具体实施方式

如上所讨论的，需要从废物流源(城市或工业诸如纸浆和纸工业活性污泥)生产PHA的改进的技术。这些废物流源可以考虑在内是因为i)它们的营养物和复杂碳源含量高，以及ii)可以解决纸浆和纸工业中的污泥处置问题，这可占多达60％的总废水处理成本。

二次污泥处置的成本预计会增加，尤其是在北美和欧洲，响应于更高的废水处理标准、减少的填埋场容量和增加的燃料成本。

研究人员不断尝试通过直接利用非无菌纸浆和纸工厂活性污泥(PPMAS)进行PHA生产来解决二次污泥处置和高PHA生产成本的问题。已经研究了基于混合微生物培养物(即活性污泥)的PHA生产方法作为可能的技术以解决与维持无菌条件、合成培养基制备和维持纯培养物的成本相关的问题(Singh et al.,2014)。在该方法中，主要问题是批次与批次间PHA浓度的变化。因此，PHA生产(积累)是不可重复的(对于在不同的时间从同一废水处理厂收集的污泥以及从不同废水处理厂收集的污泥)。PHA积累的变化可以归因于污泥中微生物群落的组成和活性污泥的化学组成的变化，这进一步取决于在纸浆和纸工厂内用于纸浆和纸生产的方法的性质。此外，污泥微生物群落对废水处理过程参数如有机进料负荷、化学品添加、操作的SRT、HRT、温度、pH的变化等的改变敏感。

本文描述的各种技术能够使用废物流源作为营养物和碳源来合成PHA。废物流源的非限制性实例是纸浆和纸活性污泥。

方法概述

参考图1，提供了用于使用废物流源11合成PHA的方法100。废物流11可以例如包括纸浆和纸活性污泥流，或源自纸浆和纸活性污泥流的流。应当理解，表达“源自纸浆和纸活性污泥流的流”是指使用选自过滤、沉降、倾析、离心、洗涤、悬浮于水性介质(例如水)和调整悬浮固体浓度的一个或多个步骤预处理或调节的污泥流。例如，废物流11可以是来源于纸浆和纸制造厂的纸浆和纸活性污泥流。

废物流11包括几种含碳化合物，其可用作用于生产PHA的碳源和其他营养物。可以向废物流11添加含钙矿物12以减轻某些材料的抑制作用，诸如可以存在于废物流11中或在废物流11的加工期间形成的水解木质纤维素材料。可以将废物流11在含钙矿物12的存在下在热处理步骤13(本文也称为灭菌步骤或脱毒步骤)中热处理，以对废物流杀菌并获得处理的废物流14。

令人惊讶地发现，在热处理步骤13之前或期间向废物流11添加含钙矿物12可以帮助溶解污泥悬浮的固体并使得营养物更容易地被生产PHA的微生物利用。而且，令人惊讶地发现，在热处理步骤13之前或期间向废物流11添加含钙矿物12可以帮助减少由于最初存在于废物流中的木质纤维素材料的水解而在热处理期间通常生成的抑制物质。

然后可以将处理的废物流14在发酵步骤15中发酵以获得发酵混合物16并在提取步骤18中提取以获得包括PHA 24的提取混合物20。任选地，可以进行干燥步骤22以干燥PHA24。

如图1的方法100中所示，废物流11可以直接进行热处理步骤13。替代地，如图2的方法200中所示，可以在热处理步骤13之前在调节方法300中调节废物流11。在这种情况下，是对调节的废物流114进行热处理步骤13。调节方法300将在本文中进一步详细讨论。

该方法的步骤和PHA生产技术的其他方面在下文进一步详细描述。

聚羟基脂肪酸酯(PHA)

应当理解，术语“聚羟基脂肪酸酯”或“PHA”是指可由以下式I的重复单元表示的聚合物，或指包括式I的至少两种不同的重复单元的单体的共聚物，其中R是H、烷基或烯基，并且m和n是整数。

一些PHA已经存在工业应用，非限制性代表是PHB(聚-3-羟基丁酸酯)、PHBV(聚(羟基丁酸酯-co-羟基戊酸酯))、P4HB(聚(4-羟基丁酸酯)、P3HB4HB(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯))、PHV(聚羟基戊酸酯)和PHHx(聚羟基己酸酯)。

任选地，n可以是100至30000之间的整数。任选地，m可以是1至4之间的整数。任选地，R可以是H、烷基、取代的烷基、烯基或取代的烯基。例如，R可以是H、甲基、乙基、丙基或丁基。

废物流源

应当理解，废物流11可以来源于各种源。在一些实施方式中，废物流11从城市废水、淀粉制造废水、奶酪制造废水、来自纸浆和纸生产的废物流或其组合获得。此外，本文所指的废物流中的任何一种都可以从初级污泥、二次污泥或其组合中获得。应当理解，“初级污泥”是在主要通过重力分离的初级处理过程中捕获悬浮固体和有机物的结果，其可以例如在初级澄清池中进行。还应理解，“二次污泥”是通过在使用微生物来消耗存在于废水中的有机物质的二次处理过程中处理废水而获得的。微生物通常以存在于废水中的可生物降解物质为食，例如在曝气池中，并且然后流入二次澄清池中，在那里生物质可以沉淀出来并作为二次污泥被去除。由于废物流所源自的过程以及微生物活性，废物流11通常包含可以用作生产PHA的微生物用于生产PHA的碳源的有机物质。

在一些实施方式中，废物流是来自纸浆和纸生产的废物流。任选地，来自纸浆和纸生产的废物流包括二次废物流。任选地，来自纸浆和纸生产的废物流基本上由二次废物流组成。可以将从废水处理厂排出的二次或活性污泥用作用于PHA生产的废材料。在一些方案中，活性污泥可以与其他碳源(诸如粗甘油——生物柴油工业的废产物、葡萄糖、乙酸、废食用油或类似的城市或工业废物等)组合。

废物流的调节

现在参考图3，示出了用于调节废物流11以用于随后PHA生产的方法300。可以在添加含钙矿物之前并且在热处理步骤13和发酵步骤15之前调节废物流11。

在一些实施方式中，废物流11在添加含钙矿物12之前经历过滤步骤103，以获得废物流滤液104。过滤步骤103可以能够去除粗材料，诸如可能最初存在于废物流11中的木材残留物和/或粗纤维。例如，可以使用100mm至1500mm过滤器、或500mm至1000mm过滤器、或700mm至900mm过滤器、或800mm过滤器进行过滤步骤103。

在一些实施方式中，在向废物流添加含钙矿物12之前，废物流滤液104可以经历沉降步骤或倾析步骤105，以获得倾析的废物流106。沉降步骤或倾析步骤105可以包括倾析废物流滤液104数小时，诸如2小时至12小时之间、或5小时至7小时之间或约6小时。废物流滤液104的倾析允许倾析未过滤的固体。在一些实施方式中，可以弃去污泥液体部分，并且倾析的废物流106可以最主要包括浓缩的沉降的污泥固体。在一些方案中，通过弃去污泥液体部分而不进一步干燥或处理剩余固体来获得浓缩的沉降的污泥固体。

在一些实施方式中，可以洗涤倾析的废物流106。洗涤倾析的废物流106可以在向废物流添加含钙矿物12之前包括离心步骤107，以获得离心的固体108。在一些实施方式中，洗涤倾析的废物流106进一步包括在悬浮步骤109中将离心的固体重悬浮于水性介质(例如，水)中，以获得重悬浮的固体110。在一些实施方式中，洗涤倾析的废物流106进一步包括在第二离心步骤111中重离心重悬浮的固体110以获得离心的固体112。

在一些实施方式中，在倾析步骤105、第一离心步骤107和/或第二离心步骤111之后获得的液体部分(或上清液)可以弃去。在倾析步骤105、第一离心步骤107和/或第二离心步骤111之后获得的固体部分可以任选地在随后的步骤之前重悬浮于水性介质(例如，水)中。

还应当理解，本文所描述的调节步骤中的每一个都是任选的并且不一定需要进行以在脱毒步骤13之后获得处理的废物流14。例如，在一些方案中，可以省略沉降或倾析步骤105，并且可以直接对废物流滤液104进行第一离心步骤107。在一些方案中，废物流11可以不需要过滤步骤103(例如，在没有或几乎没有要过滤的粗材料的情况下)。在另一实例中，悬浮步骤109可以直接对倾析的废物流106进行并且可以省略离心步骤107。还应当理解，在一些方案中，也可以省略第二离心步骤111。在一些方案中，可以只进行单一的离心步骤。在其他方案中，可以进行两个或更多个离心步骤。

在一些实施方式中，第一和/或第二离心步骤在8000xg至10000xg之间进行。在一些实施方式中，第一和/或第二离心步骤在室温(20-25℃)下进行。在一些实施方式中，第一和/或第二离心步骤进行5min至20min之间。

在一些实施方式中，调节废物流11进一步包括调整悬浮固体(SS)浓度至预定浓度。在一些实施方式中，预定浓度为5g/L至50g/L之间，或10g/L至20g/L之间，或再次为约15g/L。在一些实施方式中，悬浮固体浓度通过添加水性介质(例如，水)来调整。调整SS浓度可以直接在废物流11上进行或在调节方法中进行的最后步骤之后进行。换言之，调整SS浓度可以在废物流11、废物流滤液104、倾析的废物流106、离心的固体108、重悬浮的固体110或离心的固体112中的一个上进行，这取决于哪个流是在调节方法300中获得的最后的流。

含钙矿物和热处理步骤

当废物流11是纸浆和纸活性污泥流，或源自处理来源于各种木材来源或植物(例如木材、小麦、水稻等)的各种天然材料的流时，有机材料包括木质纤维素材料。当木质纤维素材料被水解时，会释放出几种水解产物，并且可能抑制PHA生产。令人惊讶地发现，在热处理步骤13之前或期间向废物流11或向调节的废物流114添加含钙矿物12可以帮助溶解污泥悬浮的固体并增加生产PHA的微生物对营养物的利用率。而且，令人惊讶地发现，在热处理步骤13之前或期间向废物流11或向调节的废物流114添加含钙矿物12可以帮助减少由于水解最初存在于废物流11中的木质纤维素材料的水解而在热处理期间通常生成的抑制物质。

含钙矿物12的非限制性实例包括碳酸钙、氢氧化钙、氧化钙、石灰或其混合物。优选地，含钙矿物包括氢氧化钙。

应当理解，热处理步骤13通常是灭菌步骤(即，在足够高的温度下加热足够长的时间以杀灭或灭活存在于废物流11或调节的废物流114中的微生物(例如，细菌))。在一些实施方式中，废物流11或调节的废物流114的热处理在至少120℃的温度下进行。

在一些实施方式中，基于SS浓度添加含Ca矿物的量。例如，对于存在于废物流11或调节的废物流114中的每g的SS固体，可以添加0.05g至0.5g之间、或0.05g至0.2g之间、或0.1g至0.2g之间、或约0.1g的含钙矿物，取决于何时添加含Ca矿物。更特别地，可以向废物流11或调节的废物流114添加约0.05g至0.5g之间、或0.05g至0.2g之间、或0.1g至0.2g之间、或约0.1g的氢氧化钙、碳酸钙、氧化钙或石灰。应当理解，SS固体浓度可以使用标准化方案诸如ASTM-D 5907、EPA 180.1和/或ISO7027来测量。

发酵步骤

在含钙矿物的存在下对废物流11或调节的废物流114灭菌之后，处理的废物流14在发酵步骤15中发酵。

在一些实施方式中，发酵步骤15可以包括分批发酵、补料分批发酵、开放发酵和/或连续发酵。优选地，发酵步骤15包括补料分批发酵。在一些方案中，发酵步骤15由补料分批发酵组成。应当理解，如本文所用，术语“补料分批发酵”是指分批发酵的变体，其中在发酵期间添加一些成分。这通常允许更好地控制发酵过程的阶段。尤其是，可以通过在非指数生长期期间添加有限量的某些营养物来增加次级代谢物的生产。在一些实施方式中，发酵步骤15包括夹在分批操作之间的补料分批操作。

在一些实施方式中，发酵步骤15在20℃至40℃之间的温度下实施。还应当理解，可以基于用作生产PHA的微生物的细菌菌株或菌株来选择温度。在一些实施方式中，废物流11或调节的废物流114的热处理可以在含Ca矿物的存在下在发酵罐中进行。在这种情况下，可以将发酵罐加热至用于热处理的期望温度，并且然后冷却至发酵温度。

在一些实施方式中，发酵步骤包括维持废物流的pH在6.5至7.5之间和/或维持温度在25℃至35℃之间。

在一些实施方式中，可以在发酵步骤15之前和/或期间向培养基添加第二碳源。类似地，可以在发酵步骤15之前和/或期间向培养基添加矿物源。通常还在发酵步骤15之前和/或期间向培养基添加生产PHA的微生物。

生产PHA的微生物

生产PHA的微生物可以是已知生产PHA的任何细菌菌株。生产PHA的微生物的非限制性实例列于下表1中。

表1：生产PHA的微生物的列表

在一些实施方式中，细菌菌株的预接种物中生长24h的细胞计数可以在10⁸至10⁹之间。然而，应当理解，预接种物中更低或更高的细胞计数是可能的，并且通常不会在更大程度上影响PHA生产的过程。

在一些实施方式中，在被引入培养基之前培养生产PHA的微生物。例如，在被引入培养基之前，可以培养生产PHA的微生物12小时至48小时、或12小时至24小时之间、或约24小时。然后可以在发酵步骤15之前和/或期间向培养基添加由此获得的预接种物。

在一些实施方式中，生产PHA的微生物是生产PHA的微生物的单一菌株。在其他实施方式中，生产PHA的微生物可以包括生产PHA的微生物的多于一种菌株。

矿物源

在一些实施方式中，可以在发酵过程期间向培养基添加矿物源以帮助PHA生产。可以添加的矿物的非限制性实例是NH₄Cl(例如0.2-1.0g/L)、Na₂HPO₄(例如0.5-6.0g/L)、KH₂PO₄(例如0.2-2.4g/L)、MgSO₄ 7H₂O(例如0.04-0.5g/L)及其组合。可以向培养基添加以下成分以促进发酵过程期间的PHA生产。应当理解，可以使用其他矿物，并且上述浓度是作为实例给出的且不应被解释为限制性的。

额外的碳源

在一些实施方式中，方法进一步包括在发酵步骤15之前和/或期间向培养基添加第二碳源。例如，第二碳源可以包括羧酸、糖、油、醇或其组合。羧酸可以包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、其盐或其组合。糖可以包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖或其组合。油可以包括植物油诸如橄榄油、玉米油、棕榈油或其组合。醇可以包括甘油，诸如纯或粗甘油。

提取步骤

在发酵步骤15之后获得的发酵混合物16包含微生物细胞，该微生物细胞包括必须在提取步骤18中提取的PHA 24。因此停止发酵步骤16并进一步处理发酵混合物16以回收PHA 24。在一些实施方式中，提取步骤18可以包括热处理步骤、超声处理步骤和氧化处理步骤中的至少一种。

提取步骤18可以包括热处理发酵混合物16以裂解包括PHA的微生物细胞的至少一部分。在一些方案中，发酵混合物16中包含的PHA由微生物细胞降解。在这种情况下，应用的热处理可以有助于最小化降解。

在一些实施方式中，当PHA浓度达到最大值时(这在例如当碳源诸如乙酸/乙酸盐的消耗速率变得恒定并且已达到最小值时确定)，可以加热发酵混合物16(例如在80℃至125℃之间，并且例如在约10分钟至45分钟之间，或在约15分钟至30分钟之间)。任选地，在加热步骤期间，可以在发酵罐中保持正浓度的乙酸。该加热步骤通常裂解至少一部分的微生物细胞，从而释放其中包含的PHA。应当理解，在这些温度下PHA通常不会降解。应当理解，表达“从细胞中释放PHA”意指最初是细胞内PHA的PHA由于热处理引起的细胞裂解/细胞破裂而被驱逐出细胞(即，获得细胞外PHA)。而且，由于细胞内容物的溶解，诸如细胞壁成分的溶解，可以增加PHA浓度。

在一些实施方式中，发酵混合物16的热处理包括热处理增强化合物。应当理解，热处理增强化合物可以允许在较低温度下进行热处理。在一些实施方式中，热处理增强化合物包括清洁剂。在一些实施方式中，清洁剂包括表面活性剂、螯合剂或其组合。在一些实施方式中，清洁剂包括吐温^TM20、吐温^TM40、吐温^TM60、2-十二烷基硫酸钠、Triton X-100、四乙酸乙二胺(EDTA)或其组合。当在发酵混合物16的热处理期间添加清洁剂时，热处理可以在80℃至95℃之间的温度下进行。

从生物质中分离PHA的提取步骤18可以使用氯化溶剂诸如氯仿、二氯甲烷和/或1，2-二氯乙烷进行。这些氯化溶剂与其他溶剂的组合也可以用于提取。然后可以通过蒸发溶剂或通过经由添加极性溶剂诸如丙酮或醇(例如甲醇或乙醇)沉淀聚合物来从溶剂中分离提取的PHA。替代地，可以使用不同的化学物质诸如碱性化合物和上面引用的清洁剂消化非PHA细胞材料。用于回收PHA的基于清洁剂的方法与基于溶剂的提取不同，在于清洁剂可以破坏细胞组分，同时保持PHA基本完整。

引发细胞破裂的另一种方法是使用超声处理，例如通过使用在20至40kHz频率之间操作的装置，该装置是可商购的。在一些实施方式中，可以在热处理之前、热处理期间或热处理之后超声处理发酵混合物16。在一些实施方式中，对热处理的发酵混合物进行超声处理，以进一步破裂细胞并将PHA释放至介质中。超声处理可以进行几分钟，例如在1分钟至30分钟之间。在一些实施方式中，超声处理进行2至5分钟，或3分钟。

在一些实施方式中，提取步骤18可以包括向发酵混合物添加氧化剂。例如，氧化剂可以包括过氧化物、次氯酸盐或其组合。在一些实施方式中，次氯酸盐包括次氯酸钠，其可以以1至5％w/v之间的浓度使用。在一些实施方式中，过氧化物包括过氧化氢，其可以以1至5％w/v之间的浓度使用。在一些实施方式中，在过氧化氢之前使用次氯酸钠。应当理解，使用氧化剂可以促进发酵混合物的脱色，这转而可以产生脱色的PHA。在一些实施方式中，在热处理步骤之后进行氧化处理。在一些实施方式中，在超声处理步骤之后进行氧化步骤。

在一些实施方式中，提取步骤18可以包括离心。例如，可以在热处理之后、在超声处理步骤之后和/或在氧化处理中的一个之后进行离心。在一些实施方式中，提取过程包括几个离心步骤。例如，可以在热处理步骤和超声处理步骤之间、在超声处理步骤和次氯酸钠处理步骤之间和/或在次氯酸钠处理步骤和/或过氧化氢处理步骤之间进行离心步骤。

干燥步骤

可以干燥包括PHA的提取混合物，例如通过喷雾干燥。

实施例

实施例1

进行实验以比较使用一方面合成培养基(葡萄糖)和另一方面用葡萄糖强化的灭菌纸浆和纸工厂活性污泥(PPMAS)的生产PHA的微生物的生长。

实验开始于制备第一和第二预接种物。通过将来自矿物介质琼脂平板的生产PHA的微生物接种至矿物培养基(MM)或包含(每升蒸馏水)20g葡萄糖、6.0g十二水合磷酸氢钠(Na₂HPO₄.12H₂O)、2.4g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、1.0g氯化铵(NH₄Cl)、0.50g七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)的合成培养基(SM)肉汤中来制备第一预接种物。磷酸盐(Na₂HPO₄.12H₂O、KH₂P0₄)和氯化铵与葡萄糖一起灭菌，而MgSO₄·7H₂O单独在121℃下高压灭菌15min，并且将这些溶液在冷却后无菌混合。将培养基pH保持在6.8，并且将预接种物维持在30℃下150rpm的搅拌下24h。在所有给定的实施例中，对于预接种物1遵循相同的组成和培养条件。

此后，将2-10％(v/v)的预接种物转移至a)合成培养基(葡萄糖，10g/L)和b)污泥(用10g/L葡萄糖强化的10g/L SS(悬浮的固体)培养基)中的每个中(第二预接种物)。其他矿物组成与第一预接种物培养基相同。也将第二预接种物维持在30℃、150rpm下24h，并且然后将2-10％(v/v)的第二预接种物转移至1L Erlenmeyer摇瓶中的200mL生产培养基中。生产培养基的组成与第二预接种物培养基相同，除了在污泥生产培养基中使用15g/L的SS，以及在污泥和合成生产培养基两者的情况下使用的葡萄糖浓度均为20g/L。用于PHA生产的生产培养基的孵育在30℃和150rpm下进行96h。每24h后从细菌发酵中取出样品以测量CFU(菌落形成单位)。

与不添加污泥的合成培养基相比，使用灭菌PPMAS(纸浆和纸工厂活性污泥)作为底物的微生物生长高出一个对数周期(结果总结在图5中)。

实施例2

对于不同参数的变化在摇瓶中进行了不同的实验，并且进行了洗涤和未洗涤污泥的微生物生长和PHA生产的比较。进行氢氧化钠(NaOH)剂量的进一步变化以最大限度地溶解污泥固体。进一步应用选择的NaOH剂量来研究SS浓度对生长和PHA生产的影响。

使用洗涤的(调节的)和未洗涤的污泥(没有强化额外的碳源和矿物)的PHA生产：污泥基质的未鉴定的组分可能对生物质生长和PHA的积累构成合理的抑制。假设在PHA积累期间，需要非常有限量的营养物并且营养物被嵌入活性污泥固体中，则将污泥离心并弃去由此获得的上清液，并将污泥生物质(或离心的沉淀)重悬浮于自来水中，以用作PHA积累(调节的污泥)的底物(部分碳和营养物源)。因此，使用不同悬浮固体浓度的未洗涤(10、15、20、25、30g/L)和洗涤的污泥(15、20、25、30和35g/L)制备污泥生产培养基，以研究它们对微生物生长和PHA积累的影响。将污泥悬浮的固体在121℃下灭菌30min。灭菌后，使悬浮的固体冷却至室温，然后在无菌条件下，使用4N NaOH(氢氧化钠)或H₂SO₄(硫酸)将pH调整至6.8。所有摇瓶都接种有2-10％(v/v)的预培养物-2的接种物，其是以与生产培养基相同的方式制备的(各种SS浓度的洗涤和未洗涤的污泥，没有强化额外的碳源和矿物)并保持在30℃、150rpm下孵育96h。

使用具有15g/L SS的洗涤的污泥获得最大细胞生长和PHA含量(表2)。其他SS值也允许获得可比较的PHA含量。

表2：用于生长和PHA生产的洗涤和未洗涤的污泥之间的比较(在发酵48h时提供结果，没有强化额外的碳源和矿物)

用于污泥预处理的碱(氢氧化钠)剂量：预处理过程的目标是分离木质纤维素材料的主要组分，以溶解最大程度的污泥固体和细胞裂解，这导致释放出可被生长的微生物利用的营养物。因此，在该实验中，使用10和30g/L的悬浮固体浓度并用不同剂量的氢氧化钠(0.05、0.07、0.09、0.11、0.13g的NaOH/g悬浮固体)处理。此后，污泥在121℃下灭菌30min。通过取10mL的样品测量每个烧瓶的悬浮固体浓度。选择溶解最大污泥固体的氢氧化钠剂量用于进一步实验。

在0.13g NaOH/g SS下获得了10g/L(处理后最终SS浓度—4.1g/L)和30g/L(处理后最终SS浓度—11.3g/L)的SS的最大污泥水解。

用于PHA生产的悬浮固体浓度：在氢氧化钠处理期间可能会释放各种抑制剂诸如脂肪酸、酚和呋喃衍生物，其可以抑制微生物的生长和PHA的积累。抑制剂可以随悬浮固体浓度的增加而增加，因为在更高的SS下，在用氢氧化钠预处理期间将释放出更大量的抑制剂，这可直接影响生长以及PHA的积累。因此，用0.133g NaOH/g SS的NaOH浓度进行不同SS(10、15、20、25、30g/L)浓度的预处理。在121℃下对污泥灭菌30min后，使预处理的悬浮固体来到室温和无菌条件下，使用4N H₂SO₄调整pH至6.8。所有摇瓶均接种有2-10％(v/v)的预培养物-2，其是以与生产培养基相同的方式制备的(各种SS浓度，不补充额外的碳和矿物)。保持烧瓶在30℃、150rpm下孵育96h，并且分析样品的悬浮固体浓度、CFU(菌落形成单位)和PHA浓度。

在对具有不同SS浓度的洗涤的污泥进行碱处理(0.133g NaOH/g SS)后，悬浮固体浓度分别从15、20、25和30g/L降低至4.7、5.0、8.0和13g/L。在24h使用15g/L的SS浓度的生物质的PHA含量(9.67％w/w)最大。然而，在相同SS浓度下，与通过使用仅热处理的洗涤的污泥获得的PHA含量(11.46％w/w)相比，获得的PHA含量(9.67％w/w)更低。使用碱处理的较低的PHA积累可能是由于水解期间形成了有毒组分。

实施例3

发现在使用氢氧化钠进行污泥水解期间释放的有毒物质会抑制PHA积累。使用石灰或氢氧化钙处理是为了减少污泥水解期间生成的抑制性组分。

向不同烧瓶中的15g/L SS浓度的洗涤的污泥中添加不同剂量的氢氧化钙(0.05、0.07、0.09、0.11、0.13g的Ca(OH)₂/g悬浮固体)。在对污泥灭菌后，在每个烧瓶中补充葡萄糖(20g/L)、氯化铵(1g/L)和矿物(组成与实施例1相同)。使用4N硫酸调整pH至6.8，并且通过使用2-10％(v/v)的预培养物-2(组成与生产培养基相同，并且预培养物将生长24h)进行接种，其后在30℃、150rpm下进行孵育96h。每24h后取出样品用于生物质浓度(g/L)、还原糖消耗量(g/L)、CFU和PHA浓度(g/L)。

发现0.11g氢氧化钙/g SS允许最大的细胞生长和PHA积累。在摇瓶中使用氢氧化钙脱毒将PHA浓度从1.10g/L(使用NaOH处理的污泥)增加至4.45g/L。与NaOH对照相比，其他氢氧化钙浓度也产生高细胞生长和PHA积累，如可从下表3中看出。

表3.用不同剂量的氢氧化钙(用于解毒)预处理洗涤(调节)的污泥，并在预处理的污泥(强化额外的碳源和矿物)中生产PHA

实施例4

进行实验以使用用葡萄糖作为额外的碳源强化的并在灭菌前用氢氧化钙处理的污泥(补料分批发酵)来生产PHA。

在5L或7L发酵罐中进行补料分批发酵，以验证使用具有纯细菌培养物的纸浆和纸活性污泥(PPAS)的PHA积累的稳定性和一致性。将葡萄糖(纯碳底物)用作额外的碳底物以增加PHA积累。

在该研究中使用来自摇瓶实验的15g/L悬浮固体浓度，并且在灭菌前向洗涤的污泥中添加0.11g Ca(OH)₂/g SS浓度的氢氧化钙。在对污泥灭菌后，在无菌条件下用灭菌的葡萄糖和矿物补充培养基。通过经由夹套循环水将温度维持在30℃。通过使用4N硫酸和4NNaOH经由计算机控制的蠕动泵自动控制发酵pH在6.8±0.1。借助极谱式溶解氧探头和pH传感器(Mettler-Toledo，美国)分别连续监测DO和pH两者。

将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和葡萄糖(10g/L)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至污泥生产培养基中。在0、12和24h补充相同浓度的氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表4中给出。基于整个发酵的消耗进行葡萄糖的进料。

表4：发酵罐的生产培养基和进料溶液的组成

调节的且Ca(OH)₂处理的灭菌污泥(SS浓度—15g/L)得到86.5％(w/w)的最大PHA含量、51.97g/L的生物质浓度和44.97g/L的PHA浓度(如图6所示)。通过使用在不同时间段收集的PPMAS重复相同的实验并且结果是可再现的，这解决了现有技术中PHA积累的不一致或可变性的典型问题。

此外，使用用葡萄糖强化的污泥获得了0.60g PHA/g消耗的葡萄糖(1.5g PHA/g消耗的碳)的高PHA产率。然而，使用仅葡萄糖作为底物而不添加污泥获得了0.36g/g消耗的葡萄糖(0.9g PHA/g消耗的碳)的低PHA产率(表5)。

表5.用葡萄糖强化的污泥和仅葡萄糖作为底物的PHA产率的比较

实施例5

进行实验以使用用包含高皂的粗甘油(表6中的组成)作为额外的碳源强化的并在灭菌前用氢氧化钙处理的污泥来生产PHA。

表6.粗甘油溶液表征

将SS浓度为15g/L的未调节(未洗涤)和调节(洗涤)的污泥用于两个不同的发酵罐。在灭菌前向污泥(收集自加拿大魁北克市白桦纸浆和纸工业)中添加0.11g Ca(OH)₂/gSS的浓度。在对污泥灭菌后，在无菌条件下用灭菌的粗甘油溶液(8g碳/L)和矿物补充培养基。

将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至污泥生产培养基中。在0、12和24h补充相同浓度的氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表4中给出。基于整个发酵消耗的甘油和皂进行粗甘油溶液的进料。

使用具有15g/L的初始SS的调节的污泥获得了41.2g/L的最大生物质浓度与72.1％(w/w)的PHA含量和29.7g/L的PHA浓度(如图7所示)。然而，使用具有15g/L的初始SS的未调节的污泥获得了38.9g/L的生物质浓度与55.7％(w/w)的PHA含量和21.9g/L的PHA浓度(如图8所示)。这些结果示出，污泥洗涤对PHA积累有影响，因为在污泥洗涤期间消除有毒化合物后，PHA含量和PHA浓度分别增加了17％和8g/L。

在使用用粗甘油强化的调节的污泥的实验中，获得了0.98g PHA/g消耗的碳(皂和甘油两者)的高PHA产率。然而，在使用仅粗甘油作为底物而不添加污泥的实验中，获得了0.73g PHA/g消耗的碳(皂和甘油两者)的低PHA产率(表7)。

表7.用粗甘油强化的污泥和仅粗甘油作为底物的PHA产率的比较

实施例6

进行实验以使用具有较高SS浓度并在灭菌前用氢氧化钙处理的污泥来生产PHA。

使用具有25g/L的高SS浓度的调节的污泥，并且在灭菌前向污泥中添加浓度为0.11g Ca(OH)₂/g SS的氢氧化钙。在对污泥灭菌后，在无菌条件下用灭菌的粗甘油溶液(8g碳/L，表6中的组成)和矿物补充培养基。

将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至污泥生产培养基中。在0、12和24h补充相同浓度的氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表4中给出。基于整个发酵的消耗进行粗甘油溶液的进料。

具有高浓度固体的调节的污泥得到了48.7g/L的生物质浓度、68％(w/w)的PHA含量和33.2g/L的PHA浓度，并获得了0.86g PHA/g消耗的碳(皂和甘油两者)的PHA产率(如图9所示)。

与通过使用较低SS浓度(15g/L)所获得的相比，使用25g/L的初始SS浓度的生物质和PHA浓度更高。在发酵过程中使用高固体浓度可以最终减少加工由特定工厂生成的给定量污泥所需的发酵罐体积。这反过来降低了PHA的建立成本。

实施例7

进行实验以使用用乙酸作为额外的碳源强化的并在灭菌前用氢氧化钙处理的调节的污泥来生产PHA。

还使用pH稳态(pH stat)补料分批策略研究了乙酸作为额外的碳底物连同污泥。每当发酵罐内肉汤的pH从6.8增加至6.85(pH变化0.05)时，就通过酸泵自动将乙酸进料至发酵罐中。通过使用粗甘油溶液制备了用于所有乙酸实验的预培养物2。使用具有25g/L的SS浓度的调节的纸浆和纸污泥，并且在灭菌前向污泥中添加浓度为0.11g Ca(OH)₂/g SS的氢氧化钙。在对污泥灭菌后，在无菌条件下用矿物补充培养基。将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)(表6中给出的组成)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至污泥生产培养基中。在0、12和24h补充相同浓度的氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。依据基于pH的补料分批策略，将乙酸自动添加至发酵罐中。

使用25g/L的初始SS的调节的污泥获得了44.7g/L的最大生物质浓度与68％(w/w)的PHA含量和30.5g/L的PHA浓度(如图10所示)。通过使用调节的污泥和乙酸作为额外的碳底物，获得了0.60g PHA/g消耗的乙酸(1.5g PHA/g消耗的碳)的高PHA产率。

Chakraborty et al.,2012报道了相对低的PHA产率，为0.2g PHA/g消耗的碳底物混合物(乙酸、丁酸、琥珀酸和丙酸)。在Yu et al.,(2002)的另一研究中，报道了平均PHA产率为0.39g PHA/g消耗的碳底物混合物(乙酸、丁酸和丙酸)。

实施例8

使用从不同纸浆和纸工业收集的未调节的污泥进行实验。

污泥的组成随工厂不同而变化。在这一系列实验中，从不同纸浆和纸工业诸如Alma和Dolbeau收集纸浆和纸污泥。据信污泥随着时间和工业内部使用的工艺的性质而变化。此外，在废水中，污泥微生物群落对在工艺流如有机进料负荷、化学品添加中的变化，操作的SRT、HRT、温度、pH的变化等敏感，从而改变PHA含量。还可以假设污泥组成随工业不同而变化。因此，在本节中，建立的方法用于使用从不同工业收集的纸浆和纸污泥的PHA生产，以检查过程的可持续性。

在不同实验中，在灭菌之前，将浓度为0.11g Ca(OH)₂/g SS的氢氧化钙添加至未洗涤的Alma和Dolbeau污泥中。在对污泥灭菌后，在无菌条件下用灭菌的粗甘油溶液(8g碳/L)(表6中给出的组成)和矿物补充培养基。

将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)(表6中给出的组成)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至污泥生产培养基中。在0、12和24h补充相同浓度的氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次粗甘油进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表4中给出。基于整个发酵消耗的皂和甘油进行粗甘油溶液的进料。

具有15g/L的初始SS浓度和粗甘油溶液作为额外的碳底物的Alma未洗涤的污泥得到40.12g/L的最大生物质浓度和53.45％(w/w)的生物质PHA含量和21.44g/L的PHA浓度。在Dolbeau未洗涤污泥的发酵过程的类似条件下的类似实验研究中，获得了41.32g/L的最大生物质浓度与55.2％(w/w)的PHA含量和22.8g/L的PHA浓度。这些结果与在类似的发酵条件下通过使用白桦纸浆和纸工业的未洗涤污泥获得的结果类似。从通过使用从三个不同的纸浆和纸工业废水处理厂收集的污泥获得的结果可以明显看出，污泥的组成不影响使用纯培养方法的PHA生产，这是使用混合培养进行PHA生产的主要瓶颈。

实施例9

进行实验以使用大规模150L发酵罐生产PHA。

PHA生产也在150L(总体积)发酵罐中进行，用从Dolbeau获得的未调节的污泥(无倾析)和粗甘油作为额外的碳底物，以确认发展的过程的一致性。

将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至预培养物3(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，组成与生产培养基相同，组成在表6中给出)，并且培养条件与预培养物2相同。24h后，将预培养物3转移至具有100L工作体积的150L发酵罐中。在0、12和24h补充氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表4中给出。基于整个发酵消耗的皂和甘油进行粗甘油溶液的进料。

使用具有15g/L的初始SS的未调节的污泥获得了40g/L的最大生物质浓度与54％(w/w)的PHA含量和21.5g/L的PHA浓度。这些结果与通过使用具有15g/L的未调节的污泥的5L发酵罐进行的实验类似，这表明了新的PHA生产方法在不同规模下的一致性。

结果示出，污泥是可用于纯培养的底物，单独或与其他废物底物(如粗甘油等)组合。该方法可以至少部分地解决在使用混合微生物培养物的PHA生产期间得到的PHA浓度不一致、PHA含量较低和PHA产率较低的问题。此外，由于在发酵期间产生的生物质中PHA的高浓度，故进一步提取和纯化PHA所需的化学处理较少。

实施例10

在5L发酵罐中进行实验，以通过使用用包含高皂的粗甘油(表6中的组成)作为额外的碳源强化的并在灭菌前用氢氧化钙处理的调节的污泥进一步增强生物质浓度、PHA浓度和PHA产率。将连续碳补料分批策略用于在整个发酵中维持微生物的最佳碳浓度(粗甘油溶液的8±1g碳/L培养基)。

对于5L发酵罐，将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，组成与生产培养基相同)转移至污泥生产培养基中。在0、12和24h补充相同浓度的氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表8中给出。

表8.用连续补料分批发酵策略的发酵罐的生产培养基和进料溶液的组成

在补料分批发酵期间，基于甘油和皂的消耗，间歇性地添加粗甘油溶液。然而，连续补料分批策略可以替代地用于为微生物提供最佳碳浓度(8g碳/L)，在整个发酵中在培养基中维持该最佳碳浓度。连续补料分批策略还可以有助于在整个发酵中维持C/N比率。

因此，在0h，向培养基添加粗甘油溶液(碳当量等于20g碳/L甘油或8g碳/L)。此后，自动添加粗甘油溶液(按间歇补料分批策略期间优化的，通过调整蠕动泵的流速以添加所需量的粗甘油溶液)。在间歇补料分批策略期间，基于消耗和细菌每12h需要4g C的粗甘油溶液/L培养基添加碳。因此，在连续补料分批策略中，通过在12h时间段期间调整蠕动泵的流速以将相同量的碳缓慢添加至发酵罐中。因此，观察到在整个发酵中维持相同的碳浓度。

因此，使用连续碳补料分批发酵策略，用Ca(OH)₂处理的PPMAS作为底物以及粗甘油作为额外的碳底物，得到58g/L的生物质浓度与42g/L的PHA浓度，相比之下，用间歇碳补料分批策略获得41.2g/L的生物质浓度和29.7g/L的PHA浓度。另外，使用连续碳补料分批发酵策略得到PHA产率为1.17g PHA/g消耗的碳，相比之下，用间歇碳补料分批策略获得的PHA产率为0.98g PHA/g消耗的碳(表9)。

表9.间歇碳补料分批和连续碳补料分批发酵策略的PHA产率的比较

实施例11

进行实验以使用大规模150L发酵罐生产PHA。PHA生产也在150L(总体积)发酵罐中进行，用于连续补料分批策略，用从Dolbeau获得的调节的污泥和粗甘油作为额外的碳底物(第二碳源)，以确认发展的过程的一致性。

将在30℃、150rpm下培养24h的预培养物-2(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，其组成与生产培养基相同)转移至预培养物3(除了使用低SS(10g/L)和粗甘油(4g碳/L)浓度外，其组成与生产培养基相同，组成在表6中给出)，并且培养条件与预培养物2相同。24h后，将预培养物3转移至具有100L工作体积的150L发酵罐中。在0、12和24h补充氮和矿物，而在24h后，在整个发酵中补充低浓度的矿物和氮(在36、42、60、72和84h的五次进料)。污泥生产培养基和进料溶液的组成在表8中给出。

在如实施例10中讨论的连续碳补料分批发酵策略中，将相同浓度的碳缓慢添加至发酵罐中。将粗甘油溶液在加压釜中在121℃下灭菌15min，并且冷却至室温。在无菌条件下，将粗甘油溶液在层流空气流中转移至无菌进料塑料罐中。此后，将无菌进料塑料罐(碳进料罐)连接至发酵罐。由于粗甘油溶液由皂和甘油组成，两者不互溶在一起的事实，因此将碳进料罐置于磁力搅拌器上以连续混合粗甘油溶液。通过将蠕动泵的旋转频率设置为5rpm(开启每17秒并关闭60秒)手动设置粗甘油溶液到发酵罐的进料流速。因此，基于消耗(分析样品的甘油和皂浓度，每6h)并考虑随着时间发酵罐内发酵液体积的增加，在发酵培养基(培养基)中维持最佳碳浓度(8±1g碳/L)。添加至发酵罐内的粗甘油溶液的体积由此增加(间隔时间(开启)增加至最多20秒)。

使用具有15g/L的初始SS的调节的污泥用连续补料分批发酵策略在150L发酵罐中获得了58.4g/L的最大生物质浓度与70％(w/w)的生物质PHA含量和40g/L的PHA浓度。这些结果与通过使用具有15g/L的调节的污泥的5L发酵罐进行的实验类似，这表明了PHA生产方法在不同规模下的一致性。