家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用

文档序号：758698 发布日期：2021-04-06 浏览：23次 >En<

阅读说明：本技术 家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用 (Promoter of bombyx mori pebrine induced expression gene BmPGT 3 and application thereof ) 是由李春峰于滨潘国庆周泽扬于 2020-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于家蚕转基因技术领域,具体涉及一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用,所述启动子的核苷酸基因如SEQ ID NO：16所示,该启动子可以驱动外源基因在家蚕中经家蚕微粒子虫诱导下表达,不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究,同时适用于利用基因工程进行家蚕品种改良,特别是家蚕抗微粒子病的品种培育,具有良好的应用前景。(The invention belongs to the technical field of silkworm transgenosis, and particularly relates to a promoter of a bombyx mori nosema induced expression gene BmPGT 3 and application thereof, wherein a nucleotide gene of the promoter is shown as SEQ ID NO: 16, the promoter can drive the expression of exogenous genes in silkworms under the induction of silkworm nosema bombycis, is not only suitable for molecular biology theory research such as gene function analysis, but also suitable for improving the silkworm varieties by using genetic engineering, particularly for breeding the silkworm nosema bombycis anti-disease varieties, and has good application prospect.)

技术领域

本发明属于家蚕转基因技术领域，具体涉及一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用。

背景技术

蚕丝业是我国的传统优势产业，至今仍主导国际市场，是千万农户重要的经济收入来源。家蚕微粒子病(Pébrine)是危害蚕业安全生产的头号疫病，其根本原因在于该病的病原—家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)可经卵垂直传播造成蚕种带毒。当前，我国每年因微粒子病而带来的直接经济损失即达上亿元，全国主要蚕种场用于防控该病的花费占蚕种生成总支出的一半。然而，目前生产上尚未发现对该病有抗性的家蚕材料。

随着家蚕转基因技术的突破和完善，转基因技术已成为家蚕抗性材料选育的强有力的工具。但是，目前通过转基因家蚕育种方面还是利用组成型表达的启动子。利用组成型启动子一方面外源基因的表达效率会降低，另一方面会对家蚕本身带来负担。目前鲜有关于家蚕微粒子虫诱导型启动子的报道。因此，开发家蚕微粒子虫诱导型启动子对在构建家蚕微粒子虫抗性育种素材中减少外源基因组成性表达的负荷，提高转基因家蚕的抗性以及开发新的微粒子虫抗性系统具有重大意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子，目的之二在于提供一种重组表达载体，目的之三在于提供一种重组表达载体的构建方法，目的之四在于提供一种重组细胞，目的之五在于提供一种外源蛋白，目的之六在于提供一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子在培育抗微粒子虫家蚕中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

2、一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子。

3、一种重组表达载体的构建方法，所述方法为，根据所述家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子的核苷酸序列，设计含有表达载体酶切位点的上、下游引物，以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得含所述启动子的目的片段，将所述目的片段连接在表达载体上，得到重组表达载体。

作为优选的技术方案之一，所述表达载体为pSLfa1180fa载体。

作为优选的技术方案之一，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

4、一种重组细胞，所述重组细胞是由所述重组表达载体转化至受体细胞而得。

5、一种外源蛋白，所述外源蛋白是由所述重组细胞所表达。

6、所述家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子在培育抗微粒子虫家蚕中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明的BmPUGT3启动子可以驱动外源基因在家蚕中经家蚕微粒子虫诱导下表达，不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程进行家蚕品种改良，特别是用于家蚕抗微粒子病的品种培育，比如诱导表达内外源致死基因以及诱导型的基因编辑系统，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为RT-PCR检测结果图，N3-N48分别代表家蚕微粒子虫感染后3h、6h、12h、24h及48h的RT-PCR检测结果，C3-C48为其清水对照组；

图2为未感染家蚕微粒子虫时家蚕各组织BmPUGT3的转录表达检测；

图3为BmPUGT3启动子预测，下划线加粗的碱基为预测的转录起始位点，下划线上大写加粗的ATG为翻译起始位点，灰框序列为5’UTR区域；

图4为通过RT-PCR检测BmPUGT3的转录起始位点，1～6分别是BmPUGT3-5'-F1/BmPUGT3-R、BmPUGT3-5'-F2/BmPUGT3-R、BmPUGT3-5'-F3/BmPUGT3-R、BmPUGT3-5'-F4/BmPUGT3-R、BmPUGT3-F/BmPUGT3-5'-R及BmA3-F/BmA3-R引物对的扩增结果；

图5为BmN-SWU1细胞转染pSL[PPUGT3-mCherry-SV40]表达载体后的红色荧光的发光情况结果图，A为转染表达载体后添加家蚕微粒子虫诱导的荧光观察结果图，B为转染表达载体添加家蚕微粒子虫诱导的白光观察结果图，C为转染表达载体后添加PBS作对照的荧光观察结果图，D为转染表达载体添加PBS作对照的白光观察结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等编著)中所述的条件，或者按照制造商所建议的条件。

实施例1

获取家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3基因序列

根据家蚕基因组数据库SilkDB(https://silkdb.bioinfotoolkits.net/main/ species-info/-1)及kaikobase(https://kaikobase.dna.affrc.go.jp/)，获得BmPUGT3(BGIBMGA010295)基因的CDS序列(SEQ ID NO:1)，根据BmPUGT3的基因序列设计该基因的检测引物BmPUGT3-F及BmPUGT3-R，家蚕Actin 3基因为内参，引物为BmA3-F和BmA3-R。

BmPUGT3-F：5'-atggagattggattaaaagtag-3'(SEQ ID NO：2)

BmPUGT3-R：5'-ttacttttgattggacaaaacc-3'(SEQ ID NO：3)

BmA3-F：5'-atggtgcgctcctccaagaacg-3'(SEQ ID NO：4)

BmA3-R：5'-ctacaggaacaggtggtggcgg-3'(SEQ ID NO：5)

将正常家蚕大造品种以人工饲料于标准环境中饲养(温度：25℃，湿度：80％)，5龄起蚕，一部分添食家蚕微粒子虫，另一部分添食清水作为对照。在添食3h，6h，12h，24h，48h后分别取其中肠，用RNA提取试剂盒(R6934，OMEGA)提取RNA，然后用反转录试剂盒(A5001，Promega)将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，BmPUGT3-F及BmPUGT3-R为引物，用rTaq酶(R004,Takara)进行PCR扩增，BmA3-F和BmA3-R引物对为对照，扩增条件为：

对PCR产物进行琼脂糖凝胶检测。结果如图1、图2所示，BmPUGT3仅在感染24及48小时检测到其转录，而未感染的情况下没有检测到该基因的转录；并且在正常家蚕的各个组织中均未检测到该基因的转录。由此证明BmPUGT3确实可以被微粒子虫诱导表达。

取上述感染48小时家蚕的中肠，提取总RNA，以3'race oligo dt为引物用反转录试剂盒(A5001,Promega)将RNA反转为cDNA。以该cDNA为模板，BmPUGT3-F及GenRacer 3'primer为上下游引物，用Q5高保真酶(M0493，NEB)进行PCR扩增，其扩增条件为：

3'race oligo dt：5'-gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgtttttttttttttttttt-3'(SEQ ID NO：6)

GenRacer 3'primer：5'-gctgtcaacgatacgctacgtaacg-3'(SEQ ID NO：7)

用胶回收试剂盒(D2500,OMEGA)回收该PCR产物，并以PCR产物为模板，BmPUGT3-race-F2及GenRacer 3'Nested primer为上下游引物进行PCR，扩增条件如上所述，对扩增产物进行测序，得BmPUGT3基因3'端的序列(SEQ ID NO：8)。

BmPUGT3-race-F2：5'-tcccacgtttcttctggagc-3'(SEQ ID NO：9)

GenRacer 3'Nested primer：5'-cgctacgtaacggcatgacagtg-3'(SEQ ID NO：10)

利用网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)分析BmPUGT3基因序列，发现翻译起始密码子ATG上游1931bp的碱基序列存在4个假定的转录起始位点，如图3所示(序列号如SEQ ID NO：16所示)，并据此设计用于扩增该基因5'端序列的上游引物BmPUGT3-5'-F1、BmPUGT3-5'-F2、BmPUGT3-5'-F3、BmPUGT3-5'-F4以及BmPUGT3-F(SEQ IDNO：2)，所有上游引物分别与下游引物BmPUGT3-R(SEQ ID NO：3)配对，BmA3-F和BmA3-R引物对为阳性对照，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件如上所述。结果如图4所示，仅BmPUGT3-5'-F3、BmPUGT3-5'-F4及BmPUGT3-F引物得到有效扩增，对扩增产物进行测序，获得BmPUGT3基因的全长cDNA序列(SEQ ID NO：15)。综上，与家蚕基因组的序列进行比对可得，该基因由5个外显子构成，其ORF有756个碱基，编码252个氨基酸，其5’UTR有468bp，3’UTR有298bp。

BmPUGT3-5'-F1：5'-tccttaaactaaatataaag-3'(SEQ ID NO：11)

BmPUGT3-5'-F2：5'-atcaaatctagtatctgagctc-3'(SEQ ID NO：12)

BmPUGT3-5'-F3：5'-acgaacaaagtgtcacgttc-3'(SEQ ID NO：13)

BmPUGT3-5'-F4：5'-gaccgagattttattttaatttg-3'(SEQ ID NO：14)

实施2

BmPUGT3启动子的克隆及其表达载体的构建

由实施例1确定了BmPUGT3基因翻译起始位点ATG的位置，再根据家蚕基因组数据库，获得BmPUGT3基因翻译起始位点ATG前1931bp的基因组序列，用网站(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)分析这段序列，发现在这段序列中有典型的启动子结构区域(SEQ ID NO：16)，据此设计BmPUGT3基因的PPUGT3启动子特异性引物PPUGT3-F-EcoR I、PPUGT3-R-BamH I扩增该段序列。

PPUGT3-F-EcoR I：5’-ccggaattc acctaaatcttctgtacgcc-3’(SEQ ID NO：17)

PPUGT3-R-BamH I：5’-cgcggatcccattgaagatgaccatatgaat-3’(SEQ ID NO：18)

利用试剂盒(D3396,OMEGA)提取家蚕大造品系的基因组DNA，并以家蚕大造基因组DNA为模板，用引物PPUGT3-F-EcoR I和PPUGT3-R-BamH I进PCR扩增，扩增条件：

扩增后核酸电泳检测，用PCR产物回收试剂盒(D2500,OMEGA)回收PCR产物，获得BmPUGT3启动子片段，用T4连接酶(M0202,NEB)将目的片段与pMD19-T载体连接，转化至DH5a感受态细胞，获得阳性克隆pMD19-PPUGT3后测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致。

利用已经构建好的pSL[MCS-mCherry-SV40]载体(pSLfa1180fa载体上SV40终止信号序列上下游酶切位点分别是Not I和Hind III，mCherry上下游酶切位点分别是有BamH I和Not I)，将pMD19-PPUGT3和pSL[MCS-mCherry-SV40]载体均通过EcoR I和BamH I酶切，回收PPUGT3启动子片段及pSL[MCS-mCherry-SV40]的骨架，将PPUGT3启动子片段和pSL[MCS-mCherry-SV40]骨架用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，进而转化至DH5α感受态细胞，获得PPUGT介导的mCherry表达载体pSL[PPUGT3-mCherry-SV40]的阳性克隆。

实施3

BmPUGT3启动子功能验证

将实施例2中构建的pSL[PPUGT3-mCherry-SV40]载体通过脂质体转染至BmN-SWU1细胞系，脂质体与质粒转染比为2：1，ul:ug。28℃培养，12h后添加家蚕微粒子虫，家蚕微粒子虫与细胞的数量比为10:1，以添加PBS作对照，72h后通过荧光显微镜检测红色荧光情况。结果如图5中A、B、C、D所示，在转染pSL[PPUGT3-mCherry-SV40]的细胞中，当添加家蚕微粒子虫时启动子PPUGT3被激活并诱导其下游mCherry基因的表达而使细胞呈红色荧光，而对照组PBS则没有红色荧光，由此说明启动子PPUGT3是可以被家蚕微粒子虫所诱导激活，实现调控的目的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 西南大学

<120> 家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3006

<212> DNA

<213> 天然序列(natrual sequence)

<400> 1

acctaaatct tctgtacgcc tatttggacc aagttttact acatattctc ttaaatattt 60

taaattagca tgtaaatctc gcaattatcg tgacatcatt tccttaaact aaatataaag 120

aaatttcgca tgaactaaat aataacaaca tatactcgta atagagaata ctaaaataac 180

ggaaaaaaaa tattacaata tcaaagcaaa aacttacatt gcagtaagca cgtatttact 240

gtcaacgtat atgtagttca tgacttctta cgtagcatgg gtgaatgagc tcctcagcat 300

tggactcgag ctgactccta gctgctctat ctcggacccg tacaatttat ctcccggcgc 360

cctgcatatc ctctcatcat aaggcttgag cattctcccg gctcccggca gcaacaccct 420

tttctgtctt cttctattgt tctcatcgct tcatccaaat caatcttctg tgaggttttt 480

tttttctttt tctgtaattt gaaaatcttc tttcctctta tttctcgtct tcacaaactt 540

ctattcttca taatattctt cataattata tttcttcata ttttattcag ctactctcgt 600

attttacgta tgttgcaaaa attttaactg ctggctaagg gtcgccatgt attggagtgt 660

tgtaggtgaa ataaaagaga actgttcaag tcgacaattc gtgtaatact attataattt 720

agtgtgtgca gttacaaata taaggttaga tgagctgcac actacaatca tttcagccta 780

tcgccgtcca ctgctggaca taggcctctc caatagattt ccagtgcgac cggtccattg 840

ccacctgcat ccaacgagac ccagcgcttt ttactaggcc gtcggtccat ccagtaggtg 900

gccgtcccac actgcgcttg ccagtacgtg gtcgccactc caggatcttt ctgccccatc 960

gaccgtcctc tcttcgtgca atgtatacgg acatatatta ttataattac ttttatattt 1020

atagatgaat cttatatttc agactccacg ttcactatag aaaagctaat gcacaaaact 1080

catgcaggaa tggaaatgtt taaacttgtc aagtctttta ttaatacagc taatgataca 1140

gtatctaata cggaagtaca acagctgatg ttagatccgc agacacattt tgatgttgtt 1200

attgcagaat ggatggtaac tgaaattttt agtgggtaag atgaaacaat aattaataag 1260

cagagaaaac ctaataaata aaacaattgc gtaatgacga tcactgctac agataattaa 1320

ttatttgaaa ccaaatgaag tcacgataaa aaaagctaaa taagaagtcg ttaaataaat 1380

caaatctagt atctgagctc aaacccatta tcatattttt tgaagtgata gcgtctaaaa 1440

atcgatgagc accagctgca tacacgaaca aagtgtcacg ttcctcctga gcctgagcgt 1500

gcaagcgaga gcgcggaaca agcaatagag aggcacgatc ggcccaagcg ttgccttgtg 1560

acatattttt ttctcatctc gcgtgacgtc agagctagca gttctgatag ttctgctact 1620

aacgttaaac gtaaaacgtc cgtaaaccaa ttttacagcg accgagattt gagcaccagc 1680

tgcatactta ttttaatttg aaactcctct ttttgatctg attataggtg aaaaaaatgt 1740

tcacaccgtt accatcgtat cagagctcaa ttaaaaaaat ttacacatta ttacggtatc 1800

acgaaattat ctgctgtggg cctcatattt ctattttaga ttataagagt tattatggat 1860

attcgtctat caatatgtaa ctggaatatg atgttttttc agcttcggta aaattttcaa 1920

ctgtcctata attcatatgg tcatcttcaa tggagattgg attaaaagta gccaaatggt 1980

tttccatttc aatagaagaa catatttata aagaaggatt tgctgctgca ttcaaagcaa 2040

aaggtctcgt tcagcctagc ttggaagaat tgagatactc tgctgctttg gttttgggaa 2100

attcccacgt ttcttctgga gctccgctga cattgccaca aaattacaag gctattggtg 2160

gttatcatat agacgaacaa tctaagccat tgcccaagga atttaagaat attttagaca 2220

actcgaagca tggcgttatt tatttcagtc taggatcggt agtttcaagt aaatcgatgc 2280

ctgcagcaat caaaaccgga ttatttgaaa tgttcaggag tttaaaatat actgttatat 2340

ggaaattcga agatgacttt caaaatattc ctgataacgt tcacgtcgta aaatgggcac 2400

cacagcaaag catactagca catcctaact gcattctctt catcacccac ggtggcttat 2460

tgtctacaac ggaaacatta cattacggtg ttcctattat tggaataccc atatttggag 2520

atcaggtcat gaatatcaaa aaggctgtcc ataaaggcat tggactagaa gtgaaacttg 2580

acttggatac tccaaagaac ttgaaagcag ctataaatga ggttttgtcc aatcaaaagt 2640

tgaaaataaa ttactataaa ataaataact gggaacaaat tgcgcacgat cattcagccg 2700

caatttagga ttccctgggt tgtgggtacc agagactgat aaaaatactt atatatgttt 2760

aaatgtatac ataaatagat aataaatacc cagaacaaca gcaaacaaac ctattctaac 2820

acagagatcg tttttgccac acacccaagg tgtttcctga gctctacgcc atttcttcaa 2880

acgaggatcg actataatca taccatggtg tcacctaaga gtgaatgcaa tcactagatc 2940

acagtcaccg agatgtctgt tagctcgtag gcatataaaa ataaataaac tattattatg 3000

taacct 3006

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagattg gattaaaagt ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttacttttga ttggacaaaa cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtgcgct cctccaagaa cg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctacaggaac aggtggtggc gg 22

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgtttt tttttttttt tttt 54

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctgtcaacg atacgctacg taacg 25

<210> 8

<211> 1057

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggagattg gattaaaagt agccaaatgg ttttccattt caatagaaga acatatttat 60

aaagaaggat ttgctgctgc attcaaagca aaaggtctcg ttcagcctag cttggaagaa 120

ttgagatact ctgctgcttt ggttttggga aattcccacg tttcttctgg agctccgctg 180

acattgccac aaaattacaa ggctattggt ggttatcata tagacgaaca atctaagcca 240

ttgcccaagg aatttaagaa tattttagac aactcgaagc atggcgttat ttatttcagt 300

ctaggatcgg tagtttcaag taaatcgatg cctgcagcaa tcaaaaccgg attatttgaa 360

atgttcagga gtttaaaata tactgttata tggaaattcg aagatgactt tcaaaatatt 420

cctgataacg ttcacgtcgt aaaatgggca ccacagcaaa gcatactagc acatcctaac 480

tgcattctct tcatcaccca cggtggctta ttgtctacaa cggaaacatt acattacggt 540

gttcctatta ttggaatacc catatttgga gatcaggtca tgaatatcaa aaaggctgtc 600

cataaaggca ttggactaga agtgaaactt gacttggata ctccaaagaa cttgaaagca 660

gctataaatg aggttttgtc caatcaaaag ttgaaaataa attactataa aataaataac 720

tgggaacaaa ttgcgcacga tcattcagcc gcaatttagg attccctggg ttgtgggtac 780

cagagactga taaaaatact tatatatgtt taaatgtata cataaataga taataaatac 840

ccagaacaac agcaaacaaa cctattctaa cacagagatc gtttttgcca cacacccaag 900

gtgtttcctg agctctacgc catttcttca aacgaggatc gactataatc ataccatggt 960

gtcacctaag agtgaatgca atcactagat cacagtcacc gagatgtctg ttagctcgta 1020

ggcatataaa aataaataaa ctattattat gtaacct 1057

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcccacgttt cttctggagc 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgctacgtaa cggcatgaca gtg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tccttaaact aaatataaag 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atcaaatcta gtatctgagc tc 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgaacaaag tgtcacgttc 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaccgagatt ttattttaat ttg 23

<210> 15

<211> 1526

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acgaacaaag tgtcacgttc ctcctgagcc tgagcgtgca agcgagagcg cggaacaagc 60

aatagagagg cacgatcggc ccaagcgttg ccttgtgaca tatttttttc tcatctcgcg 120

tgacgtcaga gctagcagtt ctgatagttc tgctactaac gttaaacgta aaacgtccgt 180

aaaccaattt tacagcgacc gagattttat tttaatttga aactcctctt tttgatctga 240

ttataggtga aaaaaatgtt cacaccgtta ccatcgtatc agagctcaat taaaaaaatt 300

tacacattat tacggtatca cgaaattatc tgctgtgggc ctcatatttc tattttagat 360

tataagagtt attatggata ttcgtctatc aatatgtaac tggaatatga tgttttttca 420

gcttcggtaa aattttcaac tgtcctataa ttcatatggt catcttcaaa tggagattgg 480

attaaaagta gccaaatggt tttccatttc aatagaagaa catatttata aagaaggatt 540

tgctgctgca ttcaaagcaa aaggtctcgt tcagcctagc ttggaagaat tgagatactc 600

tgctgctttg gttttgggaa attcccacgt ttcttctgga gctccgctga cattgccaca 660

aaattacaag gctattggtg gttatcatat agacgaacaa tctaagccat tgcccaagga 720

atttaagaat attttagaca actcgaagca tggcgttatt tatttcagtc taggatcggt 780

agtttcaagt aaatcgatgc ctgcagcaat caaaaccgga ttatttgaaa tgttcaggag 840

tttaaaatat actgttatat ggaaattcga agatgacttt caaaatattc ctgataacgt 900

tcacgtcgta aaatgggcac cacagcaaag catactagca catcctaact gcattctctt 960

catcacccac ggtggcttat tgtctacaac ggaaacatta cattacggtg ttcctattat 1020

tggaataccc atatttggag atcaggtcat gaatatcaaa aaggctgtcc ataaaggcat 1080

tggactagaa gtgaaacttg acttggatac tccaaagaac ttgaaagcag ctataaatga 1140

ggttttgtcc aatcaaaagt tgaaaataaa ttactataaa ataaataact gggaacaaat 1200

tgcgcacgat cattcagccg caatttagga ttccctgggt tgtgggtacc agagactgat 1260

aaaaatactt atatatgttt aaatgtatac ataaatagat aataaatacc cagaacaaca 1320

gcaaacaaac ctattctaac acagagatcg tttttgccac acacccaagg tgtttcctga 1380

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ataaataaac tattattatg taacct 1526

<210> 16

<211> 1934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16