一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵及其制备方法
阅读说明：本技术 一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵及其制备方法 (Biological type ventricular assist pump based on conjugate coaxial electrostatic spinning technology and preparation method thereof ) 是由 何晓敏 张晓阳 郑景浩 祝忠群 石博中 罗凯 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医学组织工程领域,具体地说,是一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵及其制备方法。包括如下步骤：1)制备含有复壁碳纳米管的取向静电纺丝心肌支架；2)通过同轴静电纺丝技术构建负载VEGF细胞因子的心肌支架；3)将分离的动物心肌细胞作为种子细胞种于膜片上；4)生物型心室辅助泵的构建；将膜片上种植心肌细胞后,将该细胞材料复合物按照心肌三层的排列方向叠加为三层,然后,制作成圆锥形袖套状结构。本发明袖套状生物型心室辅助泵可弥补传统机械辅助泵的不足,有望为广大终末期心衰患儿从根本上赋予心室持续收缩的动力性,从而彻底改善患儿预后及提高生存质量,降低患者住院费用及远期成本。(The invention relates to the field of medical tissue engineering, in particular to a biological type ventricular assist pump based on a conjugate coaxial electrostatic spinning technology and a preparation method thereof. The method comprises the following steps: 1) preparing an oriented electrostatic spinning myocardial scaffold containing the double-walled carbon nanotube; 2) constructing a cardiac muscle scaffold loaded with VEGF cell factors by a coaxial electrostatic spinning technology; 3) using the separated animal myocardial cells as seed cells to be planted on the membrane; 4) constructing a biotype ventricular assist pump; after the myocardial cells are planted on the membrane, the cell material compound is overlapped into three layers according to the arrangement direction of the three layers of the myocardial cells, and then the conical oversleeve-shaped structure is manufactured. The oversleeve-shaped biological heart chamber auxiliary pump can make up the defects of the traditional mechanical auxiliary pump, and is expected to fundamentally endow the heart chambers with continuous contraction dynamic property for vast end-stage heart failure patients, thereby thoroughly improving the prognosis of the patients, improving the life quality, and reducing the hospitalization cost and the long-term cost of patients.)
技术领域
本发明涉及医学组织工程领域，具体地说，是一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵及其制备方法，应用共轭同轴静电纺丝技术制作的负载VEGF的CNT/collagen/PLCL的有序排列的心肌支架构建生物型心室辅助泵。
背景技术
先天性心脏病(简称先心病)居我国出生缺陷首位，严重危害了儿童身心健康。先心病的发病率约为0.8％，每年我国新增先心病患儿约15万人，其中复杂先心病占30-40％。近年来，复杂先心病各类姑息性手术和根治手术数量亦明显增加，而术后心力衰竭(简称心衰)的发生率也随着显著增加。其中，据文献报道1-5％的心衰患儿处于终末期阶段，因药物难以控制，严重危及生命。心脏移植虽是治疗终末期心衰的有效手段，但因供体严重匮乏，仅有小部分患儿有机会接受移植，多数患儿则需要使用心室辅助装置维持生命，以等待心脏移植。目前，心室辅助装置是挽救终末期心衰患儿生命的重要手段。
心室辅助装置的主要作用是通过将患者的左或右心室内的血液引流到心室辅助装置中，并通过机械泵输注到主动脉或肺动脉，从而代替部分心室的射血功能，从而降低心室负担。目前，心室辅助装置已广泛应用于小儿终末期心脏病的临床治疗，并获得较好的临床疗效。但是，这些心室辅助装置应用有限，仅限于短期的循环支持，其庞大的外部设备和监测装置并不适合患儿长期或终身的循环辅助，患儿活动往往受限，且不能脱离重症监护室，出现的并发症亦较多。鉴于这些心室辅助装置存在的诸多不足，若能提供生物型心室泵血辅助装置，依靠心肌组织自身的节律性收缩长期提供心室收缩的动力，从根本上赋予心室循环的动力性，将有望彻底纠治终末期心衰，甚至可避免最终的心脏移植。近年随着组织工程技术发展，利用组织工程学的方法构建具有生物活性的组织工程心肌成为研究热点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵的制备方法。
本发明的第二个目的在于，提供由如上所述制备方法制备得到的生物型心室辅助泵。
本发明的第三个目的在于，提供一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵的制备方法，包括如下步骤：
1)制备含有复壁碳纳米管的取向静电纺丝心肌支架
将具有导电性的复壁碳纳米管溶解于六氟乙醇，制备含MWCNT的纺丝液；采用共轭纺丝技术，制备取向性的静电纺丝心肌支架；
2)通过同轴静电纺丝技术构建负载VEGF细胞因子的心肌支架
采用同轴静电纺丝技术，芯层采用VEGF溶液，壳层采用溶解有PLCL/collagen以及WNCNT的纺丝液；构建壳层为col以及PLCL、芯层为VEGF细胞因子溶液静电纺丝心肌支架；
3)将分离的动物心肌细胞作为种子细胞种于膜片上
取心肌细胞分离培养，将细胞悬液重布于消毒的膜片；
4)生物型心室辅助泵的构建
将膜片上种植心肌细胞后，将该细胞材料复合物按照心肌三层的排列方向叠加为三层，然后，制作成圆锥形袖套状结构。
在上述生物型心室辅助泵的制备方法中，优选的，所述步骤1)的MWCNT的纺丝液浓度为4％和8％。
在上述生物型心室辅助泵的制备方法中，优选的，所述步骤1)共轭纺丝的参数为：电压25kv，正极连接喷丝针头，负极连接接收滚筒，针头至接收滚筒的距离为20cm，接收滚筒的转速为2000r/min。
在上述生物型心室辅助泵的制备方法中，优选的，所述步骤2)中PLCL/collagen浓度为10％。
在上述生物型心室辅助泵的制备方法中，优选的，所述步骤2)中VEGF溶液的浓度为1％。
在上述生物型心室辅助泵的制备方法中，优选的，所述步骤2)中同轴静电纺丝的参数为：纺丝时电压25kv，距离20cm。
在上述生物型心室辅助泵的制备方法中，优选的，所述步骤3)中先将心肌组织剪碎呈匀浆状用0.05％的胰酶消化20分钟后，用血清终止消化，将混悬液经组织滤网反复过滤，保留下层细胞悬液，离心后获取细胞沉淀。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
由如上所述的制备方法制备得到的生物型心室辅助泵，所述生物型心室辅助泵为种有心肌细胞的心肌支架，按照心肌纤维分为内纵、中环，外斜三层结构分层排列，整体呈圆锥形袖套状结构。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵，所述辅助泵整体呈锥形袖套状结构，上端开口，下端闭合，由内纵层、中环层和外斜层三层心肌纤维膜支架叠加构成；所述内纵层心肌纤维膜支架的纤维纵向取向，所述中环层心肌纤维膜支架的纤维横向取向，所述外斜层心肌纤维膜支架的纤维斜向取向；在内纵层、中环层和外斜层心肌纤维膜支架上分别种植有心肌细胞。
在上述基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵中，优选的，所述纺丝由芯层和壳层构成，所述芯层为VEGF溶液，所述壳层为MWCNT/col/PLCL高分子材料。
本发明基于CNT改性的有序排列载VEGF的CNT/Collagen/PLCL导电传感心肌支架，将更好地仿生心肌细胞外基质结构，引导细胞的定向排列。在心肌支架的基础上构建具有生物活性的可搏动性心肌形成袖套状结构的生物型心室辅助泵，包绕在心脏外层可用于辅助心脏收缩，从而可为广大终末期心衰患儿从根本上赋予心室持续收缩的动力性，从而彻底改善患儿预后及提高生存质量，甚至可避免心脏移植。
心室辅助装置是挽救终末期心衰患儿生命的重要手段。袖套状生物型心室辅助泵可弥补传统机械辅助泵的不足。整个实验的实施基于动物实验，取得了一定的成果，有望为广大终末期心衰患儿从根本上赋予心室持续收缩的动力性，从而彻底改善患儿预后及提高生存质量，降低患者住院费用及远期成本。
附图说明
附图1含MWCNT取向静电纺丝心肌支架光镜和扫描电镜图(A.4％MWCNT心肌支架光镜图，图1B.8％MWCNT心肌支架光镜图，图1C.支架扫描电镜图)。
附图2芯层为VEGF细胞因子溶液心肌支架透射电镜图。
附图3心肌膜片的特性(A.含有不同浓度MWCNT的心肌支架的弹性模量，B.含有不同浓度MWCNT的心肌支架的导电性)。
附图4原代心肌细胞种植于膜片上的光镜图和免疫荧光鉴定(A.光镜图，B.αMHC荧光鉴定图)。
图5不同心肌支架上心肌细胞的存活情况。A.4％MWCNT支架上心肌细胞存活较好(绿色活细胞；红色死细胞)，B.不同浓度MWCNT支架上心肌细胞存活率。
图6生物型心室辅助泵构建模式图。将种有心肌细胞的有序负载VEGF的CNT/collagen/PLCL心肌支架按照心肌纤维内纵、中环、外斜三层结构分层排列。
图7A为内纵层心肌支架结构示意图。
图7B为内纵层心肌支架包绕在心脏外层的示意图。
图8A为中环层心肌支架结构示意图。
图8B为中环层心肌支架包绕在心脏外层的示意图。
图9A为外斜层心肌支架结构示意图。
图9B为外斜层心肌支架包绕在心脏外层的示意图。
图10为内纵层、中环层、外斜层心肌支架彼此交错的平面示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵的制备
1、含有复壁碳纳米管的取向静电纺丝心肌支架的制备
方法：将购买于新加坡cheaptube公司生产改良减毒的具有导电性的复壁碳纳米管(multiwall carbon nanotube,MWCNT)，按照不同配比溶解于六氟乙醇，磁力搅拌子充分搅拌混匀，制备含4％和8％MWCNT的纺丝液。采用共轭纺丝技术，制备取向性的静电纺丝心肌支架，电压25kv，正极连接喷丝针头，负极连接接收滚筒。针头至接收滚筒的距离为20cm，接收滚筒的转速为2000r/min。将纺制好的膜片真空干燥箱中充分烘干1月，待有机溶剂充分挥发再分别用光镜、扫描电镜观察纺丝的排列。
结果：在光镜下及扫描电镜下可见，支架中的MWCNT在平行的纺丝间取向均匀分布，使其具有良好的导电性。随着WNCNT的浓度增高，膜片颜色加深。这为心肌细胞在膜片上取向排列提供了基础(图1)。
2、通过同轴静电纺丝技术构建负载VEGF细胞因子的心肌支架
方法：采用同轴静电纺丝技术，芯层采用1％的VEGF溶液，壳层采用溶解有10％PLCL/collagen以及不同浓度WNCNT的纺丝液。构建壳层为col以及PLCL、芯层为VEGF细胞因子溶液静电纺丝心肌支架。纺丝时电压25kv，距离20cm。再通过透射电镜观察膜片纺丝结构。
结果：通过透射电镜可见纺丝中间芯层为VEGF溶液，壳层为可降解的MWCNT/col/PLCL高分子材料。这种制备方式结合高分子可降解材料能够实现在支架在应用的过程中缓慢释放具有活性的VEGF细胞因子(图2)。
3、含有不同MWCNT的心肌支架的力学性能及导电性
方法：用XT2i纹理分析器(texture Technologies,Hamilton,MA,USA)测试心肌支架的力学性能。样品在0.1mm/s下，从5％-15％应变对应的线性区域的斜率进行测量。得到的压缩模量取平均值。通过三点探针(Oakton Instruments，Vernon Hills，IL，USA)评估心肌支架的电导率。将心肌支架浸入PBS溶液中，每个支架在27kHz的频率下获取每个样品的四个电导率读数。
结果：每组实验重复三次。随着MWCNT含量的增加心肌支架的弹性模量增加，组间差异具有统计学意义(P<0.01)(图3A)。随着MWCNT含量的增加心肌支架的导电性逐渐增加，组间差异具有统计学意义(P<0.01)(图3B)。
4、分离培养小鼠心肌细胞作为种子细胞种于膜片上
方法：取乳鼠的左心室进行心肌细胞的分离培养。将获取的左心室心肌组织剪碎呈匀浆状用0.05％的胰酶消化20分钟后，用血清终止消化。将混悬液经组织滤网反复过滤，保留下层细胞悬液，离心后获取细胞沉淀。将反复紫外照射、酒精浸泡消毒的膜片至于100mm培养皿底部，并细胞悬液重布于膜片上。
结果：培7天左右原代心肌细胞达到100％汇合率，有序排列，并且能够成片跳动，实现整体心肌组织兴奋收缩偶联，达到同步节律性收缩，镜下的心肌细胞呈多角形(图4)。对培养的原代心肌细胞进行αMHC荧光标记鉴定(图4)。
5、膜片生物相容性鉴定
方法：将MWCNT取向静电纺丝膜片泡于酒精中紫外灯下照射2小时彻底消毒后，用PBS反复冲洗后，用于细胞培养。将原代细胞以1×106浓度种于膜片上，隔天换液。4天后，弃上层培养液，添加死活细胞染料，对膜片上细胞活性进行鉴定。用image J软件分别统计含有不同浓度的心肌支架上心肌细胞的存活情况。
结果：随着MWCNT含量的增加，细胞存活减少。细胞在8％MWCNT膜片上黏附较少，而在4％MWCNT膜片能较多的粘附且活性较好(图5A)。
6、生物型心室辅助泵的构建
方法：将膜片上种植心肌细胞后，将该细胞材料复合物按照心肌三层的排列方向叠加为三层，然后，制作成圆锥形袖套状结构。
结果：种有心肌细胞的心肌支架，按照心肌纤维大致分为内纵、中环，外斜三层结构分层排列(图6)。
实施例2生物型心室辅助泵
如图7-10所示，图7A为内纵层心肌支架结构示意图，图7B为内纵层心肌支架包绕在心脏外层的示意图，图8A为中环层心肌支架结构示意图，图8B为中环层心肌支架包绕在心脏外层的示意图，图9A为外斜层心肌支架结构示意图，图9B为外斜层心肌支架包绕在心脏外层的示意图，图10为内纵层、中环层、外斜层心肌支架彼此交错的平面示意图。
一种基于共轭同轴静电纺丝技术的生物型心室辅助泵，所述辅助泵整体呈锥形袖套状结构，上端具有开口1，下端为闭合2，由内纵层3、中环层4和外斜层5三层心肌纤维膜支架叠加构成，使用时将心脏从开口1置入辅助泵内，内纵层3、中环层4和外斜层5三层依次叠加包绕在心脏外层，通过三层心肌纤维膜支架上种植的心肌组织自身节律性收缩为心室收缩提供动力，从而辅助心脏收缩。本实施例中，所述内纵层心肌纤维膜支架的纤维纵向取向(图7A)，所述中环层心肌纤维膜支架的纤维横向取向(图8A)，所述外斜层心肌纤维膜支架的纤维斜向取向(图9A)；在内纵层、中环层和外斜层的心肌纤维膜支架上分别种植有心肌细胞。
需要说明的是，所述心肌纤维膜支架是通过静电纺丝技术制备，其中纺丝由芯层和壳层构成，所述芯层为VEGF溶液，所述壳层为MWCNT/col/PLCL高分子材料。本实施例中基于CNT改性的有序排列载VEGF的CNT/Collagen/PLCL导电传感心肌支架，可以更好地仿生心肌细胞外基质结构，引导细胞定向排列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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