卵菌抑制剂
阅读说明：本技术 卵菌抑制剂 (Oomycete inhibitor ) 是由 杨新宇 黄启凤 姜雪 孙慧颖 梁月 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种新型卵菌抑制剂,其有效成分为洛伐他汀水解产物。本发明还提供洛伐他汀在植物卵菌病害防治方面的用途。通过向培养基中外源添加洛伐他汀,显著降低大豆疫霉菌丝的生长速率,抑制了产孢能力和致病能力,并对其它植物病原卵菌具有相似的抑制生长的作用。可将洛伐他汀作为潜在的抑制剂用于大豆疫霉及其它卵菌的防控。(The invention provides a novel oomycete inhibitor, the active ingredient of which is lovastatin hydrolysate. The invention also provides application of lovastatin in the aspect of preventing and treating plant oomycete diseases. By adding lovastatin into the culture medium, the growth rate of phytophthora sojae hyphae is obviously reduced, the sporulation ability and the pathogenic ability are inhibited, and the culture medium has similar growth inhibiting effect on other plant pathogenic oomycetes. Lovastatin can be used as a potential inhibitor for preventing and controlling phytophthora sojae and other oomycetes.)
技术领域
本发明涉及植物病害防治领域，具体地说，涉及一种卵菌抑制剂。
背景技术
卵菌(oomycetes)是一类数目庞大的真核生物，其形态与真菌类似，呈丝状生长，菌丝无隔。长期以来，卵菌被归类为真菌，属于鞭毛菌亚门。但是在细胞壁的主要成分、营养体的染色体倍数、无性孢子的种类、基因组的大小等方面与真菌有较大差异。分子水平的系统发育分析发现卵菌与硅藻等植物的亲缘关系很近，而与真菌的亲缘关系甚远，新的分类系统将卵菌归入茸鞭生物界(Stramenopila)、卵菌门(oomycota)。植物病原卵菌是重要的病原菌类群，能够侵染数百种植物，导致农业、林业的严重经济损失。致病疫霉(P.infestans)可引起马铃薯晚疫病，是马铃薯生产中的毁灭性病害。大豆疫霉(P.sojae)可引起大豆根腐病，每年在全球导致的经济损失超过20亿美元。目前将其列为我国进境植物检疫性有害生物，病害的防控难度持续加大。辣椒疫霉(P.capsici)和腐霉菌(Pythiumspecies)导致辣椒、黄瓜、南瓜等蔬菜的疫病，损失十分严重。由于卵菌的代谢途径与真菌存在诸多差异，目前对卵菌有效的杀菌剂数量较少。例如由于不能自身合成甾醇类物质，导致以甾醇合成途径中CYP51为靶标的三唑类农药对卵菌无效。特效杀菌剂甲霜灵类经过近30年的长期使用，抗药性风险持续上升，发掘防治植物卵菌病害的有效药剂和作用靶标，对制定植物病原卵菌的防控策略具有重要意义。
1976年日本生化学家Akira Endo从桔青霉(Penicillum citrinum)分离得到洛伐他汀，上世纪80年代上市后作为治疗高脂血症、防治动脉硬化、冠心病和脑血管病的首选药物。洛伐他汀经服用后作用于肝脏，经代谢成为活性形式后，作用于胆固醇合成的限速酶乙酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl CoAreductase，HMGR)。洛伐他汀与HMGR竞争性地结合后，改变其构象并阻止正常底物的结合，使胆固醇的合成减少。目前，未见将洛伐他汀应用于卵菌及其所致植物病害防治的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型卵菌抑制剂。
本发明的另一目的是提供洛伐他汀的新用途，特别是植物卵菌病害防治方面的用途。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种卵菌抑制剂，有效成分为洛伐他汀水解产物，其结构如式I)所示：
式I)化合物的化学名称为(3R,5R)-7-[(1S,2S,6R,8S,8aR)-2,6-dimethyl-8-[(2S)-2-methylbutanoyl]oxy-1,2,6,7,8,8a-h exahydronaphthalen-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic acid。参见Guo,M.R.,et al.(2016).Simultaneous determinationof lovastatin and its metabolite lovastatin acid in rat plasma using UPLC-MS/MS with positive/negative ion-switching electrospray ionization:Applicationto a pharmacokinetic study of lovastatin nanosuspension.Journal ofChromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences1023:55-61.
洛伐他汀水解产物的制备方法包括：将洛伐他汀加入碱性乙醇溶液中，加热至洛伐他汀完全溶解。
前述制备方法中，所述碱性乙醇溶液为含有10-20％v/v乙醇的NaOH水溶液，其中NaOH的浓度为0.1-0.3％w/v。优选地，所述碱性乙醇溶液为含有15％v/v乙醇的NaOH水溶液，其中NaOH的浓度为0.25％w/v。
前述的制备方法，加热至50-70℃(优选60℃)使洛伐他汀完全溶解。
第二方面，本发明提供洛伐他汀水解产物在抑制卵菌及其所致植物病害中的应用。
第三方面，本发明提供洛伐他汀水解产物在制备卵菌抑制剂和用于防治植物卵菌病害的药剂中的应用。
所述卵菌可选自大豆疫霉(Phytophthora sojae)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、终极腐霉(Pythium ultimum)等。
进一步地，所述应用包括：
1)洛伐他汀水解产物降低大豆疫霉的菌丝生长速度；
2)洛伐他汀水解产物抑制大豆疫霉孢子囊的产生；
3)洛伐他汀水解产物降低大豆疫霉卵孢子的产量；
4)洛伐他汀水解产物抑制大豆疫霉游动孢子的致病能力。
本发明中，在体外将洛伐他汀经水解转变为活性形式，向培养基中添加不同浓度的洛伐他汀水解产物后，能显著降低大豆疫霉菌丝生长速度。孢子囊和游动孢子是大豆疫霉在田间主要的传播方式，在病害的传播和侵染中发挥重要的作用，使用洛伐他汀处理抑制孢子囊的产生，提高了游动孢子的休止率。卵孢子是病害发生后期形成的休眠结构，能够越冬后引起第二年的初次侵染。使用洛伐他汀处理显著降低了卵孢子的产量。使用洛伐他汀处理，降低了游动孢子的致病能力。向培养基中添加不同浓度的洛伐他汀水解产物，同样能够显著降低致病疫霉(P.infestans)、辣椒疫霉(P.capsici)和终极腐霉(Py.ultimum)菌丝的生长。以上结果显示洛伐他汀具有抑制大豆疫霉菌丝生长和产孢、致病的能力，并对部分卵菌具有一定的广谱抑菌作用，可作为潜在的抑制剂用于大豆疫霉及其它卵菌的防控。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中不同浓度洛伐他汀处理下大豆疫霉的菌落和生长速率。
图2为本发明较佳实施例中不同浓度洛伐他汀处理下大豆疫霉孢子囊形态和产量。
图3为本发明较佳实施例中不同浓度洛伐他汀处理下大豆疫霉卵孢子形态和产量。
图4为本发明较佳实施例中不同浓度洛伐他汀处理下大豆疫霉游动孢子的休止率。
图5为本发明较佳实施例中不同浓度洛伐他汀处理下大豆疫霉游动孢子的致病能力。
图6为本发明较佳实施例中不同浓度洛伐他汀处理下致病疫霉(A)、辣椒疫霉(B)和终极腐霉(C)生长速率。
图7为本发明较佳实施例中洛伐他汀水解产物降低大豆疫霉引起的大豆根腐病的发病率。其中，*表示P<0.05。
图中，不同小写字母表示差异显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下实施例中使用的洛伐他汀购自北京索莱宝科技有限公司。
大豆疫霉为(基因组测序)标准菌株P6497，由南京农业大学提供。参见Tyler,B.,et al.(2006)."Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins andmechanisms of pathogenesis."Science 313(5791):1261.
致病疫霉为(基因组测序)标准菌株T30-4，由南京农业大学提供。参见Haas,B.J.,et al.(2009)."Genome sequence and analysis of the Irish potato faminepathogen Phytophthora infestans."Nature 461(7262):393-398.
辣椒疫霉为(基因组测序)标准菌株LT263，由南京农业大学提供。参见Cui,C.,etal.(2019)."Draft Assembly of Phytophthora capsici from Long-Read SequencingUncovers Complexity."Mol Plant Microbe Interact 32(12):1559-1563.
终极腐霉为(基因组测序)标准菌株DAOM BR144，由南京农业大学提供。参见Levesque,C.A.,et al.(2010)."Genome sequence of the necrotrophic plantpathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms andeffector repertoire."Genome Biol 11(7):R73.
实施例1洛伐他汀水解产物的制备
将洛伐他汀400mg加入20mL碱性乙醇(15％v/v乙醇，0.25％w/v NaOH)，60℃水浴加热至洛伐他汀完全溶解，成为活性形式，过滤除菌后-20℃保存。
实施例2洛伐他汀水解产物抑菌实验
1、抑制大豆疫霉菌丝生长
向V8培养基中分别添加终浓度为20、40、80μg/mL的洛伐他汀水解物，在培养基中心接种直径5mm大豆疫霉菌饼，25℃黑暗培养3d。经计算，对照平板上大豆疫霉菌丝生长速度为4.85mm/d，在20、40、80μg/mL的洛伐他汀水解物处理下，生长速度分别为4.50mm/d，4.07mm/d和3.30mm/d。培养基中添加不同浓度的洛伐他汀水解物，显著降低了大豆疫霉的菌丝生长速度(图1)。
2、抑制大豆疫霉孢子囊的产生
将洛伐他汀水解物溶于水中，分别配制成浓度为20、40、80μg/mL的溶液，刺激大豆疫霉菌丝产生孢子囊。结果显示，使用纯水诱导大豆疫霉产生孢子囊时，平均产生130个孢子囊；使用20μg/mL洛伐他汀水解物溶液诱导，平均产生孢子囊42个；使用40μg/mL洛伐他汀水解物溶液诱导，平均产生孢子囊9个；而使用80μg/mL洛伐他汀水解物溶液诱导，完全不能产生孢子囊。孢子囊的形态无明显变化(图2)。
3、降低大豆疫霉卵孢子的产量
向V8培养基中添加终浓度为20、40、80μg/mL的洛伐他汀水解物，在培养基中心接种直径5mm大豆疫霉菌饼，25℃黑暗培养30d，统计卵孢子的产量。对照组(培养基中不添加洛伐他汀水解物)大豆疫霉产生平均卵孢子的数量为800个；在含有20μg/mL洛伐他汀水解物的V8培养基中，产生平均卵孢子的数量为500个；在含有40μg/mL洛伐他汀水解物的V8培养基中，产生平均卵孢子的数量为440个；在含有80μg/mL洛伐他汀水解物的V8培养基中，产生平均卵孢子的数量为280个(图3)。
4、抑制大豆疫霉游动孢子的致病能力
制备新鲜的大豆疫霉游动孢子悬浮液，向游动孢子悬浮液中分别添加终浓度为20、40、80μg/mL的洛伐他汀水解物，静置1h后统计游动孢子的休止率。另取经过洛伐他汀水解物处理的5μL游动孢子悬浮液，接种至大豆黄化苗下胚轴，25℃黑暗培养48h，统计病斑长度。结果显示，游动孢子悬浮液中添加洛伐他汀水解物后，在0、20、40μg/mL浓度处理下，休止率分别为5.9％、6.6％和10.4％，无明显差异(图4)。在80μg/mL洛伐他汀水解物处理下，休止率上升至49％。在0、20、40μg/mL浓度处理下，游动孢子致病能力无明显变化，在80μg/mL洛伐他汀水解物处理下，致病能力降低，病斑长度降低25％(图5)。
5、抑制其它卵菌
向V8培养基中分别添加终浓度为20、40、80μg/mL的洛伐他汀水解物，在培养基中心接种直径5mm的致病疫霉、辣椒疫霉和终极腐霉菌饼，25℃黑暗培养后统计菌丝的生长速率。结果显示，0、20、40、80μg/mL的洛伐他汀水解物处理下，致病疫霉的生长速率分别为3.63mm/d、3.65mm/d、3.37mm/d和2.39mm/d；辣椒疫霉的生长速率分别为7.83mm/d、7.04mm/d、6.96mm/d和5.21mm/d；终极腐霉的生长速率分别为27mm/d、26.83mm/d、24.92mm/d和22.67mm/d。以上结果显示，三种重要的卵菌，致病疫霉、辣椒疫霉和终极腐霉的菌丝生长显著受到80μg/mL的洛伐他汀水解物的抑制(图6)。
以上实验结果表明，通过外源添加洛伐他汀显著降低大豆疫霉菌丝的生长速率，抑制了产孢能力和致病能力，并且对其它三种植物病原卵菌具有相似的抑制生长的作用，提示洛伐他汀可作为潜在的抑制剂用于大豆疫霉及其它卵菌的防控。
实施例3洛伐他汀水解产物降低大豆疫霉引起的大豆根腐病的发病率
根据室内平板抑菌实验结果，选择1～2个浓度进行病害防控实验。播种大豆感病品种合丰47，25℃，16h光照/8h黑暗条件下，生长2周至第一对真叶展开。大豆疫霉菌丝接种后，将含有洛伐他汀水解物(浓度分别为0、40、80μg/mL)的水溶液，均匀喷洒至大豆幼苗上，培养3天后统计发病。结果表明，对照处理(浓度0μg/mL)的大豆全部发病且倒伏，发病率为100％；使用终浓度40μg/mL洛伐他汀水解物处理后，发病率降至80％；特别是80μg/mL洛伐他汀水解物处理后，发病率降至70％，防效可达30％或以上(图7)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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