一种重组人白介素-6的制备方法
阅读说明：本技术 一种重组人白介素-6的制备方法 (Preparation method of recombinant human interleukin-6 ) 是由 任军 王耀辉 贾凌云 于 2021-02-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组人白介素-6的制备方法,属于生物工程领域。包括如下步骤：(1)原核表达方式制备重组人白介素-6包涵体；(2)采用含尿素的洗涤缓冲液A中清洗重组人白介素-6包涵体,再用洗涤缓冲液B洗涤重组人白介素-6包涵体,离心收集固体；(3)初步纯化后的重组人白介素-6包涵体经含有β-巯基乙醇的变性液中至完全溶解,缓慢加入复性液使重组人白介素-6包涵体复性,再进行透析和超滤浓缩；(4)使用填充Anti-IL-6高亲和吸附剂的亲和吸附柱对复性的重组人白介素-6包涵体进行亲和纯化,即得。本发明操作简单,处理样本大,步骤少,复性率高。本发明所涉及的重组人白介素-6的回收率为21％,具有较高的回收率。(The invention discloses a preparation method of recombinant human interleukin-6, belonging to the field of bioengineering. The method comprises the following steps: (1) preparing a recombinant human interleukin-6 inclusion body in a prokaryotic expression mode; (2) washing the recombinant human interleukin-6 inclusion body in a washing buffer solution A containing urea, washing the recombinant human interleukin-6 inclusion body with a washing buffer solution B, and centrifugally collecting solids; (3) the recombinant human interleukin-6 inclusion body after preliminary purification is dissolved completely in a denaturating liquid containing beta-mercaptoethanol, renaturation liquid is slowly added to ensure that the recombinant human interleukin-6 inclusion body is renatured, and then dialysis and ultrafiltration concentration are carried out; (4) and (3) carrying out affinity purification on the renatured recombinant human interleukin-6 inclusion body by using an affinity adsorption column filled with Anti-IL-6 high-affinity adsorbent to obtain the recombinant human interleukin-6 inclusion body. The method has the advantages of simple operation, large sample processing, few steps and high renaturation rate. The recovery rate of the recombinant human interleukin-6 related by the invention is 21 percent, and the recovery rate is higher.)
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组人白介素-6的制备方法。
背景技术
在1985年，人白介素-6基因首次克隆为B细胞刺激因子2(BSF-2)，B细胞刺激因子2可诱导B细胞产生免疫球蛋白(Ig)，白介素-6被证明是一种典型的细胞因子。
白介素-6(Tsagarakis S,Kontogeorgos G,Glannou P,et al.Interleukin-6,agrowth promoting cytokine,is present in human pituitary adenomas:animmunocytochemical study[J].Clinical Endocrinology,1992,37.)是一种单链糖蛋白，用于执行信号诱导B细胞分化和差异刺激或抑制细胞生长，具有不同的细胞来源，通常由激活的巨噬细胞、淋巴细胞以及上皮细胞分泌，含有183个氨基酸残基，由于糖基化和磷酸化的程度不一样，不同细胞来源的白介素-6的分子质量为22-30kDa。
白介素-6具有广泛的生物学功能，白介素-6在炎症、免疫反应、造血等方面具有多效性，它可以诱导肝内c反应蛋白(CRP)、补体C3、纤维蛋白原、血小板生成素、血清淀粉样蛋白A和铁调素等急性期蛋白的合成，而抑制白蛋白的生成。高浓度的淀粉样蛋白长时间存在会形成并发症淀粉样变。白介素-6在肝细胞再生中具有浓度依赖性，高水平白介素-6可能抑制肝细胞再生，甚至加重肝损伤，铁调素的产生也会造成与炎症相关的低铁血症和贫血。在造血过程中，白介素-6促进造血干细胞的分化和巨核细胞的成熟，从而导致血小板的释放。白介素-6不仅能促进纤维蛋白原的产生和血小板的释放，而且能激活凝血系统。白介素-6在单核细胞表面诱导组织因子(TF)，通过启动外源性凝血途径促进凝血，进而导致凝血酶的产生。白介素-6也被证明可以激活血管内皮(VE)细胞。VE-钙粘蛋白是一种重要的分子，通过同类分子间结合促进相邻细胞的内皮粘附，而白介素-6可使其分解导致血管渗漏。此外，白介素-6增加了血管内皮生长因子(VEGF)的生成，从而诱导了VE-钙粘蛋白的磷酸化和内化，从而对内皮细胞具有强大的血管通透性作用。通过白介素-6自身或通过VEGF的导入，血管通透性导致间质性水肿，升高组织压力，导致炎症性损伤。
白介素-6在获得性免疫反应中也扮演着重要角色，白介素-6可以刺激抗体产生，促使CD4+细胞诱导分化为效应T细胞。白介素-6的持续或过度分泌失调导致各种疾病的发生或发展。过量表达的白介素-6参与Castleman病的淋巴结肿大,也会增强血管的再生和类风湿性关节炎患者的骨质疏松症。同时白介素-6也作为重要的促炎症细胞因子，在细胞因子风暴的扩大级联反应中起重要作用。
白介素-6具有众多的生物学功能，在一些疾病中被发现是一种可靠治疗靶点，其中包括脓毒血症，类风湿性关节炎等，有研究表明针对白介素-6的靶向治疗在一些癌症治疗中也是有效的。
而目前针对重组人白介素-6的制备中，如Li等人(Li,Y.Y.,Chen,C.X.,VonSpecht,B.U.,and Hahn,H.P.(2002)Protein Expr.Purif.25,437–447.)，重组人白介素-6以可溶蛋白表达，该方法虽得到可溶具有活性的蛋白，但是总收率较低，只有18ug/L。同时也有许多报道，通过加入分子伴侣改变其可溶表达量，最高可达2.6mg/L。重组人白细胞介素-6与麦芽糖结合蛋白相连并具有NusA标签，该重组蛋白具有高度可溶性，但分离这些标记以恢复生物活性需要几个蛋白水解裂解和纯化步骤，使这一过程耗时费力。
和许多其他重组蛋白一样，白介素-6可以在大肠杆菌中以包涵体这种不溶性聚集物的形式表达。而白介素-6想要成为具有活性的重组蛋白则需经过包涵体溶解，重新折叠到具有活性的结构。复性且纯化蛋白尤为重要。刘红岩等人通过复性后，阴离子交换层析和凝胶筛分纯化得到较纯的重组人白介素-6(刘红岩.白细胞介素-6基因的克隆、表达及中试生产工艺的初探[D].北京:中国协和医科大学，1998.)。也有人采用柱上层析复性(Ahmed,Nadeem，Matrix-assisted refolding and purification of placenta-derivedrecombinant human interleukin-6 produced in Escherichia coli[J]Biotechnologyand Applied Biochemistry,2014,61[5]:541-548.)，但是这些方法的步骤复杂，回收率低。
因此，为了获得具有活性的白介素-6，必须建立一种简单、可重复、易于扩展的下游工艺，以实现重组人白介素-6的大规模生产。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供一种新的重组人白介素-6的制备方法，本发明通过原核表达的方式大量获得重组人白介素-6包涵体，对包涵体进行洗涤，稀释复性，亲和层析纯化制备具有活性的可溶重组人白介素-6。
本发明采用稀释复性，同时只经过一步亲和纯化就可以得到纯度较高的重组人白介素-6。具有步骤简单，回收率较高的特点。
一种重组人白介素-6的制备方法，包括如下步骤：
(1)原核表达方式制备重组人白介素-6包涵体；
(2)采用含尿素的洗涤缓冲液A清洗重组人白介素-6包涵体，再用洗涤缓冲液B洗涤重组人白介素-6包涵体以除去尿素，离心收集固体，所得固体为初步纯化后的重组人白介素-6包涵体；
(3)初步纯化后的重组人白介素-6包涵体加入含有β-巯基乙醇的变性液中，至重组人白介素-6包涵体完全溶解，缓慢加入复性液使重组人白介素-6低温静置复性，再进行透析和超滤浓缩，得到复性的重组人白介素-6；
(4)使用填充Anti-IL-6高亲和吸附介质的亲和吸附柱对复性的重组人白介素-6包涵体进行亲和纯化，得到重组人白介素-6。
进一步地，步骤(1)中原核表达方式制备重组人白介素-6包涵体的具体方法包括如下步骤：将重组人白介素-6序列导入pET-21a或pET-24a表达载体中制成重组质粒，将重组质粒转化至E.coli BL21或E.coli ShuffleT7中，扩大表达，收集高效表达重组人白介素-6的菌体用IPTG诱导剂诱导，收集菌体并将菌体破碎至菌液相对透明、不再粘稠，收集沉淀即为重组人白介素-6包涵体。
进一步地，菌体破碎采用高压匀浆破碎或超声破碎，其破碎缓冲液为：10-30mMTris-HCl，10-15ml/L Triton(pH＝8-9)，按质量比为1：6-1：10加入破碎缓冲液，磁力搅拌，使菌体充分重悬于破碎缓冲液中。
进一步地，采用高压匀浆破碎，在压力值显示700-800bar，循环破碎5-6次，至菌液相对透明，不再粘稠，菌体破碎完毕，在4-8℃下，4000-5000rpm离心10-20min弃去上清，收集重组人白介素-6包涵体沉淀。
其中Triton作为一种中性去污剂，可有效溶解部分脂质以及杂蛋白，采用低速离心以达到初步纯化的目的，其中Triton的终浓度不应少于1％，
进一步地，步骤(2)中的洗涤缓冲液A为10-50mM Tris-HCl，1-4M尿素，80-200mMNaCl(pH＝8-9)，洗涤缓冲液B为10-50mM Tris-HCl(pH＝8-9)。其中采用洗涤缓冲液B洗涤应尽量除去多余的尿素。
高浓度尿素可以有效溶解掺杂在目的包涵体中的杂蛋白，适当的调节尿素浓度可以有效地提高目的蛋白浓度，浓度越高除杂效果越好，当尿素浓度大于2M，重组人白介素-6包涵体开始出现溶解现象。
进一步地，步骤(3)所述含有β-巯基乙醇的变性液为6-8M盐酸胍，100-200mMNaCl，1-1.5‰β-巯基乙醇的混合溶液或浓度大于8M的尿素，100-200mM NaCl，10-15mM DTT的混合溶液。相较尿素，盐酸胍具有更好地溶解效果。
变性的具体方法为将20-100mg重组人白介素-6包涵体溶解于变性液中，4-8℃静置，待包涵体充分溶解。
进一步地，步骤(3)所述复性液为0.5-1.5M盐酸胍，50-150mM Tris-HCl，8-12mMEDTA，0.25-0.5mM GSSG(氧化型)，2.5-5mM GSH(还原型)，300-700mM精氨酸，2-5％甘油，pH＝8-9；加入复性液的速度为0.1-0.5mL/min；4-6℃静置20-40h。
具体为将40-200ml含有0.5-1.5M盐酸胍，50-150mM Tris-HCl，8-12mM EDTA，0.25-0.5mM GSSG(氧化型)，2.5-5mM GSH(还原型)，300-700mM精氨酸，2-5％甘油(pH＝8-9)的复性液按0.1-0.5ml/min缓慢加入溶解有包涵体的变性液中，4-6℃边加边搅拌。
其中复性液中加入盐酸胍，可以明显提升复性效率，低浓度盐酸胍可以减少当复性液滴加至变性液中由于环境迅速改变所引起的包涵体再次析出的情况。
其中复性液中精氨酸浓度可以有效抑制蛋白聚集，提高复性效率。终浓度应该在300mM以上。
其中当复性液中精氨酸浓度只有200mM时，蛋白的总复性率不足5％。
进一步地，采用透析方式除去溶液中多余盐成分，步骤(3)中透析所用透析外液为10-50mM Tris溶液。透析换液三次以上，每次透析时间为12-18h。
进一步地，步骤(4)中亲和纯化的方法为：将步骤(3)所得复性的重组人白介素-6包涵体溶液以0.2-1mL/min流过以高亲和力Anti-IL-6抗体为亲和配基，CL-6B琼脂糖凝胶微球为固载介质的亲和吸附柱，用PBS溶液平衡高亲和吸附柱；采用pH＝1.5-2的Gly-HCl溶液对吸附柱进行洗脱，将洗脱的重组人白介素-6蛋白用超滤管以超滤换液的方式置换到pH＝8-9的10-50mM Tris-HCl溶液中，即得纯化后的重组人白介素-6。
本发明所涉及的重组人白激素-6的制备方式通过原核表达的方式可以有效地节省成本，同时通过包涵体预处理以及包涵体稀释复性，再通过一步亲和吸附纯化，得到纯度较高具有活性的重组人白介素-6蛋白。
本发明只通过亲和层析纯化可有效地达到纯化和富集的效果。采用亲和纯化具有操作简单，处理样本大，步骤少等特点。有效地减少处理步骤可以减少损失，提高复性率。本发明所涉及的重组人白激素-6的回收率为21％，具有较高的回收率。
附图说明
图1为实施例2中重组人白介素-6包涵体的初步纯化SDS-PAGE电泳分析图；图中，泳道1：Marker；泳道2：实施例1中诱导前的菌体；泳道3：实施例1中诱导后的菌体；泳道4：实施例1中菌体破碎后的沉淀；泳道5：实施例1中菌体破碎后的上清；泳道6：实施例2中洗涤后的包涵体。
图2为实施例4中重组人白介素-6包涵体的吸附纯化前后SDS-PAGE电泳分析图；图中，泳道1：Marker；泳道2：亲和层析纯化前；泳道3：亲和层析纯化后。
图3为实施例5中Anti-IL-6纳米抗体活性验证非变性电泳图；图中，泳道1：Anti-IL-6纳米抗体；泳道2、泳道4、泳道6、泳道8、泳道10：Anti-IL-6纳米抗体与复性后的重组人白介素-6按1:1，1:2，1:3，1:4(质量比)混合；泳道3、泳道5、泳道7、泳道9、泳道11：对应的抗原。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
本实验方案为重组人白介素-6包涵体的制备，具体操作如下：
将重组人白介素-6基因序列(如SEQ ID NO.1所示)构建到PET-21a表达载体上(生工生物工程有限公司，上海)，制备重组质粒。将构建好的重组质粒转化到E.coliBL-21菌株，进行扩大培养，4％(体积比)接种，采用37℃培养6h，37℃诱导5h，诱导剂IPTG终浓度为0.5mM。高速离心收获菌体，并用双蒸水清洗菌体三次，选用破碎液：20mM Tris-HCl，10ml/LTriton(pH＝8.5)按体积比1：8重悬，采用高压匀浆破碎，在压力值显示700-800bar，循环破碎5-6次，至菌液相对透明，不再粘稠，菌体破碎完毕，在4℃下，5000rpm离心10min，弃去上清，收集包涵体沉淀。
实施例2
本实验方案为重组人白介素-6包涵体的初步纯化，具体操作如下：
实施例1所得包涵体用洗涤缓冲液(A)：20mM Tris-HCl，2M尿素，100mM NaCl(pH＝8.5)按1：20(体积比)重悬，充分润洗后，采用离心机10000rpm离心5min，弃去上清，重复三次，再用洗涤缓冲液(B)：20mM Tris-HCl(pH＝8.5)按沉淀物：洗涤缓冲液(B)为1：20(体积比)重悬，充分润洗后，采用离心机10000rpm离心5min，弃去上清，重复三次，分装备用。初步纯化结果如图1，图中，泳道1：Marker；泳道2：实施例1中诱导前；泳道3：实施例1中诱导后；泳道4：实施例1中破碎沉淀；泳道5：实施例1中破碎上清；泳道6：实施例2中洗涤后的重组人白介素-6包涵体。
实施例3
本实验方案为重组人白介素-6包涵体的复性过程，具体操作如下：
取50mg实施例2所得初步纯化后的重组人白介素-6包涵体溶解于10ml含有6M盐酸胍，200mM NaCl，1‰β-巯基乙醇的变性液中，搅拌至不再有明显沉淀视为溶解完成。将100ml含有1M盐酸胍，100mM Tris-HCl，8mM EDTA，0.25mM GSSG(氧化型)，2.5mM GSH(还原型)，500mM精氨酸，3％甘油(pH＝8.5)的复性液按0.3ml/min缓慢加入溶解有初步纯化后的重组人白介素-6包涵体的变性液中，4-6℃下边加边搅拌。待复性液加完，放置4℃静置20h。采用10mM Tris(pH＝8.5)溶液作为透析外液，于4℃透析换液三次以上，每次透析时间为12h。
将透析结束的蛋白溶液进行超滤浓缩，将适量的蛋白样品(不超过12ml，不少于1ml)加入到截留分子量为3000Da的超滤管中，在4℃下以4000g离心30min。
实施例4
本实验方案为重组人白介素-6的吸附纯化过程，具体操作如下：
采用以高亲和力Anti-IL-6抗体为亲和配基，CL-6B琼脂糖凝胶微球为固载介质的亲和吸附柱。实施例3中复性好的蛋白溶液按0.5ml/min缓慢流过亲和吸附柱，用PBS溶液以1ml/min平衡亲和吸附柱，采用pH＝2的Gly-HCl溶液对吸附柱进行洗脱，将洗脱的重组人白介素-6蛋白采用超滤换液的方式置换到pH＝8.5的10mM Tris-HCl溶液中，纯化前后纯度对比如图2，图中，泳道1：Marker；泳道2：亲和层析纯化前；泳道3：亲和层析纯化后。计算总共的复性率为21％。
复性率＝复性后收获蛋白总量/复性前投入的包涵体总量。
实施例5
本实验方案为重组人白介素-6活性检测过程，具体操作如下：
采用非变性非还原电泳验证复性后重组人白介素-6活性。将Anti-IL-6纳米抗体与复性后的重组人白介素-6按1:1，1:2，1:3，1:4，1:5(质量比)混合，按顺序加样，并设置空白对照验证结果，电泳结果如图3，图中，泳道1：Anti-IL-6纳米抗体；泳道2，泳道4，泳道6，泳道8，泳道10：Anti-IL-6纳米抗体与复性后的重组人白介素-6按1:1，1:2，1:3，1:4，1:5(质量比)混合；泳道3，泳道5，泳道7，泳道9，泳道11：对应的抗原。
根据结果显示随着重组人白介素-6占比增加，抗体条带逐渐变浅，证明Anti-IL-6抗体可以和重组人白介素-6结合，证明重组人白介素-6具有活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种重组人白介素-6的制备方法
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atgaacagct ttagtaccag cgcatttggt ccggttgcgt ttagcttagg tctgctgctg 60
gttttaccgg ctgcatttcc ggctccggtt ccgccgggtg aagatagtaa agacgttgca 120
gcaccgcatc gtcaaccgtt aaccagtagc gaacgcatcg acaaacagat ccgctacatc 180
ctggatggta ttagcgcact gcgcaaagaa acctgcaaca aatccaacat gtgcgagagc 240
agcaaagaag cgctggcgga aaacaacctg aacctgccga aaatggcgga aaaagacggt 300
tgcttccagt ccggctttaa cgaagaaacc tgcctggtca aaatcatcac cggtctgctg 360
gaattcgaag tctacctgga gtacctgcag aaccgttttg aaagctctga agaacaggca 420
cgcgccgttc agatgagcac caaagttctg atccagttcc tgcagaaaaa agccaaaaac 480
ctggatgcaa ttaccacccc ggacccgacc accaatgcaa gtctgctgac caaactgcag 540
gcacaaaatc agtggctgca ggatatgacc acccatctga ttctgcgcag cttcaaagag 600
ttcctgcaga gtagtttacg cgcattacgt cagatg 636
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