不饱和脂肪酸化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 不饱和脂肪酸化合物及其制备方法和应用 (Unsaturated fatty acid compound and preparation method and application thereof ) 是由 农旭华 李小宝 陈光英 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种不饱和脂肪酸化合物及其制备方法和应用,从海洋真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218的发酵液中分离得到,这类不饱和脂肪酸化合物具有明显的抑制植物病原真菌活性,可用于制备抗植物病原真菌农药。尤其是不饱和脂肪酸化合物2对植物病原真菌茄镰孢菌Fusarium solani bio-80814有较显著的抑制作用,在制备抗植物病原真菌农药方面有良好的应用前景。此外,由于不饱和脂肪酸在大自然中容易被降解,毒性小。因此本发明的不饱和脂肪酸化合物能用于制备绿色的抗植物病原真菌茄镰孢菌农药。(The invention discloses an unsaturated fatty acid compound, a preparation method and application thereof, which are prepared from marine fungi Aspergillus sp. The unsaturated fatty acid compound is separated from fermentation liquor of GDMCC 61218, and has obvious effect of inhibiting plant pathogenThe activity of fungus can be used for preparing pesticide for resisting plant pathogenic fungi. In particular unsaturated fatty acid compound 2 against the plant pathogenic fungus Fusarium solani Fusarium solani Bio-80814 has a remarkable inhibiting effect and has a good application prospect in the aspect of preparing plant pathogenic fungus resistant pesticides. In addition, the unsaturated fatty acid is easily degraded in nature and has low toxicity. Therefore, the unsaturated fatty acid compound can be used for preparing green pesticide for resisting plant pathogenic fungi fusarium solani.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及从海洋真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218的发酵液中分离得到一类不饱和脂肪酸化合物及其制备方法和应用。
背景技术
海洋真菌为了适应复杂特殊的海洋环境,形成了独特的生存和代谢机制,使得海洋生物常产生许多结构复杂、活性显著、产量相对较高的化合物，这些化合物是新药开发的重要来源。
不饱和脂肪酸化合物是一类自然界中存在的具有多种生物活性的物质，无论是天然存在的，还是人工合成得到的，都引起了化学家的广泛关注。
例如硕士论文《三株海洋真菌次级代谢产物的研究》（王月，厦门大学，2017年）对海藻共附生曲霉(Aspergillus sp.ZbL-14)采用了大米培养基，从中共分离到单体化合物17个，其中有2个不饱和脂肪酸类化合物(WY-01-071-01和 WY-01-085-03)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一类具有抑制植物病原真菌生长活性的不饱和脂肪酸化合物，及其制备方法和应用。
实现本发明目的的技术方案是一种不饱和脂肪酸化合物，结构式如下：
,
其中m=5，n=0或1；或者m=7，n=1。
一种如上所述的不饱和脂肪酸化合物的制备方法，包括以下步骤：
①菌株发酵，将真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218发酵得到发酵液。
②发酵产物的提取；
将步骤①发酵后得到的发酵液用乙酸乙酯溶剂萃取或者大孔吸附树脂提取，然后减压浓缩得到粗提物；
粗提物进行常压柱层析：以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比100:0 到 0:100进行梯度洗脱，结合薄层板分析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比8:2的石油醚-乙酸乙酯溶剂系统展开的组分，经过硅胶柱层析得到6个亚馏分；或者以石油醚-丙酮作为洗脱剂，从体积比100:0 到 0:100进行梯度洗脱，结合薄层板分析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比9:1的石油醚-丙酮溶剂系统展开的组分，经过正相硅胶柱层析得到6个亚馏分。
③分离纯化；亚馏分经高效液相色谱纯化，得到权利要求1所述的化合物。
使用高效液相色谱纯化分离纯化时，将亚馏分3经高效液相色谱分离纯化（流动相为体积比为70:30的甲醇-水），分别在出峰时间为7和5分钟时制备得到m=5，n=0的化合物1和m=5，n=1的化合物2；将亚馏分5经高效液相色谱分离纯化（流动相为体积比为70:30的甲醇-水），在出峰时间为8分钟时制备得到m=7，n=1的化合物3。
步骤①菌株发酵时，先准备PDA种子液培养基、PDA琼脂培养基和PDA发酵培养基；然后用竹签将斜面上的真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218菌种接种到PDA琼脂培养基上培养活化，得到培养有菌种的平板；接着用竹签从平板中挑选单菌落接种到上述含 PDA种子液培养基的三角烧瓶中，摇床培养3天得到种子液；再分别将种子液接种到每个装有400mL PDA发酵培养基的三角烧瓶中，静置培养后完成发酵过程。
一种如上所述化合物在制备抗植物病原真菌茄镰孢菌Fusarium solani bio-80814的农药中的应用。
本发明具有积极的效果：本发明从海洋真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218的发酵液中分离得到一类新的不饱和脂肪酸化合物，这类不饱和脂肪酸化合物具有明显的抑制植物病原真菌活性，可用于制备抗植物病原真菌农药。尤其是不饱和脂肪酸化合物2对植物病原真菌茄镰孢菌Fusarium solani bio-80814有较显著的抑制作用，在制备抗植物病原真菌农药方面有良好的应用前景。此外，由于不饱和脂肪酸在大自然中容易被降解，毒性小。因此本发明的不饱和脂肪酸化合物能用于制备绿色的抗植物病原真菌茄镰孢菌农药。
附图说明
图1为分离得到的不饱和脂肪酸化合物1的高分辨质谱图。
图2为分离得到的不饱和脂肪酸化合物1的核磁共振H谱图。
图3为分离得到的不饱和脂肪酸化合物1的核磁共振C谱图。
图4为分离得到的不饱和脂肪酸化合物2的高分辨质谱图。
图5为分离得到的不饱和脂肪酸化合物2的核磁共振H谱图。
图6为分离得到的不饱和脂肪酸化合物2的核磁共振C谱图。
图7为分离得到的不饱和脂肪酸化合物3的高分辨质谱图。
图8为分离得到的不饱和脂肪酸化合物3的核磁共振H谱图。
图9为分离得到的不饱和脂肪酸化合物3的核磁共振C谱图。
具体实施方式
（实施例1、不饱和脂肪酸化合物的制备方法）
本实施例从海洋真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218的发酵液中分离纯化得到一类新的不饱和脂肪酸化合物，所述真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218购自广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：中国，广州，广东省微生物所，保藏号为GDMCC 61218。
不饱和脂肪酸化合物的制备方法包括以下步骤：
①菌株发酵。将真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218接种到曲霉属真菌适用的培养基中，在通常的发酵条件下发酵后得到发酵液。
本实施例中发酵过程如下：
准备PDA种子液培养基、PDA琼脂培养基和PDA发酵培养基，具体操作如下：
PDA种子液培养基的配制：将200 g土豆洗净去皮，切成片状并水煮，水沸腾后煮30分钟，纱布过滤除去残渣，滤液中加葡萄糖20 g，海盐30 g，最后定容到1 L。将PDA培养基装入500 mL的三角烧瓶中，每瓶约200 mL，在121 ℃高压蒸汽灭菌25分钟。
PDA琼脂培养基的配制：将200 g土豆洗净去皮，切成片状并水煮，水沸腾后煮30分钟，纱布过滤除去残渣，滤液中加葡萄糖20 g，海盐30 g，琼脂20 g，最后定容到1升。121 ℃高压蒸汽灭菌25分钟，备用。
PDA发酵培养基的配制：与种子液培养基的配制完全相同。将200 g土豆洗净去皮，切成片状并水煮，水沸腾后煮30分钟，纱布过滤除去残渣，滤液中加葡萄糖20 g，海盐30 g，最后定容到1 L。将PDA培养基装入1000 mL容量的三角瓶中，每瓶约400 mL，在121 ℃高压蒸汽灭菌25分钟。
用竹签将斜面上的真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218菌种接种到PDA琼脂培养基上，在28 ℃下培养3天，得到培养有菌种的平板；然后用竹签从平板中挑选单菌落接种到上述含150 mL PDA种子液培养基的三角烧瓶中，于摇床上200 rpm、28 ℃下培养3天，得到种子液；再分别将5 mL种子液接种到每个装有400 mL PDA发酵培养基的三角烧瓶中，于室温（28 ℃）静置培养28天后，收瓶。
②发酵产物的提取。
将步骤①发酵后得到的发酵液用乙酸乙酯溶剂萃取或者大孔吸附树脂提取（本实施例中采用乙酸乙酯萃取），然后减压浓缩得到粗提物20 g。
粗提物用正相硅胶（100-200目）均匀混合后，装入玻璃层析柱（含正相硅胶100-200目，约300g），进行常压柱层析：以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比100:0 到 0:100进行梯度洗脱，结合薄层板分析追踪合并组分；将在薄层层析上能用体积比8:2的石油醚-乙酸乙酯溶剂系统展开的组分（2 g），经过正相硅胶柱层析得到6个亚馏分。
除了本实施例采用上述石油醚-乙酸乙酯系统洗脱正相色谱柱，还可以采用石油醚-丙酮体系洗脱。利用石油醚-乙酸乙酯体系（8:2）或石油醚-丙酮体系（9:1）洗脱可以收集到初样，TLC分析表明应用石油醚-乙酸乙酯（体积比8:2）展开时，化合物1-3的Rf值为0.5，应用石油醚-丙酮体系（体积比9:1）展开时，化合物1-3的Rf值为0.3。
③分离纯化。亚馏分3再经高效液相色谱分离纯化（检测波长为210/230/254/280nm，流速为2 mL/min，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 column（9.4 × 250 mm，5 µm)，高效液相色谱分离纯化流动相为体积比为70:30的甲醇-水），分别在出峰时间为7和5 min时制备得到化合物1和2。
亚馏分5再经高效液相色谱分离纯化（检测波长为210/230/254/280 nm，流速为2mL/min，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 column（9.4 × 250 mm，5 µm) ，流动相为体积比为70:30的甲醇-水）高效液相色谱分离纯化，在出峰时间为8 min时制备得到化合物3。
化合物1的高分辨质谱图见图1，核磁共振H谱图见图2，核磁共振C谱图见图3，结构解析如下：
通过高分辨质谱（HRESIMS）在m/z 199.0976 [M-H]-，199.0977 [M-H]-处给出准分子离子峰，得知化合物1的分子式为C10H16O4。
1H-NMR显示2个烯质子信号（δ H 6.00, 5.52），一个氧甲基信号（δ H 3.56）。13C-NMR和DEPT135显示2个酯羰基 (δ C 173.4, 168.2)、1个不饱和亚甲基 (δ C 124.1)、1个烯烃季碳 (δ C 141.3)、5个亚甲基 (δ C 33.3, 31.3, 28.2, 27.8, 24.4)、以及1个氧甲基（δ C 51.2）。在HMBC谱中，H-3和C-1/C-2/C-4/C-5/C-11相关，H-7和C-5/C-6/C-8相关，Me-10和C-8相关及H-11和C-1/C-2/C-3相关。在COSY谱中，H-3和H-4/H-11相关，H-6和H-7相关。再结合分子量确定化合物1的结构式如下：
。
化合物1的外观为淡黄色油状，易溶于氯仿、甲醇、DMSO，难溶于水。
化合物2的高分辨质谱图见图4，核磁共振H谱图见图5，核磁共振C谱图见图6，结构解析如下：
通过高分辨质谱（HRESIMS）在m/z 213.1132 [M-H]-，213.1132[M-H]-处给出准分子离子峰，得知化合物2的分子式为C11H17O4。
1H-NMR显示2个烯质子信号（δ H 6.01, 5.55），一个氧化的亚甲基信号（δ H 4.06），一个甲基信号（δ H 1.18）。13C-NMR和DEPT135显示2个酯羰基 (δ C 172.9, 168.1)、1个不饱和亚甲基 (δ C 124.2)、1个烯烃季碳 (δ C 141.0)、6个亚甲基包括一个氧化的亚甲基 (δ C59.6)、以及1个甲基（δ C 14.1）。结合1H，13C-NMR核磁数据（表1），观察到2与1区别在于2少了一个氧甲基 (δ C 51.2)，多了一个氧化的亚甲基(δ C 59.6)和甲基(δ C 14.1)。进一步分析HMBC谱，观察到Me-11 和C-10相关，H2-10和C-8相关。在COSY谱中，H2-10和Me-11相关。由此推断2和1的区别在于2的C-8上连着一个氧化的亚甲基，因此确定化合物2的结构式如下：
。
化合物2的外观为淡黄色油状，易溶于氯仿、甲醇、DMSO，难溶于水。
化合物3的高分辨质谱图见图7，核磁共振H谱图见图8，核磁共振C谱图见图9，结构解析如下：
通过高分辨质谱（HRESIMS）在m/z 241.1445 [M-H]-，241.1453 [M-H]-处给出准分子离子峰，得知化合物3的分子式为C13H21O4。
结合1H，13C-NMR核磁数据（表1），观察到3与2区别在于多了2个亚甲基信号。在HMBC谱，观察H-3和C-1/C-2/C-4/C-5/C-12相关，H-4和C-2/C-3/C-5/5a相关，H-7和C-6/C-6a/C-8相关，H2-10和C-8/C-11相关及Me-11和C-10相关。在COSY中，观察到H-3和H-4/H-12相关，H-6和H-6a/H-7相关，H-1和H-11相关，因此确定化合物3的结构式如下：
。
化合物3的外观为淡黄色油状，易溶于氯仿、甲醇、DMSO，难溶于水。
上述化合物1、化合物2、化合物3的核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示。
表1. 化合物1-3的NMR数据（在DMSO-d 6溶剂中）
a overlapped。
（实施例2）
本实施例的不饱和脂肪酸化合物的制备方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
步骤②常压柱层析时，以石油醚-丙酮作为洗脱剂，从体积比100:0 到 0:100进行梯度洗脱，结合薄层板分析追踪合并组分；将在薄层层析上能用体积比9:1的石油醚-丙酮溶剂系统展开的组分（2 g），经过硅胶柱层析得到6个亚馏分。用高效液相色谱分离时，使用乙腈-水溶剂系统洗脱。
（试验例1、化合物1-3的抗菌试验）
采用滤纸片法测试化合物1-3对六株植物病原真菌：芒果炭疽病菌Colletotrichum asianum HNM 408、橡胶树炭疽病菌Colletotrichum acutatum HNMRC178、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum HNM 1003、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzaeHNM 1003、串珠镰孢菌 Fusarium moniliforme bio-52799和茄镰孢菌Fusarium solanibio-80814的抗菌活性，过程如下：
1、样品1-3和阳性对照多菌灵分别用DMSO溶解并配置成10 mg/mL的浓度，并倍半稀释成相应的浓度（10 µg/µL，5 µg/ µL，2.5 µg/ µL，1.25 µg/ µL）。
2、 真菌Aspergillus sp. GDMCC 61218活化后，用0.02%土温-80的水溶液稀释，检测孢子浓度约为106-107 spores/mL。
3、 在新鲜PDA固体培养基上加入100 µL稀释菌液，均匀涂布。
4、 把滤纸片贴在涂布好的平板上，每个滤纸片上载入5µL样品量。样品做三个平行，以DMSO为阴性对照，多菌灵为阳性对照。
5、 培养皿放在培养箱培养3天后，观察滤纸片抑制圈的大小并测量。
检测结果见表2。
表2. 化合物1-3以及阳性对照多菌灵的抗植物病原真菌茄镰孢菌Fusarium solani bio-80814活性（6.25µg/disc）
对六株植物病原真菌的抗菌实验结果表明，化合物2对植物病原真菌茄镰孢菌Fusarium solani bio-80814有较显著的抑制能力，在6.25 µg/disc条件下的抑制圈为6mm；化合物1和3对植物病原真菌茄镰孢菌Fusarium solani bio-80814有微弱的抑制能力，在6.25 µg/disc条件下的抑制圈为3 mm。