分或植物细胞中的表达的序列。增强表达的序列可包括与对突变型流感病毒血凝素蛋白进行编码的核酸可操作地结合的豇豆花叶病毒(CPMV)增强子元件。

包括对如本文所述的经过修饰的流感病毒血凝素(HA)进行编码的核苷酸序列的核酸还可包括增强该血凝素蛋白在植物、植物部分或植物细胞中的表达的序列。增强表达的序列可包括与对经过修饰的流感病毒血凝素蛋白进行编码的核酸可操作地结合的CPMV增强子元件或源自植物的表达增强子。还可针对人类密码子的使用、提高的GC含量、或者它们的组合优化对经过修饰的流感病毒血凝素(HA)进行编码的序列。

本文中使用的术语“CPMV增强子元件”指对调节豇豆花叶病毒(CPMV)RNA2多肽的5′UTR或本领域中已知的经过修饰的CPMV序列进行编码的核苷酸序列。例如，CPMV增强子元件或CPMV表达增强子包括在WO2015/14367；WO2015/103704；WO2007/135480；WO2009/087391；Sainsbury F.和Lomonossoff G.P.(2008，Plant Physiol.148：第1212-1218页)中说明的核苷酸序列，这些文献均通过引用结合在此。CPMV增强子序列可增强其附接的下游异源开放阅读框的表达。CPMV表达增强子可包括CPMV HT、CPMVX(其中X＝160、155、150、114)，例如CPMV 160、CPMVX+(其中X＝160、155、150、114)，例如CPMV 160+、CPMV-HT+、CPMVHT+[WT115]或CPMV HT+[511](WO2015/143567；WO2015/103704，这些文献通过引用结合在此)。CPMV表达增强子可用于包括与CPMV表达增强子序列可操作地联接的调节结构域和感兴趣的核苷酸序列的植物表达系统。

本文中使用的术语“CPMV增强子元件”指对调节豇豆花叶病毒(CPMV)RNA2多肽的5′UTR或本领域中已知的经过修饰的CPMV序列进行编码的核苷酸序列。例如，CPMV增强子元件或CPMV表达增强子包括在WO2015/14367；WO2015/103704；WO2007/135480；WO2009/087391；Sainsbury F.和Lomonossoff G.P.(2008，Plant Physiol.148：第1212-1218页)中说明的核苷酸序列，这些文献均通过引用结合在此。CPMV增强子序列可增强其附接的下游异源开放阅读框的表达。CPMV表达增强子可包括CPMV HT、CPMVX、CPMVX+、CPMV-HT+、CPMVHT+[WT115]或CPMV HT+[511](WO2015/14367；WO2015/103704，这些文献通过引用结合在此)。CPMV表达增强子可用于包括与CPMV表达增强子序列可操作地联接的调节结构域和感兴趣的核苷酸序列的植物表达系统。

术语“5′UTR”或“5′非转译区”或“5′前导序列”指不被转译的mRNA结构域。5′UTR通常从转录起始位点开始，并在转译起始位点或编码区的起始密码子之前结束。5′UTR可调节mRNA转录本的稳定性和/或转译。

本文中使用的术语“源自植物的表达增强子”指从植物中获得的核苷酸序列，该核苷酸序列对5′UTR进行编码。在美国临时专利申请2006/010086(提交于2018年3月14日，该文献通过引用结合在此)或Diamos A.G.等人的论文(2016，Front Plt Sci.7：1-15；该文献通过引用结合在此)中说明了一种源自植物的表达增强子的例子。源自植物的表达增强子可选自如US 62/643,053中所述的nbMT78、nbATL75、nbDJ46、nbCHP79、nbEN42、atHSP69、atGRP62、atPK65、atRP46、nb30S72、nbGT61、nbPV55、nbPPI43、nbPM64和nbH2A86。源自植物的表达增强子可用于包括与源自植物的表达增强子序列可操作地联接的调节结构域和感兴趣的核苷酸序列的植物表达系统。

“可操作地联接”指特定序列直接或间接相互作用以执行预定功能，例如核酸序列表达的介导或调节。例如，可操作地联接的序列的相互作用可由与可操作地联接的序列相互作用的蛋白介导。

当一种或多种突变型流感病毒血凝素蛋白在植物、植物部分或植物细胞中表达时，所述一种或多种突变型流感病毒血凝素蛋白自组装成VLP。可在适当的提取和纯化条件下收获植物、植物部分或植物细胞以保持VLP的完整性，并且可纯化包括一种或多种突变型流感病毒血凝素的VLP。

本发明还提供了如本文所述的突变型流感病毒血凝素或包括突变型流感病毒血凝素的VLP在诱导受试者对流感感染的免疫中的一种用途。本文还公开了一种通过向受试者或宿主动物施用突变型流感病毒血凝素或包括突变型流感病毒血凝素的VLP而制备的抗体或抗体片段。还提供了一种用于在受试者中诱导免疫应答的组合物，该组合物包括有效剂量的如本文所述的突变型流感病毒血凝素或包括突变型流感病毒血凝素的VLP病毒、以及药学上可接受的载体、辅助剂、运载体或赋形剂。还提供了一种用于在受试者中诱导免疫应答的疫苗，其中该疫苗包括有效剂量的突变型流感病毒血凝素。

本文还提供了一种在受试者中诱导对流感感染的免疫的方法，该方法包括以口服、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用的方式向受试者施用突变型流感病毒血凝素或包括突变型流感病毒血凝素的VLP。

本文中使用的术语“流感病毒”指一种以具有负单链RNA基因组为特征的正粘病毒科的包膜病毒株。根据具体的病毒株，该流感病毒基因组由对12-14种蛋白进行编码的八个基因片段组成。

有四种类型的流感病毒：甲型、乙型、丙型和丁型，其中甲型和乙型流感病毒是人群中的季节性疾病流行的致病微生物。甲型流感病毒按照血凝素和神经氨酸酶(NA)糖蛋白亚型的表达进一步分类。

本文中使用的术语“血凝素”或“HA”指一种促进流感病毒微粒与含唾液酸蛋白在靶细胞表面上的结合并介导病毒基因组向靶细胞中的释放的三聚体凝集素。有18种不同的血凝素亚型(H1-H18)。血凝素蛋白包括两个结构元件：头部，它是血清保护性抗体的主要靶标；以及柄部。血凝素被转译为单个多肽HA0(组装为三聚体)，该多肽HA0必须被丝氨酸内切蛋白酶在HA1(大约40kDa)子域与HA2(大约20kDa)子域之间切开。在切割后，两个二硫键结合的蛋白质结构域采用实现病毒传染性所需的必要构象。

本文所公开的甲型流感病毒血凝素蛋白或经过修饰的甲型流感病毒血凝素蛋白包括源自任何已知甲型流感毒株的任何已知血凝素蛋白，但也包括随着时间发展的对已知甲型流感毒株的修饰。例如，流感病毒血凝素可能源自A/California/07/09(H1N1)、A/Michigan/45/15(H1N1)、A/Massachusetts/06/17(H1N1)、A/Costa Rica/0513/16(H1N1)、A/Honduras/17734/16(H1N1)或A/Darwin/11/15(H1N1)。甲型流感病毒血凝素可能包括源自毒株的血凝素，其中在所述流感病毒血凝素蛋白包括至少一个如本文所述的取代并且能够形成VLP，在向受试者施用时诱导免疫应答，诱导血凝或者它们的组合的情况下，所述血凝素与源自上文所列的甲型流感病毒株的任何血凝素有大约30-100％或其间的任何量的氨基酸序列同一性。

例如，流感病毒血凝素蛋白可与源自上文所列的甲型流感病毒株的任何血凝素有30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100％或它们之间的任何量的氨基酸序列同一性，并且包括至少一个如本文所述的取代，并能够形成VLP，在向受试者施用时诱导免疫，诱导血凝或它们的组合。在图1中示出了多个甲型流感病毒血凝素结构域的氨基酸序列比对，这些示例不应视为是限制性的。

在涉及特定序列时，术语“百分比相似性”、“序列相似性”、“百分比同一性”或“序列同一性”例如如威斯康辛大学GCG软件程序所述或通过手动比对和目视检查的方式使用(例如参见Ausubel等人编著的1995年增补版《分子生物学实验指南》)。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。可执行用于比较的最佳序列比对，例如使用Smith和Waterman的算法(1981，Adv.Appl.Math.2：482)，通过Needleman和Wunsch的比对算法(1970，J.Mol.Biol.48：443)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)，通过这些算法的计算机化实现(例如威斯康辛州麦迪逊市(575)的Genetics Computer Group公司的Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)来进行。

适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST和BLAST2.0算法，在Altschul等人的论文(1977，Nuc.Acids Res.25：3389-3402)和Altschul等人的论文(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)中分别说明了该算法。使用BLAST和BLAST 2.0和本文所述的参数来确定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。例如，BLASTN程序(针对核苷酸序列)可使用11字长(W)、10期望值(E)、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序可使用字长＝3、期望值(E)＝10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)的比对(B)＝50、期望值(E)＝10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

本文中使用的术语“病毒样微粒”、VLP或其变化形式指包括一种或多种流感病毒血凝素蛋白并且自组装成没有流感基因组的所有部分的非复制、非感染性病毒衣壳结构的流感病毒微粒。

流感病毒血凝素蛋白在植物中的产生

在甲型流感病毒血凝素蛋白包括至少一个如本文所述的取代并且能够形成VLP，在向受试者施用时诱导免疫应答，诱导血凝或它们的组合的情况下，该甲型流感病毒血凝素蛋白包括包含与来自A/California/07/09(H1N1，序列号130)、A/Michigan/45/15(H1N1，序列号134)、A/Massachusetts/06/17(H1N1，序列号135)、A/Costa Rica/0513/16(H1N1，序列号133)、A/Honduras/17734/16(H1N1，序列号131)、A/Darwin/11/15(H1N1，序列号132)、A/Paris/1227/2017(序列号138)和A/Norway/2147/2017(序列号139)的甲型流感病毒血凝素序列有大约30至大约100％、大约40至大约100％、大约50至大约100％、大约60至大约100％、大约70至大约100％、大约80至大约100％、大约85至大约100％、大约90至大约100％、大约95至大约100％、或大约97至大约100％、大约98至大约100％、或者它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列的任何血凝素蛋白。

此外，所述经过修饰的流感病毒血凝素(HA)蛋白在包括至少一个如本文所述的取代并且能够形成VLP、在向受试者施用时诱导免疫应答、诱导血凝反应或它们的组合的情况下包括与序列号18、序列号22、序列号24、序列号4、序列号28、序列号32、序列号36、序列号39、序列号41、序列号43、序列号45、序列号47、序列号49、序列号51、序列号53、序列号55、序列号57、序列号59、序列号61、序列号63、序列号65、序列号68、序列号72、序列号76、序列号80、序列号82、序列号84、序列号86、序列号89、序列号91、序列号93、序列号95、序列号97、序列号105、序列号108、序列号124、序列号126、序列号128、序列号140、序列号142、序列号144、序列号146、序列号148的序列之一有大约30％至大约100％、大约40％至大约100％、大约50％至大约100％、大约60％至大约100％、大约70％至大约100％、大约80％至大约100％、大约85％至大约100％、大约90％至大约100％、大约95％至大约100％、大约97％至大约100％、大约98％至大约100％或它们之间的任何量的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列。

如本文所述，与野生型流感病毒血凝素相比，流感病毒血凝素中的一种或多种特异性突变或修饰导致植物中的血凝素蛋白积累量增加和VLP产量增加。

在植物中具有增强流感病毒血凝素和/或VLP产生能力的突变甲型流感病毒血凝素蛋白的例子包括但不限于：

F390D A/California/07/09突变型H1(构建体号2980，序列号18)：L429M A/California/07/09突变型H1(构建体号2962，序列号22)；F390D+L429M A/California/07/09突变型H1(构建体号2995，序列号24)；N380A A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3644，序列号105)；F390D+N380A A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3704，序列号108)；N97D A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3774，序列号28)；K374E A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3771，序列号32)；F390D A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3641，序列号36)；L429M A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3643，序列号39)；N97D+K374E A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3880，序列号41)；F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3703，序列号43)；N97D+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3879，序列号45)；K374E+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3878序列号47)；N97D+K374E+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1(构建体号3881，序列号49)；F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4091，序列号51)；N97D+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4093，序列号53)；K374E+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4092，序列号55)；N97D+K374E+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4094，序列号57)；F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1(构建体号4715，序列号59)；N97D+F390D+L429M A/CostaRica/0513/16突变型H1(构建体号4717，序列号61)；K374E+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1(构建体号4716，序列号63)；N97D+K374E+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1(构建体号4718，序列号65)；N97D A/Honduras/17734/16突变型H1(构建体号3950，序列号68)；K374E A/Honduras/17734/16突变型H1(构建体号3948，序列号72)；F390D A/Honduras/17734/16突变型H1(构建体号3945，序列号75)；L429M A/Honduras/17734/16突变型H1(构建体号3949，序列号80)；F390D+L429M A/Honduras/17734/16突变型H1(构建体号3946，序列号82)；N97D+F390D+L429M A/Honduras/17734/16突变型H1(构建体号3951，序列号84)；N97D A/Darwin/11/15突变型H1(构建体号3990，序列号86)；K374E A/Darwin/11/15突变型H1(构建体号3988，序列号89)；F390D A/Darwin/11/15突变型H1(构建体号3985，序列号91)；L429M A/Darwin/11/15突变型H1(构建体号3989，序列号93)；F390D+L429M A/Darwin/11/15突变型H1(构建体号3986，序列号95)；N97D+F390D+L429M A/Darwin/11/15突变型H1(构建体号3991，序列号97)；F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4765，序列号124)；K374E+F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4766，序列号126)；N97D+F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4767，序列号128)；N97D+K374E+F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4768，序列号140)；F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4775，序列号142)；K374E+F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4776，序列号144)；N97D+F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4777，序列号146)；以及N97D+K374E+F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4778，序列号148)。

诱导对流感感染的免疫

“免疫应答”通常指受试者的适应性免疫系统的反应。该适应性免疫系统通常包括体液反应和细胞介导的反应。体液反应是由B淋巴细胞谱系细胞(B细胞)中产生的分泌抗体介导的免疫特征。分泌的抗体与入侵微生物(例如病毒或细菌)的表面的抗原结合，这将它们标记为待破坏。体液免疫通常用于指抗体产生及其伴随过程、以及抗体的效应子功能，包括Th2细胞活化和细胞因子产生、记忆细胞产生、调理素促进吞噬作用、病原体消除等。术语“调节”指通过多种公知或常用的试验中的任何一种确定的特定反应或参数的增大或减小，其中一些试验在本文中示出。

细胞介导的反应是一种不涉及抗体但是涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活以及对抗原做出反应的各种细胞因子的释放的免疫应答。细胞介导的免疫通常用于指某些Th细胞激活、Tc细胞激活和T细胞介导的反应。细胞介导的免疫在对病毒感染的反应中可能特别重要。

例如，抗原特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导可使用ELISPOT试验来测量；CD4阳性T淋巴细胞的刺激可使用增殖试验来测量。抗流感病毒血凝素抗体效价可使用酶联免疫吸附(ELISA)试验进行定量；抗原特异性或交叉反应性抗体的同种型也可使用抗同种型抗体(例如抗IgG、IgA、IgE或IgM)来测定。进行这种测定的方法和技术在本领域中是众所周知的。

细胞因子的存在或水平也可量化。例如，T辅助细胞反应(Th1/Th2)通过使用ELISA(例如BD Biosciences OptEIA套件)测定IFN-和IL-4分泌细胞来表征。可培养从受试者获得的外周血单核细胞(PBMC)或脾细胞，并分析上清液。还可使用本领域已知的标记特异性荧光标记和方法通过荧光激活细胞分选(FACS)来对T淋巴细胞进行量化分析。

还可进行微中和试验来表征受试者的免疫应答，例如参见Rowe等人于1973年公布的方法。可通过多种方式量化病毒中和效价，包括：在对细胞进行晶体暴力固定/染色后计数溶解斑数目(斑块分析)；体外培养的细胞溶解的显微观察；以及2)酶联免疫吸附试验和分光光度法检测流感病毒。

本文中使用的术语“表位”指抗体特异性结合的抗原的结构部分。

例如，在Balb/C小鼠中可观察到响应于从植物产生的野生型流感病毒血凝素蛋白或VLP或突变型流感病毒血凝素蛋白或VLP的施用而引发的免疫应答。从动物采集的血液的血清样本可通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析H1特异性总IgG和IgA抗体。在每个治疗组的血清中，用从植物产生的野生型流感病毒血凝素或突变型流感病毒血凝素蛋白免疫的小鼠可能表现出血凝素特异性IgG抗体效价。

植物表达

可使用钛质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微量注射、电穿孔等方式将本发明的构建体引入到植物细胞中。关于这些技术的评论，例如可参考Weissbach和Weissbach的《植物分子生物学方法》，Academy Press，New York VIII，第421-463页(1988)；Geierson和Corey的《植物分子生物学》第二版(1988)；以及Miki和Iyer的《植物中 的基因转移基础知识》。《植物代谢》第二版，DT.DT.Dennis，DH Turpin，DD Lefebrvre，DBLayzell(eds)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London，第561-579页(1997)。其它方法包括直接DNA吸收、使用脂质体、电穿孔(例如使用原生质体)、微量注射、微粒或须、以及真空渗透。例如参见Bilang等人的论文(1991，Gene 100：247-250)、Scheid等人的论文(1991，Mol.Gen.Genet.228：104-112)、Guerche等人的论文(1987，Plant Science 52：111-116)、Neuhause等人的论文(1987，Theor.Appl Genet.75：30-36)、Klein等人的论文(2987，Nature 327：70-73)；Freeman等人的论文(1984，Plant Cell Physiol.29：1353)、Howell等人的论文(1985，Science 227：1229-1231)、DeBlock等人的论文(1989，Plant Physiology91：694-701)、《植物分子生物学方法》(Weissbach和Weissbach，eds.，Academic PressInc.，1988)、《植物分子生物学方法》(Schuler和Zielinski，eds.，Academic Press Inc.，1989)、WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Liu和Lomonossoff的论文(2002，J Virol Meth，105：343-348)、EP 290395；WO8706614；美国专利4,945,050；5,036,006；和5,100,792、于1995年5月10日提交的美国专利申请08/438,666、以及于1992年9月25日提交的07/951,715(所有这些文献都通过引用结合在此)。

可使用瞬时表达方法来表达本发明的构建体(参见D’Aoust等人，2009，《分子生物学方法》第483卷第41-50页；Liu和Lomonossoff，2002，《病毒学方法杂志，》105：343-348；这些文件通过引用结合在此)。或者，可使用如Kapila等人(1997，Plant Sci.122，101-108；该文献通过引用结合在此)或WO 00/063400、WO 00/037663(这些文件通过引用结合在此)所述的基于真空的瞬时表达方法。这些方法可例如包括但不限于农业接种或农业渗透、注射器渗透方法，但是，如上文所述，也可使用其它瞬时方法。通过农业接种、农业渗透或注射器渗透，包括所需核酸的农杆菌混合物进入组织的细胞间隙，例如植物的叶、地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其它部分(茎、根、花)或整棵植物。在穿过表皮后，农杆菌感染并将t-DNA副本转移到细胞中。t-DNA是游离转录的，而mRNA是转译的，这导致在受感染的细胞中产生感兴趣的蛋白，但是，t-DNA在细胞核内的传递是瞬时的。

包含本发明的基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子也被视为本发明的一部分，它们可用作适合于本文所述的瞬时蛋白质表达的平台植物。从植物细胞再生完整植物的方法在本领域中也是已知的(例如参见Guerineau和Mullineaux(1993，《植物转化和表达载体》，收录于《牛津植物分子生物学Labfax》(Croy RRD版)，BIOS科学出版社，第121-148页)。一般来说，将转化的植物细胞在适当的培养基中培养，该培养基可含有选择性试剂(例如抗生素)，其中使用选择性标记以便于转化的植物细胞的识别。一旦愈伤组织形成，可按照已知的方法通过使用适当的植物激素来促进芽的形成，并将芽转移到生根培养基中，以进行植物的再生。然后可使用这些植物从种子或者使用营养繁殖技术形成重复的世代。转基因植物也可在不使用组织培养的情况下产生。这些生物体的稳定转化和再生方法在本领域中是既定的，并且是本领域技术人员所知的。可用的技术可在Vasil等人的著作(《植物细胞培养与体细胞遗传学》、《实验室程序及其应用》，学术出版社，1984年)以及Weissbach和Weissbach的著作(《植物分子生物学方法》，学术出版社，1989)中找到。获得转化和再生植物的方法对本发明来说不是至关重要的。

若准备通过两种或多种核酸构建体对植物、植物部分或植物细胞进行转化或共转化，则可在单次转染事件中将该核酸构建体引入农杆菌中，使得核酸汇集并且细菌细胞被转染。或者，可依次引入构建体。在这种情况下，如文上所述将第一构建体引入到农杆菌中，使细胞在只有单转化的细菌能够生长的选择性条件下(例如在存在抗生素的条件下)生长。在该第一选择步骤之后，如上文所述将第二核酸构建体引入到农杆菌中，并使细胞在只有双转化的细菌能够生长的双选择性条件下生长。然后，可按本文所述使用双转化的细菌来转化植物、植物部分或植物细胞，或者可执行进一步的转化步骤以纳入第三核酸构建体。

或者，若准备通过两种或多种核酸构建体对植物、植物部分或植物细胞进行转化或共转化，则可通过将农杆菌细胞的混合物与植物、植物部分或植物细胞共渗透而将核酸构建体引入到植物中，其中每个农杆菌细胞可包含将被引入到植物中的一种或多种构建体。为了改变构建体中的感兴趣的核苷酸序列在植物、植物部分或植物细胞中的相对表达水平，在渗透步骤中，可改变包含所需的构建体的各农杆菌群体的浓度。

表3：序列号和序列说明

下面将在以下示例中进一步说明本发明。

例1：流感病毒血凝素构建体

使用本领域公知的技术产生了流感病毒血凝素构建体。例如，如下所述对野生型A-California-07-09血凝素、F390D A-California-07-09血凝素和F390D+L429M A-California-07-09血凝素进行克隆。使用类似的技术获得其它H1突变体，在例3(在植物中产生流感病毒血凝素和VLP)和表4中说明了血凝素序列引物、模板和产物。

下表4汇总了野生型和突变型血凝素蛋白、引物、模板和产物。

A.H1血凝素的修饰

2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H1 A-California-07-09/NOS(构建体号1314)

使用以下的基于PCR的方法将对来自与苜蓿PDI分泌信号肽融合的A/California/07/09的流感病毒血凝素的成熟HA0进行编码的序列克隆到2X35S/CPMV 160/NOS表达系统中。使用PDISP-H1 A/California/7/09基因序列(序列号1)作为模板，利用引物IF-CPMV(f15′UTR)_SpPDI.c(序列号13)和IF-H1cTMCT.S1-4r(序列号14)扩增包含PDISP-A/California/07/09编码序列的片段。使用融合克隆系统(美国加州山景城的Clontech公司)将PCR产物克隆到2X35S/CPMV 160/NOS表达系统中。使用SacII和StuI限制酶消化构建体1190(图8)，并为融合组装反应使用线性化的质粒。构建体1190是一种用于在基于2X35S/CPMV160/NOS的表达盒中“融合”克隆感兴趣的基因的受体质粒。它还结合了用于在苜蓿质体蓝蛋白基因启动子和终止子作用下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。主链是pCAMBIA双元质粒，从左到右的t-DNA边界序列在序列号98中示出。将得到的构建体编号为1314(序列号99)。来自的与苜蓿PDI分泌信号肽(PDISP)融合的A/California/07/09的成熟HA0的氨基酸序列在序列号2中示出。在图6A中示出了质粒1314的示意图。

2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H1 A-California-07-09(F390D)/NOS(构建体号 2980)

使用以下的基于PCR的方法将对来自与苜蓿PDI分泌信号肽融合的A/California/07/09(F390D)的流感病毒血凝素的成熟HA0进行编码的序列克隆到2X35S/CPMV 160/NOS表达系统中。在第一轮PCR中，使用PDISP-H1 A/California/7/09基因序列(序列号1)作为模板，利用引物IF-CPMV(f15′UTR)_SpPDI.c(序列号13)和H1Cal(F390D).r(序列号15)扩增包含具有突变的F390D氨基酸的PDISP-H1 A/California/07/09的片段。使用PDISP-H1 A/California/07/09基因序列(序列号1)作为模板，利用H1Cal(F390D).c(序列号16)和IF-H1cTMCT.S1-4r(序列号14)扩增包含F390D突变的第二片段及H1 A/California/07/09的剩余部分。然后将两次扩增的PCR产物混合，并用作使用IF-CPMV(f15′UTR)_SpPDI.c(序列号13)和IF-H1cTMCT.S1-4r(序列号14)作为引物进行的第二轮扩增的模板。使用融合克隆系统(美国加州山景城的Clontech公司)将最终的PCR产物克隆到2X35S/CPMV 160/NOS表达系统中。使用SacII和StuI限制酶消化构建体1190(图8)，并为融合组装反应使用线性化的质粒。构建体1190是一种用于在基于2X35S/CPMV 160/NOS的表达盒中“融合”克隆感兴趣的基因的受体质粒。它还结合了用于在苜蓿质体蓝蛋白基因启动子和终止子作用下共表达TBSVP19沉默抑制因子的基因构建体。主链是pCAMBIA双元质粒，从左到右的t-DNA边界序列在序列号98中示出。将得到的构建体编号为2980(序列号100)。来自A/California/07/09(F390D)的突变的PDISP-HA的氨基酸序列在序列号18中示出。在图6B中示出了质粒2980的示意图。

2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H1 A-California-07-09(F390D+L429M)/NOS(构建 体号2995)

使用以下的基于PCR的方法将对来自与苜蓿PDI分泌信号肽融合的A/California/07/09(F390D+L429M)的流感病毒血凝素的成熟HA0进行编码的序列克隆到2X35S/CPMV160/NOS表达系统中。在第一轮PCR中，使用PDISP-H1 A/California/7/09(F390D)基因序列(序列号17)作为模板，利用引物IF-CPMV(f15′UTR)_SpPDI.c(序列号13)和H1Cal(L429M).r(序列号19)扩增包含具有突变的F390D和L429M氨基酸的PDISP-H1A/California/07/09的片段。使用PDISP-H1 A/California/7/09(F390D)基因序列(序列号17)作为模板，利用H1Cal(L429M).c(序列号20)和IF-H1cTMCT.S1-4r(序列号14)扩增包含L429M突变的第二片段及H1A/California/07/09的剩余部分。然后将两次扩增的PCR产物混合，并用作使用IF-CPMV(f15′UTR)_SpPDI.c(序列号13)和IF-H1cTMCT.S1-4r(序列号14)作为引物进行的第二轮扩增的模板。使用融合克隆系统(美国加州山景城的Clontech公司)将最终的PCR产物克隆到2X35S/CPMV160/NOS表达系统中。使用SacII和StuI限制酶消化构建体1190(图8)，并为融合组装反应使用线性化的质粒。构建体1190是一种用于在基于2X35S/CPMV 160/NOS的表达盒中“融合”克隆感兴趣的基因的受体质粒。它还结合了用于在苜蓿质体蓝蛋白基因启动子和终止子作用下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。主链是pCAMBIA双元质粒，从左到右的t-DNA边界序列在序列号98中示出。将得到的构建体编号为2995(序列号101)。来自A/California/07/09(F390D+L429M)的突变的PDISP-HA的氨基酸序列在序列号24中示出。在图6D中示出了质粒2995的示意图。

例2：方法

根癌农杆菌转染

使用D’Aoust等人(Plant Biotech.J.6：930-40)说明的方法用野生型流感病毒血凝素或突变型流感病毒血凝素表达载体通过电穿孔转染根癌农杆菌菌株AGL1。使转染的农杆菌在添加10毫摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20微米乙酰丁香酮、50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升羧苄青霉素、pH为5.6的YEB培养基中生长，直到OD₆₀₀达到0.6与1.6之间。在使用前对农杆菌悬浮液进行离心，并使其重新悬浮在渗透培养基(10毫摩尔MgCl₂和10毫摩尔MES、pH为5.6)中。

植物生物量、接种体的制备和农杆菌渗入

本氏烟植物是从填充有商售泥炭苔基质的平地中的种子生长的。使该植物在温室中在16/8光周期和白天25℃/夜间20℃的温度条件下生长。播种后三周，选取各个小植株，移植到盆中，在相同的环境条件下，在温室中再生长三周。

使转染有每种野生型流感病毒血凝素或突变型流感病毒血凝素表达载体的农杆菌在添加10毫摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20微米乙酰丁香酮、50微克/毫升卡那霉素和25微克/毫升羧苄青霉素、pH为5.6的YEB培养基中生长。直到它们达到0.6与1.6之间的OD₆₀₀。在使用前对农杆菌悬浮液进行离心，并使其重新悬浮在渗透培养基(10毫摩尔MgCl₂和10毫摩尔MES、pH为5.6)中，并在4℃下储存一整夜。在渗透当天，将培养批次稀释至2.5倍培养体积，并在使用前保温。在真空度为20-40托的气密的不锈钢罐中，将整棵本氏烟倒置在细菌悬浮液中2分钟。将植物被放回温室中并培育6或9天，直到收获。

叶的收获和总蛋白提取

通过在室温下使用轨道振荡器进行一整夜的酶提取从切成大约1平方厘米碎片的新鲜生物质中提取蛋白质。然后将浆液通过大孔尼龙过滤器过滤，以除去未消化的粗糙植物组织。

为了获得“全过程产量”，将浆液离心以除去原生质体和细胞内污染物。通过深度过滤使上清液澄清。然后将澄清的部分装载到阳离子交换柱上，采用逐渐提高氯化钠浓度的逐步洗脱步骤。用TFF浓缩纯化的VLP，用制剂缓冲液对其渗滤，并使其通过过滤器。通过BCA试验分析纯化的VLP的蛋白质含量，并通过血凝试验分析活性。通过将新构建体的蛋白质产量与用作对照的天然构建体的蛋白质产量进行比较获得相对产量。

为了获得“后密度梯度产量”，将浆液离心以除去原生质体和细胞内污染物。将上清液进一步离心以除去额外的碎片。用玻璃纤维过滤器对上清液进行深度过滤澄清。然后将澄清的部分装载在不连续的碘克沙醇密度梯度装置上。如下进行分离密度梯度离心：制备在Tris缓冲液(35％、30％、25％、20％、15％、10％和5％的连续层)中包含不连续碘克沙醇密度梯度的38毫升试管，并用澄清提取物覆盖。在120000g下对梯度溶液离心2小时(4℃)。在离心后，丢弃从下到上收集的最初5毫升，而收集下一个5毫升用于在简化的SDS-PAGE上进行蛋白质含量分析(BCA)、活性测量(血凝试验)和HA0带的强度测量(密度测定)。通过将新构建体的HA0带强度与用作对照的天然构建体的HA0带强度进行比较获得相对产量。

血凝试验

血凝试验基于Nayak和Reichl(2004)说明的方法。简而言之，在含有100微升PBS的V形底96孔微量滴定板中进行测试样品(100微升)的系列双稀释，每孔中留下100微升稀释样品。向每个孔中加入100微升0.25％火鸡(用于H1)红细胞悬浮液(来自美国纽约州的BioLink Inc.)，并将孔板在室温下孵育2小时。将表明完全血凝的最高稀释度的倒数记录为血凝素活性。同时，将重组血凝素标准品(A/Vietnam/1203/2004H5N1)(来自美国康涅狄格州梅里登市的Protein Science Corporation)在PBS中稀释，并在每个孔板上作为对照物。

蛋白质分析和免疫印迹

在0.1％TBS-Tween 20中使用在2％脱脂乳中稀释为1/500的一级mAb进行第一次孵育，以进行免疫印迹。使用稀释为1/10000的过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体(JacksonImmunoresearch，cat#115-035-146)作为二级抗体，在0.1％TBS-Tween 20免疫应答性复合物中，进行2％脱脂乳中的化学发光检测，使用鲁米诺作为基质(Roche DiagnosticsCorporation)。使用活化过氧化物酶偶联试剂盒(来自伊利诺伊州洛克福特市的Pierce)进行人IgG抗体的辣根过氧化物酶-酶偶联。

例3：流感病毒血凝素蛋白在植物中的产生

A.H1血凝素的修饰

使用本领域公知的技术(参见例1)产生了流感病毒血凝素构建体。下表4汇总了野生型和突变型血凝素蛋白、引物、模板和产物。所用的序列在例4和序列表中列出。

F390D A/California/07/09突变型H1

F390D A/California/07/09突变型H1是通过使野生型A/California/07/09H1的位置390处的苯丙氨酸残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号2980)。如图2A和2B所示，与使用野生型A/California/07/09H1(构建体号1314)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号2980渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约60％的血凝效价提高。此外，如图2C所示，与用野生型构建体渗透的植物相比，用构建体号2980渗透的本氏烟在碘克沙醇梯度纯化后显现出大约60％的VLP产量增加。

L429M A/California/07/09突变型H1

L429M A/California/07/09突变型H1是通过使野生型A/California/07/09H1的位置429处的亮氨酸残基突变为蛋氨酸而构建的(构建体号2962)。如图2A和2B所示，与使用野生型A/California/07/09H1(构建体号1314)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号2962渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约20％的血凝效价提高。此外，如图2C所示，与用野生型构建体渗透的植物相比，用构建体号2962渗透的本氏烟在碘克沙醇梯度纯化后显现出大约30％的VLP产量增加。

F390D+L429M A/California/07/09突变型H1

F390D+L429M A/California/07/09突变型H1是通过向A/California/07/09H1野生型序列中引入双突变构建的，其中位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸，位置429处的亮氨酸突变为蛋氨酸(构建体号2995)。如图2B所示，与使用野生型A/California/07/09H1(构建体号1314)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号2995渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约60％的血凝效价提高。

N97D A/Michigan/45/15突变型H1

N97D A/Michigan/45/15突变型H1是通过使野生型A/Michigan/45/15H1的位置97处的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3774)。如图3A和3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3774渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约1100％的血凝效价提高。

K374E A/Michigan/45/15突变型H1

K374E A/Michigan/45/15突变型H1是通过使野生型A/Michigan/45/15H1的位置374处的赖氨酸残基突变为谷氨酸而构建的(构建体号3771)。如图3A和3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3771渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约1100％的血凝效价提高。

F390D A/Michigan/45/15突变型H1

F390D A/Michigan/45/15突变型H1是通过使野生型A/Michigan/45/15H1的位置390处的苯丙氨酸残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3641)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3641渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出相似的血凝效价活性。但是，与野生型相比，带有H1的纯化的VLP的全过程产量实测增加到172％(参见表5C)。

L429M A/Michigan/45/15突变型H1

L429M A/Michigan/45/15突变型H1是通过使野生型A/Michigan/45/15H1的位置429处的亮氨酸残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3643)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3643渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约500％的血凝效价提高。

N97D+K374E A/Michigan/45/15突变型H1

N97D+K374E A/Michigan/45/15突变型H1是通过向野生型A/Michigan/45/15的野生型序列中引入双突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺被天冬氨酸残基替代，位置374处的赖氨酸被谷氨酸残基替代(构建体号3880)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3880渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约1100％的血凝效价提高。

F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1

F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1是通过向野生型A/Michigan/45/15的野生型序列中引入双突变而构建的，其中位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸替换(构建体号3703)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3703渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约1100％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1

N97D+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1是通过向野生型A/Michigan/45/15的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号3879)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3879渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约2300％的血凝效价提高。

K374E+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1

K374E+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1是通过向野生型A/Michigan/45/15的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号3878)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3878渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约2500％的血凝效价提高。

N97D+K374E+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1

N97D+K374E+F390D+L429M A/Michigan/45/15突变型H1是通过向野生型A/Michigan/45/15的野生型序列中引入四突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号3881)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3881渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约3300％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1

N97D+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1是通过向野生型A/Massachusetts/06/17的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4093)。如图4B所示，与使双突变型构建体F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4091)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4093渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约40％的血凝效价提高。

K374E+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1

K374E+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1是通过向野生型A/Massachusetts/06/17的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4092)。如图4B所示，与使双突变型构建体F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4091)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4092渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约50％的血凝效价提高。

N97D+K374E+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1

N97D+K374E+F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1是通过向野生型A/Massachusetts/06/17的野生型序列中引入四突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4094)。如图4B所示，与使双突变型构建体F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4091)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4094渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约70％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1

N97D+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1是通过向野生型A/CostaRica/0513/16的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4717)。如图4B所示，与使双突变型构建体F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1(构建体号4715)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4717渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约100％的血凝效价提高。

K374E+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1

K374E+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1是通过向野生型A/CostaRica/0513/16的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4716)。如图4B所示，与使双突变型构建体F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1(构建体号4715)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4716渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约10％的血凝效价提高。

N97D+K374E+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1

N97D+K374E+F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1是通过向野生型A/Costa Rica/0513/16的野生型序列中引入四突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4718)。如图4B所示，与使双突变型构建体F390D+L429M A/Costa Rica/0513/16突变型H1(构建体号4715)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4718渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约140％的血凝效价提高。

N97D A/Honduras/17734/16突变型H1

N97D A/Honduras/17734/16突变型H1是通过使野生型A/Honduras/17734/16 H1的位置97处的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3950)。如图4A所示，与使用野生型A/Honduras/17734/16H1(构建体号3944)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3950渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约300％的血凝效价提高。

K374E A/Honduras/17734/16突变型H1

K374E A/Honduras/17734/16突变型H1是通过使野生型A/Honduras/17734/16 H1的位置374处的赖氨酸残基突变为谷氨酸而构建的(构建体号3948)。如图4A所示，与使用野生型A/Honduras/17734/16H1(构建体号3944)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3948渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约100％的血凝效价提高。

F390D A/Honduras/17734/16突变型H1

F390D A/Honduras/17734/16突变型H1是通过使野生型A/Honduras/17734/16 H1的位置390处的苯丙氨酸残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3945)。如图4A所示，与使用野生型A/Honduras/17734/16 H1(构建体号3944)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3945渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约30％的血凝效价提高。

L429M A/Honduras/17734/16突变型H1

L429M A/Honduras/17734/16突变型H1是通过使野生型A/Honduras/17734/16 H1的位置429处的亮氨酸残基突变为蛋氨酸而构建的(构建体号3949)。如图4A所示，与使用野生型A/Honduras/17734/16 H1(构建体号3944)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3949渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约400％的血凝效价提高。

F390D+L429M A/Honduras/17734/16突变型H1

F390D+L429M A/Honduras/17734/16突变型H1是通过向野生型A/Honduras/17734/16的野生型序列中引入双突变而构建的，其中位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸替换(构建体号3946)。如图4A所示，与使用野生型A/Honduras/17734/16 H1(构建体号3944)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3946渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约300％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Honduras/17734/16突变型H1

N97D+F390D+L429M A/Honduras/17734/16突变型H1是通过向野生型A/Honduras/17734/16的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号3951)。如图4A所示，与使用野生型A/Honduras/17734/16 H1(构建体号3944)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3951渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约600％的血凝效价提高。

N97D A/Darwin/11/15突变型H1

N97D A/Darwin/11/15突变型H1是通过使野生型A/Darwin/11/15 H1的位置97处的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3990)。如图4A所示，与使用野生型A/Darwin/11/15 H1(构建体号3984)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3990渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约200％的血凝效价提高。

K374E A/Darwin/11/15突变型H1

K374E A/Darwin/11/15突变型H1是通过使野生型A/Darwin/11/15 H1的位置374处的赖氨酸残基突变为谷氨酸而构建的(构建体号3988)。如图4A所示，与使用野生型A/Darwin/11/15 H1(构建体号3984)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3988渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约300％的血凝效价提高。

F390D A/Darwin/11/15突变型H1

F390D A/Darwin/11/15突变型H1是通过使野生型A/Darwin/11/15 H1的位置390处的苯丙氨酸残基突变为天冬氨酸而构建的(构建体号3985)。如图4A所示，与使用野生型A/Darwin/11/15 H1(构建体号3984)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3985渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约50％的血凝效价提高。

L429M A/Darwin/11/15突变型H1

L429M A/Darwin/11/15突变型H1是通过使野生型A/Darwin/11/15 H1的位置429处的亮氨酸残基突变为蛋氨酸而构建的(构建体号3989)。如图4A所示，与使用野生型A/Darwin/11/15 H1(构建体号3984)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3989渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约500％的血凝效价提高。

F390D+L429M A/Darwin/11/15突变型H1

F390D+L429M A/Darwin/11/15突变型H1是通过向野生型A/Darwin/11/15的野生型序列中引入双突变而构建的，其中位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸替换(构建体号3986)。如图4A所示，与使用野生型A/Darwin/11/15 H1(构建体号3984)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3986渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约300％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Darwin/111/15突变型H1

N97D+F390D+L429M A/Darwin/11/15突变型H1是通过向野生型A/Darwin/11/15的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号3991)。如图4A所示，与使用野生型A/Darwin/11/15 H1(构建体号3984)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3991渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约1100％的血凝效价提高。

F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1

F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1是通过向野生型A/Paris/1227/2017的野生型序列中引入双突变而构建的，其中位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸替换(构建体号4765)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4091)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4765渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约117％的血凝效价提高。

K374+F390D+L429M A/Paris/1227/2017

K374E+F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1是通过向野生型A/Paris/1227/2017的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4766)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4765)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4766渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约127％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Paris/1227/2017

N97D+F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1是通过向野生型A/Paris/1227/2017的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4767)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4765)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4767渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约171％的血凝效价提高。

N97D+K374E+F390D+L429M A/Paris/1227/2017

N97D+K374E+F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1是通过向野生型A/Paris/1227/2017的野生型序列中引入四突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4768)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Paris/1227/2017突变型H1(构建体号4765)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4768渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约230％的血凝效价提高。

F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1

F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1是通过向野生型A/Norway/2147/2017的野生型序列中引入双突变而构建的，其中位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸替换(构建体号4775)。如图4C所示，与使用F390D+L429MA/Massachusetts/06/17突变型H1(构建体号4091)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4775渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约112％的血凝效价提高。

K374+F390D+L429M A/Norway/2147/2017

K374E+F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1是通过向野生型A/Norway/2147/2017的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4776)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4775)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4776渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约128％的血凝效价提高。

N97D+F390D+L429M A/Norway/2147/2017

N97D+F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1是通过向野生型A/Norway/2147/2017的野生型序列中引入三突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4777)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4775)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4777渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约200％的血凝效价提高。

N97D+K374E+F390D+L429M A/Norway/2147/2017

N97D+K374E+F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1是通过向野生型A/Norway/2147/2017的野生型序列中引入四突变而构建的，其中位置97处的天冬酰胺突变为天冬氨酸残基，位置374处的赖氨酸突变为谷氨酸残基，位置390处的苯丙氨酸突变为天冬氨酸残基，位置429处的亮氨酸被蛋氨酸残基替换(构建体号4778)。如图4C所示，与使用F390D+L429M A/Norway/2147/2017突变型H1(构建体号4775)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号4778渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约213％的血凝效价提高。

N380A A/Michigan/45/15

N380A A/Michigan/45/15突变型H1是通过使野生型A/Michigan/45/15H1的位置380处的天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基而构建的(构建体号3644)。如图3B和3C所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3644渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约80％的血凝效价降低。

N380A+F390D A/Michigan/45/15

还构建了N380A+F390D A/Michigan/45/15突变型H1，其中通过用丙氨酸残基替换位置380处的天冬酰胺并用天冬氨酸残基替换位置390处的苯丙氨酸向野生型A/Michigan/45/15 H1引入双突变(构建体号3704)。如图3B所示，与使用野生型A/Michigan/45/15 H1(构建体号3640)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3704渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约50％的血凝效价降低。鉴于采用N380A A/Michigan/45/15突变型H1时观察到血凝效价降低，这些结果表明位置380处的天冬酰胺残基的突变对流感病毒血凝素蛋白在植物中的表达和/或流感病毒血凝素蛋白的稳定性有不良影响。

本文所述的一种或多种突变特异性地增加了植物中的流感病毒血凝素蛋白的产量和VLP产量。已观察到，其它位置处的突变显著减少流感病毒血凝素蛋白在植物细胞中的积累量或VLP产量，或者对其没有显著影响。

还观察到用包括本文所述的一种或多种突变的流感病毒血凝素蛋白实现的血凝效价提高对H1流感病毒血凝素有特异性。在被对源自非H1株系的突变型流感病毒血凝素进行编码的构建体渗透的植物中没有观察到类似的增强。

例如，是通过使野生型A/Indonesia/5/2005 H5的位置393处的苯丙氨酸残基突变为天冬氨酸而构建了F393D A/Indonesia/5/2005突变型H5(构建体号3680)。如图5所示，与使用野生型A/Indonesia/5/2005 H5(构建体号2295)渗透的本氏烟植物提取物相比，使用构建体号3680渗透的本氏烟植物的纯化提取物表现出大约98％的血凝效价降低。

类似地，与使用野生型A/E04915/2014H5(构建体号3645)渗透的本氏烟植物的提取物相比，使用F392D A/Egypt/N04915/2014突变型H5(构建体号3690)渗透的本氏烟的纯化提取物表现出大约99％的血凝效价降低(参见图5、表6)。

本文所述的一种或多种突变特异性地增加了植物中的流感病毒血凝素蛋白的产量和VLP产量。已观察到，其它位置处的突变显著减少流感病毒血凝素蛋白在植物细胞中的积累量或VLP产量，或者对其没有显著影响。

例3：血凝效价、后密度梯度产量和全过程产量

表5A汇总了实测的血凝效价。血凝效价是如例2所述测量的。相对血凝效价是通过将突变型或经过修饰的血凝素蛋白的血凝效价与野生型血凝素的血凝效价比较而获得的(表5A)。

表5B汇总了实测的后密度梯度产量。后密度梯度产量是如例2所述测量的。相对产量是通过将突变型或经过修饰的血凝素蛋白的血凝素带强度与野生型血凝素的血凝素带强度比较而获得的(表5B)。

表5C汇总了实测的全过程产量。全过程产量是如例2所述获得的。相对产量是通过将突变型或经过修饰的血凝素蛋白的蛋白产量与野生型血凝素的蛋白产量比较而获得的(表5C)。

例4：序列

使用了以下序列(参见表4)：

所有引用文献通过引用结合在此。

本发明是参照一个或多个实施例说明的。但是，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的范围的前提下，能够做出各种变化和修改。