具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

下述实施例中所涉及的药品来源如下：

本发明所用原料均采用市售化学纯试剂，其中浓H₂SO₄和H₂O₂购自天津市元立化工有限公司，浓盐酸和异丙醇购自天津市江天化工技术有限公司，无水乙醇购自天津希恩思奥普德科技有限公司，甲胎蛋白(AFP)抗原抗体，癌胚抗原(CEA)抗原抗体，人血清白蛋白(HAS)和乙醇胺(EA)购自上海翊圣生物科技有限公司，甲胎蛋白荧光标记抗体(敏感探针)和癌胚抗原荧光标记抗体(敏感探针)购自济南昆腾商贸有限公司，1，2-(E)-双-(5'-三甲基锡烷基-2'-C-噻吩基)乙烷和3，6-双-(5-溴噻吩-2-基)-2，5-双-(2-辛基-1-十二烷基)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮购自深圳睿讯光电材料科技有限公司，2，6-二溴蒽，4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼硼烷-2-基)苯甲醛和四(三苯基膦)钯购自上海大然有限公司，三(邻甲苯基)膦和三(二苄叉基丙酮)-二钯购自天津豪恩斯光电技术有限公司，用于器件制备的含300nm SiO₂层的N掺杂硅晶片(SiO₂/Si基底)购自中国电子科技集团公司，1×PBS由0.2g KCl、0.2g KH₂PO₄、8g NaCl和3g Na₂HPO₄溶解在1L超纯水中配制而成，超纯水的电阻率为18.2MΩcm，0.01×PBS由1×PBS稀释100倍得到。食人鱼溶液为H₂SO₄和H₂O₂的混合物，按体积份数计，H₂SO₄：H₂O₂＝7：3。

下述实施例中所涉及的仪器如下：

在本发明的实施例中，核磁共振光谱(NMR)由Bruker ADVANCE 400NMR光谱仪记录，元素分析在Flash EA 1112Elemental Analyser上进行，分子量由AEI-MS50-MS光谱仪测定，聚合物的数均摩尔质量(M_n)和分散度()通过PL-GPC220凝胶渗透色谱(GPC)以三氯苯为溶剂在150℃下进行测量，原子力显微镜(AFM)采用Tapping模式测定，X射线光电子能谱(XPS)使用单色Al的Kα辐射(1486.6eV)在Axis Ultra DLD超高真空光电子能谱上进行，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)通过Zeiss LSM 800获得，探针台所用仪器的型号为Keithley 4200SCS。

室温温度：20～25℃。

实施例1～3

一种2，6-二(对甲酰基苯基)蒽(BFPA)的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将M₁(mg)2，6-二溴蒽、M₂(mg)4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯甲醛和86mg的Pd(PPh₃)₄加入到100mL两口圆底烧瓶中，在氩气环境下，将溶于8mL去离子水的950mg Na₂CO₃和25mL甲苯依次注入两口圆底烧瓶中，90℃下搅拌反应36小时，冷却至室温，其中，M₁和M₂的值见表1。

步骤2，向步骤1所得体系加入20mL温度为0℃的冷却水，以使体系中获得沉淀；

步骤3，取出步骤2所得沉淀并通过物理气相传输法进行纯化，得到浅黄色的固体为BFPA，其中，取出步骤2所得沉淀的方法为：对步骤2所得体系进行过滤，得到固体沉淀，将固体沉淀浸入二氯甲烷中进行萃取，再过滤并用饱和氯化钠溶液(水为溶剂)洗涤该固体沉淀，最后通过减压抽滤的方法除去饱和氯化钠溶液即为沉淀。

表1

图1为通过Suzuki偶联反应合成2，6-二(对甲酰基苯基)蒽的过程示意图。通过核磁共振光谱对实施例2制备所得2，6-二(对甲酰基苯基)蒽进行表征。[1H NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：10.11(s，2H)，8.56(s，2H)，8.31(s，2H)，8.15-8.17(d，2H)，7.95-8.03(dd，8H)，7.80-7.83(dd，2H)]。通过质谱对实施例2制备所得2，6-二(对甲酰基苯基)蒽进行表征。[HR-MS(EI)m/z calculated for C₂₈H₁₈O₂：386.1307，found：386.1310]。图2为实施例2制备所得2，6-二(对甲酰基苯基)蒽的核磁(NMR)和质谱(MS)。

实施例4

本发明实施例中所使用的PDVT-8聚合物的制备方法见参考文献：Chen H,etal.Highlyπ-extended copolymers with diketopyrrolopyrrole moieties for high-performance field-effect transistors[J].Adv.Mater.,2012,24,4618-4622.，具体PDVT-8聚合物的制备方法包括以下步骤：

步骤1：在氮气气氛下将200mg的3，6-双-(5-溴噻吩-2-基)-2，5-双-(2-辛基-1-十二烷基)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮，100mg的1，2-(E)-双-(5'-三甲基锡烷基-2'-C-噻吩基)乙烷，5mg的三甲苯基膦，5mg的三(二亚苄基丙酮)-二钯和20mL干氯苯添加到100mL史莱克烧瓶中，并在130℃下搅拌72小时；

步骤2：当反应结束系统冷却至室温后，将反应混合物倒入搅拌着100mL甲醇和8mL浓盐酸(36.0％-38.0％)的锥形瓶中以沉淀PDVT-8聚合物产物；

步骤3：为了除去杂质和低分子量的低聚物，将反应产物通过索氏提取法先后分别以甲醇、乙酸乙酯和氯仿作为提取溶剂进行纯化，每种溶剂纯化的时间为12小时；

步骤4：用有机微孔膜(0.45μm)通过真空过滤收集、氯仿提取，然后在真空烘箱中于60℃干燥12小时，得到PDVT-8聚合物；

通过PL-GPC220凝胶渗透色谱(GPC)以三氯苯为溶剂在150℃下测量PDVT-8聚合物的数均摩尔质量(M_n＝17.1kDa)和分散度()，说明通过上述方法已制备出纯化良好，满足实验所需的PDVT-8聚合物，如图4所示。

通过Stille偶联反应合成实施例4制备所得PDVT-8聚合物的制备过程如图3所示。

实施例5～11

一种超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器，如图5所示，包括：基底、源电极、漏电极、PDVT-8聚合物层、BFPA层以及用于检测待测癌症标志物分子的敏感探针，待测癌症标志物分子为甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子，敏感探针为待测癌症标志物分子所对应的抗体，PDVT-8聚合物层位于基底的上方且在PDVT-8聚合物层和基底之间夹有源电极和漏电极，源电极和漏电极平行设置，源电极和漏电极的底面均与基底相贴，顶面均与PDVT-8聚合物层相贴，BFPA层覆盖于PDVT-8聚合物层的顶面上，敏感探针接枝在BFPA层上。

制备上述超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的方法，包括以下步骤：

1)准备SiO₂/Si基底(硅晶片)作为基底，SiO₂作绝缘层，Si作栅极，对基底进行清洗：首先用超纯水超声10min，用于去除基底表面易于清洗的灰尘，然后放入食人鱼溶液中并在沸水的水浴中保持10min，用于去除基底表面难以清洗的灰尘，用超纯水冲洗基底表面多余的食人鱼溶液，最后用异丙醇超声10min。

在氧气环境下用等离子体对基底处理10min，功率为100W，然后在烘箱中于90℃真空干燥2小时，去除基底表面残留的多余水分和有机溶剂，再用十八烷基三氯硅烷(OTS)对基底进行修饰：将1uL十八烷基三氯硅烷滴在基底上，在烘箱的真空环境下于120℃保持2小时，用于填补基底表面存在的陷阱，有利于制备高性能的OFETs器件；

2)在步骤1)所得基底上粘贴掩膜版，蒸镀金层，使金层形成源电极和漏电极，取下掩膜版，其中，金层的沉积速率为s^-1，掩模版为透射电镜铜网，掩模版的W/L(宽长比)为8.2(沉积沟道长度L为25μm，沟道宽度W为205μm)，源电极和漏电极的厚度分别为30nm；

3)在步骤2)所得的基底上旋涂PDVT-8聚合物层，旋涂方法为：将PDVT-8聚合物与氯苯混合，在热台上于90℃搅拌12小时，使PDVT-8聚合物充分溶解，得到聚合物溶液，聚合物溶液中PDVT-8聚合物的浓度为5mg/mL，旋涂时将聚合物溶液以V rpm旋涂40s，旋涂后将基底在热台上于170℃退火10min以改善PDVT-8聚合物层的形态和致密程度；

4)将实施例2制备所得2，6-二(对甲酰基苯基)蒽蒸镀在步骤3)所得PDVT-8聚合物层上并形成BFPA层(修饰层)，蒸镀速率为s^-1，BFPA层的厚度为X nm；通过Zeiss LSM800共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)来证明BFPA层的稳定修饰。

5)将敏感探针接枝至BFPA层上，接枝的方法为：将20μL敏感探针溶液滴加在BFPA层上，并于20～25℃孵化1小时，敏感探针溶液为1×PBS和敏感探针的混合物，敏感探针溶液中敏感探针的浓度为50μg/mL。

表2

图5为制备超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的方法的流程示意图，其中，图5(a-b)为在十八基三氯硅烷(OTS)修饰的SiO₂/Si基底上沉积源电极和漏电极；图5(c)为将PDVT-8聚合物旋涂于上述基底表面构筑有机半导体层；图5(d)为将制备的2，6-二(对甲酰基苯基)蒽沉积于PDVT-8聚合物层表面作为修饰层；图5(e)为将甲胎蛋白抗体作为敏感探针接枝于器件表面并用乙醇胺进行封闭以减少非特异性吸附；图5(f)为对待测癌症标志物甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子进行检测的示意图；

图6为制备实施例5～8所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器过程中PDVT-8聚合物层的光学显微镜照片，由图可知不同转速条件对PDVT-8聚合物层形貌的影响，通过优化可知，形成致密稳定PDVT-8聚合物层的最优转速为1500rpm；

图7为制备实施例5，9，10，11所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器过程中修饰不同厚度BFPA层对器件迁移率(a)和阈值电压(b)电学性能的影响，通过优化可知最优厚度为20nm，即最优方案为实施例10；

图8为制备实施例10所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器中修饰BFPA层前、后的OFET器件的转移(a)曲线和修饰BFPA层后的输出(b)曲线，转移曲线表明，载流子的数量可以通过外部施加的栅压V_g控制，即具有栅极可调的空穴电荷传输特性，里面的圆点代表的是漏电流I_gs，值得注意的是修饰BFPA层前(正方形)和BFPA(三角形)后转移曲线的变化很小，证实了修饰BFPA层不会对器件的性能产生很大的影响；输出曲线表现出从线性状态到饱和状态的清晰过渡，饱和电流几乎平坦；

图9为制备实施例10所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器过程中修饰BFPA层后的Zeiss LSM 800共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图，从图中可以看到在修饰BFPA层后器件表面展现出明显的蓝色荧光，证明了BFPA的稳定修饰；

图10为制备实施例10所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的原子力显微镜(AFM)，通过原子力显微镜表征实施例10所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器中甲胎蛋白抗体的成功接枝，从图(a-b)中可以看到接枝甲胎蛋白抗体后厚度由44.21nm增加到了49.74nm，增加的厚度与甲胎蛋白抗体分子自身的大小相一致；并且图(c-d)中的粗糙度从3.99nm增加到了4.30nm，进一步证明了甲胎蛋白抗体的成功接枝；

图11为通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)表征实施例10所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器中甲胎蛋白抗体的成功接枝，从图中可以看到在接枝甲胎蛋白抗体分子后器件表面展现出明显的绿色荧光，进一步证明了甲胎蛋白抗体的成功接枝；

图12为通过X射线光电子能谱(XPS)来表征实施例10所得超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器中甲胎蛋白抗体的成功接枝，从图中可以看到在接枝甲胎蛋白抗体分子后(虚线)器件表面的N元素有了明显的增强，进一步证明了甲胎蛋白抗体的成功接枝；

实施例12

基于实施例10获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器，以具有一个源电极和一个漏电极的OFET作为一个超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器，超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的使用方法，包括以下步骤：

i、在超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器上滴加20μL乙醇胺(EA)溶液作为封闭剂，静置1小时，防止非特异性吸附的产生；乙醇胺溶液为乙醇胺和1×PBS(pH＝7)的混合物，乙醇胺溶液中乙醇胺的浓度为10nM。用磷酸缓冲溶液(0.01×PBS，pH＝7)冲洗超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器5次，室温干燥5s，测试该超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的转移曲线并得到输出信号电流I₀和电压V₀；

准备3位志愿者(P1，P2，P3)血清溶液各作为一个待测溶液，将20μL待测溶液滴加在超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器上，于室温孵化2小时，室温干燥5s，测试超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的转移曲线并得到输出信号电流I和电压V；

ii、将I₀和I代入公式(1)和将V₀和V代入公式(2)，计算得到源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th；

△I_ds＝(I-I₀)/I₀ 公式(1)

△V_th＝V-V₀ 公式(2)

将源漏电流的变化值△I_ds代入第一标准曲线和将阈值电压的变化值△V_th代入第二标准曲线，得到待测溶液中待测癌症标志物分子的浓度，其中，第一标准曲线为超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的源漏电流的变化值△I_ds和待测癌症标志物分子浓度的关系曲线，第二标准曲线为超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的阈值电压的变化值△V_th和待测癌症标志物分子浓度的关系曲线。

其中，获得第一标准曲线和第二标准曲线的方法：准备6个不同浓度的含有待测癌症标志物分子的溶液并作为标准溶液，6个标准溶液详见表3。标准溶液为与待测溶液中相同的溶剂以及待测癌症标志物分子的混合物，标准溶液中的溶剂为血清，6个标准溶液中待测癌症标志物分子的浓度为已知且为C_i，i＝1……6，对每个标准溶液进行以下操作：将20μL标准溶液滴加在超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器上，于室温孵化1小时，室温干燥5s，测试超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器与C_i相对应的转移曲线并得到输出信号电流I_i和电压V_i；然后将I_i代入公式(1)中的I(I₀也代入)和将V_i代入公式(2)中的V(V₀也代入)，计算得到源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th；

获得6个标准溶液的源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th后，建立坐标系，将6个标准溶液的源漏电流的变化值△I_ds与C_i分别作Y轴和X轴得到第一标准曲线和将6个标准溶液的阈值电压的变化值△V_th与C_i分别作Y轴和X轴得到第二标准曲线。

表3

图13(a-b)分别为6个标准溶液的源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th电信号和待测癌症标志物分子浓度的良好线性拟合曲线，检出限分别为45fM和53fM，具有超高的灵敏度；

人体血清样本中甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子浓度检测对比：将待测溶液采用本发明实施例10获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的检出结果与市售酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)和医院化学发光法的检出结果进行对比，不同方法对甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子检测的结果相同，展现出本发明超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器对早期肝癌诊断的准确性，详见表4。

表4

风险高：甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子浓度超标，患癌风险极高。

正常水平：甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子浓度处于正常水平。

作为进一步解释，图13(c-d)为表4中3位志愿者的3个待测溶液的源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th电信号值，通过将得到的源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th分别代入第一标准曲线和第二标准曲线得到其所对应的待测溶液中甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子的浓度，从图中可以看到癌症病人体内含有的甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子的浓度远远高于正常人的水平，即可以通过本发明超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器对人血清样品中的甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子进行快速检出，检出时间为40min，远远低于市售酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)和医院化学发光法检测的时间，为癌症标志物分子的诊断提供了高效，快速的便利条件；

实施例13

为了进一步探究本发明实施例10获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的特异性，将实施例12中的待测溶液替换成1×PBS缓冲溶液、甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子溶液和人血清白蛋白(HSA)标志物分子溶液，测试源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th，测试结果如图13(e-f)所示。其中，人血清白蛋白(HSA)标志物分子溶液为人血清白蛋白(HSA)分子和1×PBS的混合物，人血清白蛋白(HSA)标志物分子溶液的浓度为1ug/mL；甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子溶液为甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子和1×PBS的混合物，甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子溶液的浓度为1ug/mL。

从图中可以看到源漏电流的变化值△I_ds和阈值电压的变化值△V_th只对甲胎蛋白(AFP)癌症标志物分子有响应，而对非特异性结合的人血清白蛋白(HSA)标志物分子以及空白1×PBS缓冲溶液响应程度很弱，展现出特异性。

为了进一步探究本发明实施例10获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的稳定性，将该超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器放置于大气环境中20天，隔几天测试器件性能(迁移率)的变化，测试结果如图14所示。

从图中可以看到随着实施例10获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器暴露于大气环境中天数的增加，器件的迁移率并没有发生明显的变化，展现出稳定性。

实施例14

为了进一步探究本发明超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的普适性，将实施例10中的敏感探针替换为癌胚抗原(CEA)抗体，制备方法其他内容均与实施例10相同，得到实施例14获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器。

将实施例14获得的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器按照实施例12的使用方法对3位志愿者(P4，P5，P6)血清溶液中所含有的癌胚抗原(CEA)癌症标志物分子的浓度进行测定，并将超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器的检出结果与市售酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)和医院化学发光法的检出结果进行对比，测试结果如表5所示。

表5

风险高：癌胚抗原(CEA)癌症标志物分子浓度超标，患癌风险极高。

正常水平：癌胚抗原(CEA)癌症标志物分子浓度处于正常水平。

本发明的超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器能够在不影响有机场效应晶体管器件性能的基础上实现敏感探针的高效接枝，进而实现对待测癌症标志物分子的超高灵敏度的检出。与此同时，通过不同输出信号和不同检测方法的对比，提高了对人血清中单一癌症标志物分子检出的准确性和可信度，有利于最终发展为一类可提供高稳定性、高灵敏度和多输出信号检出的免疫传感器，进而大大提高检测结果的准确度和可靠性。

相对比于目前现有的癌症诊断技术，本发明超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器可提供价廉、无标识并且快速简便的实时检测需求，并且为溶液相检测提供了新思路。通过利用BFPA作为修饰层，能够在不影响有机场效应晶体管器件性能的基础上实现敏感探针的高效接枝。最重要的是，得益于多输出信号检测，该超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器具有出色的可靠性，可以监测复杂血清样品中的待测癌症标志物分子，并通过量化血清样品中癌症标志物的浓度来区分癌症患者与健康供体。基于上述所有优点，该超灵敏多输出信号有机场效应晶体管生物传感器可作为一种可靠的多信号生物传感器，极大地提高了传感灵敏度、稳定性和选择性。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。