发明背景

杜兴肌营养不良（DMD）是一种严重致残的全身性儿童期发病疾病，其从早期运动肌无力进展到末期呼吸和心肌病，其特征在于非常昂贵的护理者和技术依赖性（Landfeldt, E.等人, The burden of Duchenne muscular dystrophy: aninternational, cross-sectional study. Neurology, 2014. 83(6): 第529-36页；和Schreiber-Katz, O.等人, Comparative cost of illness analysis and assessmentof health care burden of Duchenne and Becker muscular dystrophies in Germany.Orphanet J Rare Dis, 2014. 9: 第210页）。DMD是人类最常见的单基因致死性疾病之一，其历史上全球发病率为约1:4000男性出生。分子基础是细胞骨架蛋白肌养蛋白的427 kd同工型（Dp427）的缺乏，其在大多数情况下是由DMD基因的多外显子移码缺失引起的。较轻的疾病贝克尔肌营养不良（BMD）是等位的，且大多数病例是由改变了编码的蛋白的杆结构域的长度的肌养蛋白基因的内部缺失或重复引起的。

肌养蛋白是通过“定位克隆”发现的第一种蛋白，且所述发现提供了关于使用疾病的人遗传学图位置作为阐明其分子基础的主要基础的初始概念证明（proof of concept）。通过这种方法发现的许多蛋白在受影响的细胞中的丰度非常低，从而使得确定蛋白的生理功能变得复杂化。肌养蛋白发现于1987年，且在所述领域中的30年都面临着对蛋白在肌细胞中的精确功能的理解的较大空白。然而，已经提供了肌养蛋白在保护肌细胞膜免受肌肉收缩过程中产生的力中的作用的间接证据。肌养蛋白的机械负荷特性仍然是很差表征的。

在美国，携带者检测和出生前咨询已多少降低了DMD的发病率（Pegoraro, E.等人, SPP1 genotype is a determinant of disease severity in Duchenne musculardystrophy. Neurology, 2011. 76(3): 第219-26页）。目前结合糖皮质类固醇、ACE抑制剂和机械通气支持的疗法可能暂时减慢进展速度，但最终的临床过程是不可抗拒的（McDonald, C.M.等人, The cooperative international neuromuscular researchgroup duchenne natural history study-a longitudinal investigation in the eraof glucocorticoid therapy: Design of protocol and the methods used. MuscleNerve, 2013）。

在基因治疗的时代，各种AAV载体已作为用于全身基因递送的毒性最小且最广泛传播的平台出现。那些基因治疗对全身生物分布具有巨大希望，但局限性包括（a）克隆能力限于对于全长Dp427所需的三分之一，（b）在持久治疗潜在所需剂量的载体免疫原性和毒性尚未解决的问题，以及（c）在人疗法所需的规模上进行常规制造的特别成本。AAV载体在结构上与细小病毒亚科的野生型成员有关，其包壳了约5千碱基的单链DNA基因组。全长肌养蛋白的mRNA为14千碱基，具有约12 kb的可读框。

引起DMD的大多数突变是在>2.5兆碱基的、X-连锁基因中的散发性多外显子、移码缺失（Kunkel, L.M.等人, Analysis of deletions in DNA from patients with Beckerand Duchenne muscular dystrophy. Nature, 1986. 322(6074): 第73-7页；Monaco,A.P.等人, Isolation of candidate cDNAs for portions of the Duchenne musculardystrophy gene. Nature, 1986. 323(6089): 第646-50页；和Koenig, M.等人, Themolecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation ofseverity with type of deletion. Am J Hum Genet, 1989. 45(4): 第498-506页）。在没有对缺陷的全长蛋白的中枢性（胸腺）耐受的情况下，重组肌养蛋白具有诱导宿主对异种蛋白的免疫应答的能力（Mendell, J.R.等人, Dystrophin immunity in Duchenne'smuscular dystrophy. N Engl J Med, 2010. 363(15): p. 1429-37）。新的载体和血管递送方法已在概念证明临床前研究中实现了有希望的区域和全身基因转移，从而提出了用于DMD的基因治疗的合理方法（Greelish, J.P.等人, Stable restoration of thesarcoglycan complex in dystrophic muscle perfused with histamine and arecombinant adeno-associated viral vector. Nat Med, 1999. 5(4): 第439-43页；Su, L.T.等人, Uniform scale-independent gene transfer to striated muscleafter transvenular extravasation of vector. Circulation, 2005. 112(12): 第1780-8页；Gao, G., L.H. Vandenberghe, 和J.M. Wilson, New recombinant serotypesof AAV vectors. Curr Gene Ther, 2005. 5(3): 第285-97页；和Katz, M.G.等人,Cardiac gene therapy: optimization of gene delivery techniques in vivo. HumGene Ther, 2010. 21(4): p. 371-80）。然而，这些进展也强调了这个领域中主要的载体发现挑战和患者安全忧虑（Mendell, J.R.等人, Dystrophin immunity in Duchenne'smuscular dystrophy. N Engl J Med, 2010. 363(15): 第1429-37页；Mendell, J.R.等人, Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. NEngl J Med, 1995. 333(13): 第832-8页；Mouly, V.等人, Myoblast transfertherapy: is there any light at the end of the tunnelActaMyol,2005. 24(2): 第128-33页；和Wang, Z.等人, Immunity to adeno-associated virus-mediated genetransfer in a random-bred canine model of Duchenne muscular dystrophy. HumGene Ther, 2007. 18(1): 第18-26页）。作为治疗DMD的AAV载体的另一个例子，美国专利No. 7,771,993提供了“微-肌养蛋白相关蛋白（micro-utrophin）”（也记录为“m-肌养蛋白相关蛋白（utrophin）”、“µ-肌养蛋白相关蛋白”或“µ-U”），其具有位于N-末端肌养蛋白相关蛋白区域内的相对于人肌养蛋白相关蛋白的约270个氨基酸的“辅肌动蛋白结合结构域”的功能部分、至少富含脯氨酸的铰链区1和4（H1）和（H4）的功能部分和 C-末端肌养蛋白相关蛋白蛋白的部分。微-肌养蛋白相关蛋白含有中央杆重复序列结构域的内部缺失和下游C-末端区域中的截短。

仍然存在用于治疗杜兴肌营养不良和相关疾病的需要。