调控异化金属还原菌电子流的方法
阅读说明：本技术 调控异化金属还原菌电子流的方法 (Method for regulating and controlling electron current of dissimilatory metal reducing bacteria ) 是由 俞汉青 李�杰 汤强 刘东风 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：一种基于CRISPR-ddAsCpf1调控异化金属还原菌电子流的方法,包括如下步骤：(A)初步选择与能量代谢有关的系列基因；(B)构建靶向所述系列基因的crRNA库；(C)将含有crRNA库的质粒和编码ddAsCpf1的质粒转入异化金属还原菌内,并筛选能够调控异化金属还原菌的电子流的有效基因；(D)通过调控所述有效基因的表达来调控异化金属还原菌电子流。(A method for regulating and controlling electron current of dissimilatory metal-reducing bacteria based on CRISPR-ddAsCpf1 comprises the following steps: (A) preliminarily selecting a series of genes related to energy metabolism; (B) constructing a crRNA library targeting the series of genes; (C) transferring plasmids containing a crRNA library and plasmids coding ddAsCpf1 into the dissimilatory metal-reducing bacteria, and screening effective genes capable of regulating and controlling the electron current of the dissimilatory metal-reducing bacteria; (D) the electron current of the dissimilatory metal reducing bacteria is regulated and controlled by regulating and controlling the expression of the effective genes.)
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种通过抑制电子流竞争路径调控异化金属还原菌电子流的方法。
背景技术
异化金属还原细菌进化出了特有的胞外电子传递方式用以在厌氧环境中利用多种电子受体完成细胞呼吸代谢过程[1-3]。这类细菌也因为这个特点在污染物降解，能量回收，化学品生产，环境修复等方面具有重要作用。多种异化金属还原细菌，如Shewanellaspp.，Geobacter spp.，Pseudomonas spp.，Listeria spp.已经被不同的生境中筛选出来并表征了其对应的胞外电子传递通路。Shewanella oneidensis MR-1作为一株异化金属还原模式菌株，已经被广泛用于科学研究。Shewanella oneidensis MR-1具有一个复杂的胞外电子传递网络用来将胞内代谢产生的电子传递到胞外电子受体。该细菌胞内首先将L-乳酸氧化分解产生的电子汇聚到NADH池，进而传递电子通过醌池到达内膜和周质上的多种氧化还原终端酶，以及外膜上的孔蛋白-细胞色素复合体(OmcA-MtrCAB)并最终通过直接和间接的方式传递到胞外电子受体。
由于野生性的异化金属还原细菌的天然胞外电子传递速率较低的特点严重制约了这类细菌的实际应用过程，围绕着如何提高胞外电子传递速率的科学研究受到了相当的关注和重视。例如利用碳纳米管、多孔氮沉积碳布、电活性还原石墨烯-氧化物杂化生物膜等方法去建立导电性更好的细菌-电极界面已经取得了可以增强Shewanella oneidensisMR-1的胞外电子传递能力。最近，合成生物学的方法技术被应用于增强胞外电子传递能力并展现了很好的潜力。例如模块化构建NADH合成途径增加胞内NADH池容量，过表达胞内核黄素合成基因增加核黄素的合成水平，过表达MR-1胞内C-di-GMP合成基因ydeH和CAMP合成基因cyaC均取得了明显增强Shewanella oneidensis MR--1胞外电子传递速率的效果。然而，目前仍缺少稳健的增强细菌胞外电子传递能力的合成生物学方法。
基于CRISPR系统的基因编辑技术不断发展，因此在工程化改造细菌方面提供了更为简单便捷的新的可能性。基于灭活的dCas9的基因沉默技术在胞内结合基因组内的靶点DNA序列时不会造成DNA双链断裂进而避免了染色体粘贴率低的问题，目前该技术已经被广泛应用于多种原核细胞。最近，第2类V型CRISPR-Cas RNA-guided核酸内切酶Cpf1被证实是另一种高效的基因编辑工具。三种Cpf1蛋白已经被鉴定有效，包括源于Acidaminococcusspp.BV3L6的AsCpf1，源于Francisella novicida的FnCpf1和源于Lachnospiraceae的2YTCpf1。CRISPR-Cpf1作为基因编辑工具相比于spCas9具有多种优点。第一，只需要一个单独的crRNA去引导Cpf1靶向目标序列而不需要反式激活crRNA复合物；第二，Cpf1具有crRNA前驱体的RNA酶活性；第三，Cpf1识别富含胸腺嘧啶T的PAM序列，进而扩大了它的DNA靶向范围。这些特点激励我们用CRISPR-Cpf1工具去尝试调控异化金属还原细菌的胞外电子传递过程。
众多能量代谢相关蛋白通过将电子流传递到不同的终端电子受体的方式参与了细胞能量分配的过程。电子在传递过程中的分流和发散导致最终传递到胞外的电子当量减少，从而降低了异化金属还原细菌的实际应用价值。
因此，开发一种可以简单快捷调控异化金属还原细菌电子流的方法是非常必要的，将这种方法应用于异化金属还原细菌的工程化改造将有助于这类细菌在环境能源等领域的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CRISPR-ddAsCpf1调控异化金属还原菌电子流的方法。
本发明实施例提供了双质粒CRISPR-ddAsCpf1系统，用于特异性筛选和抑制异化金属还原菌Shewanella oneidensis MR--1的细胞色素基因，用于增强该细菌的胞外电子传递能力。其中一种质粒是由IPTG诱导型Plac启动子表达ddAsCpf1的pEAC01质粒，另一种质粒是由组成型启动子PCN表达crRNA的pECR质粒。在本发明的实施例中，所采用的gfp-lacZ基因簇位于MR-1细菌基因组内。通过将CRISPR-ddAsCpf1靶向不同的结合位置并测试细菌GFP荧光信号以此判断CRISPR-ddAsCpf1抑制强度。
本发明提供了一种基于CRISPR-ddAsCpf1调控异化金属还原菌电子流的方法，包括如下步骤：
(A)初步选择的与能量代谢有关的系列基因；
(B)构建靶向所述系列基因的crRNA库；
(C)将含有crRNA库的质粒和编码ddAsCpf1的质粒转入异化金属还原菌内，并筛选能够调控异化金属还原菌的电子流的有效基因；
(D)通过调控所述有效基因的表达来调控异化金属还原菌电子流。
在一些实施例中，所述与能量代谢有关的系列基因为细胞色素基因。
在一些实施例中，所述含有crRNA库的质粒为由组成型启动子PCN表达crRNA的pECR质粒。
在一些实施例中，所述编码ddAsCpf1的质粒为由IPTG诱导型Plac启动子表达ddAsCpf1的pEAC01质粒。
在一些实施例中，所述异化金属还原菌为希瓦氏MR-1细菌(Shewanellaoneidensis MR-1)。
在一些实施例中，利用WO3纳米探针表征所述异化金属还原菌的胞外电子传递能力变化。
本发明还提出了一种提高细菌还原污染物能力的方法，所述方法包括利用上述方法筛选能够调控异化金属还原菌的电子流的有效基因，并通过抑制所述有效基因的表达来提高所述异化金属还原菌的胞外电子传递能力。
在一些实施例中，所述异化金属还原菌为希瓦氏MR-1细菌(Shewanellaoneidensis MR-1)。
在一些实施例中，所述污染物为六价铬，所述有效基因选自SO0717、napB、dmsE、SO2930和nrfA中的一种或多种。
本发明提供了一种有效增加细菌胞外电子传递能力进而促进细菌还原污染物的途径，为使用合成生物工具设计异化金属还原细菌进行更有效的环境修复应用(例如处理富含染料的废水和修复重金属污染的土壤和地下水)奠定了基础。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。
图1为双质粒CRISPR-ddAsCpf1系统抑制MR-1细菌基因组内gfp-lacZ基因簇示意图以及效果验证。为合成可控载体消除基因线路示意图。CmR：氯霉素；TetR：四环素；终止子：T1T2；调控蛋白lacI；IPTG诱导型启动子PLac；组成型启动子PCN。
图2为CRISPR-ddAsCpf1靶点优化及效果验证。
图3为CRISPR-ddAsCpf1特异性抑制和筛选胞外电子传递能力增强的基因。
图4为CRISPR-ddAsCpf1筛选MR-1增强Cr(VI)还原能力靶点基因。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、双质粒CRISPR-ddAsCpf1系统构建和胞外电子传递强化效果验证
一、材料与方法
1、菌株、质粒及培养方法
本实施例中所有用到的菌株和质粒都列于表1中。其中，大肠杆菌NEB 10β用作克隆菌株，以及基因线路的表型验证。大肠杆菌WM3604用于结合转移。所有的大肠杆菌和希瓦氏菌都培养在2YT培养基中，大肠杆菌WM3604需要补加终浓度50μM的DAP进行培养。大肠杆菌培养于37℃下，希瓦氏菌培养于30℃下。2YT培养基的组成为：蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L。固体培养基中加入15g/L琼脂。
以上菌株根据需要加入抗生素：30μg/mL氯霉素(大肠感菌)，10μg/mL的氯霉素(希瓦氏菌)，10μg/mL四环素(大肠杆菌)，5μg/mL四环素(希瓦氏菌)。IPTG作为诱导剂，按照文中所标注的浓度加入到培养基中。
将菌株置于培养箱中静置培养，或者于摇床中以200rpm进行振荡培养。细菌生长用BioSpec-1601紫外分光光度计(Shimadzu公司，日本)测定波长600nm处的光吸收值(OD600)测定。
表1本发明实施例所用到的菌株和质粒
2、序列分析
希瓦氏细菌Shewanella oneidensis MR-1基因组的全序列数据获取自GenBank(登录号：NC_004347.2)。
3、DNA操作
希瓦氏菌全基因组通过E.Z.N.A全基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，北京，中国)提取。质粒通过E.Z.N.A质粒小量提取试剂盒(OMEGA，北京，中国)提取。所有用于质粒构建的DNA片段都通过E.Z.N.A胶回收试剂盒(OMEGA，北京，中国)切胶纯化。PCR扩增所用的酶，Gibson反应液配制所用的酶，以及限制性内切酶均购置于NEB公司(NEB，北京，中国)。Q5High-Fidelity DNA聚合酶用于扩增质粒构建所用到的片段，PCR验证使用OneTaq 2XMaster Mix。以上实验操作均按照产品说明书使用。
4、DNA测序
构建的质粒，以及PCR验证扩增的产物，均进行测序验证，以确定是目的载体或者PCR产物。测序由Genewiz公司(北京，中国)或者睿博公司(北京，中国)完成。
5、大肠杆菌电转化感受态的制备
1)从E.coli生长的2YT平板中挑取单菌落，转接到含有100mL 2YT液体培养基的三角瓶中，于摇床150rpm培养到OD600达到0.6的时候，取出摇瓶，冰浴25min，期间每隔5min轻轻的振荡一次。
2)收菌，在超净工作台将菌液分装到50mL离心管中，配平后于4℃以4000rpm离心15min。
3)弃掉上清液，用冰浴预冷的10％甘油悬浮细胞，用移液枪轻轻吹打悬浮细胞，彻底悬浮、离散沉淀的细胞后，离心收菌。
4)重复第3)步一次。
5)离心，弃掉上清，用1mL的10％甘油重新悬浮细胞。将感受态细胞以每管100μL分装到预冷的EP管中，冷冻于-80℃下备用。
6、DNA连接
构建质粒的方法主要通过Gibson连接的方式。
1)制备6mL的5X ISO Buffer，组分如下：
3mL 1M Tris-HCL(pH 7.5)
+150μL 2M MgCl2
+240μL 2M 100mM dNTP mix(25mM each：dGTP，dCTP，dATP，dTTP)
+300μL 1M DTT
+1.5g PEG-8000
+300μL的100mM NAD
+ddH2O至6mL，分装成160μL储藏于-20℃下备用。
2)制备600μL的Gibson连接MIX，组分如下：
160μL 5X ISO Buffer
+0.32μL 10U/μL T5 exonuclease
+10μL 2U/μL Q5 DNA polymerase
+80μL 40U/μL Taq DNA ligase
+ddH2O至1.2mL，分装成15μL于PCR管中，储藏于-20℃下备用。
3)使用的时候，取出一支15μL的Gibson连接MIX，置于冰上溶解、待用。
4)制备质粒构建的片段，并利用NanoDrop(Thermo)测定DNA浓度(ng/μL)。
5)将100ng的质粒载体骨架，和等摩尔的其他片段混合，用移液枪多次吸打，与Gibson连接MIX充分混匀，达到终体积20μL，不足的部分用ddH2O补足。
6)温浴于50℃之下至少60分钟。
7)取出反应的MIX，吸取1-5μL反应液到大肠杆菌感受态中，电转。
7、电转化步骤
1)将质粒或者Gibson反应液，与感受态充分混匀后，转移到2mm的电转杯中，静置冰上5分钟。
2)将电转仪(Bio-rad)设置到2.5KV的条件下电击，之后立即加入1mL 2YT培养基，上下颠倒混匀。
3)将悬浮于2YT培养基中的细胞转移到1mL的EP管中，复苏1小时后，涂布于相应抗性的平板上，置于温箱中倒置培养。
8、质粒构建
质粒构建所用到的引物列于表2中。
表2本发明实施例中所使用的引物
质粒的构建过程如下：将LacI-PLac-GFP-T1T2片段从pEC01K-PLAC质粒中扩增出来，并插入到PMT质粒骨架中构建成pMT-PLac-GFP。将ddAsCpf1基因片段从pXX55-ddAsCpf145扩增出来，并用其替换掉pMT-PLac-GFP质粒的gfp基因构建成pEAC01质粒。通过将PCN启动子、正向重复序列(DR序列)、T1T2双终止子于pCN00146质粒内进行有序组装构建成pECR-DR质粒。向导RNA库(crRNA)质粒构建则通过PCR反向扩增pECR-DR质粒引入不同的crRNA序列。9、细菌菌体生长以及荧光的测定
过夜培养含有CRISPR-ddAsCpf1系统的Shewanella oneidensis GZ细菌被转接到新鲜的2YT培养基中，并添加相应浓度的IPTG诱导剂。取出200μL置入96孔板(CorningCostar，cat.#3603)的培养孔中，置于酶标仪(BioTek，SynergyH4)中，于30℃下连续培养，并测定生长(吸收光600nm)和GFP绿色荧光(激发光波长488nm；检测波长520nm)。
10、WO3显色实验表征胞外电子传递速率
WO3纳米探针被用来表征希瓦氏细菌的胞外电子传递能力变化。用于表征细菌胞外电子传递能力的WO3纳米探针为根据文献[4]合成。细菌在2YT培养基中30℃培养1小时后加入终浓度5mM的IPTG诱导ddAsCpf1表达。培养24小时后，离心收集细胞并用乳酸钠矿物盐培养基洗一遍。之后在厌氧手套箱(DG250，Don Whitley Scientific Co.，UK)内用除氧的乳酸盐矿物盐培养基重悬成OD600＝0.2的菌液。将菌液转移至96孔板中，加入WO3探针，并用加入石蜡油封闭最上层液面。避光反应2h后用扫描仪测试WO3探针显色后的蓝色强度。蓝色越深表示细菌的胞外电子传递能力越强。
二、实验结果
1、在Shewanella oneidensis MR-1胞内建立一个双质粒编码的CRISPR-ddAsCpf1系统
双质粒编码的CRISPR-ddAsCpf1系统被设计和应用于希瓦氏细菌胞内，其中ddAsCpf1蛋白和crRNA分别由不同的质粒编码(图1A)。这种设计允许快速且容易地构建靶向基因的crRNA质粒。ddAsCpf1基因在带有四环素抗性标记的pEAC01质粒上由IPTG诱导型启动子控制。利用诱导型启动子控制ddAsCpf1基因的表达是为了减轻代谢负担和生长抑制。加入IPTG(0-10mM)可实现高效的基因表达。向导RNA(crRNA)则由带有氯霉素抗性基因的pECR系列质粒编码。由于已有研究表明提高sgRNA的表达水平有助于提高基因组编辑效率，我们设计的crRNA也由强大的组成型PCN启动子进行表达。
此后，已整合到希瓦氏菌基因组中的GFP-lacZ串联报告基因被用作CRISPR-ddAsCpf1系统的靶向基因，用以检验已经构建的ddAsCpf1-crRNA系统进行基因沉默的可行性(图1B)。诱导产生的ddAsCpf1蛋白与组成型表达的crRNA形成ddAsCpf1-crRNA复合物，从而物理上阻断了RNA聚合酶催化的转录反应。crRNA片段在DR序列的正后方包含～23nt碱基配对区域(图1C)。在构建crRNA质粒时，可使用含有目标特异性23-nt碱基配对区域作为突出端的引物通过反向扩增PCR技术轻松导入crRNA目标序列。然后，设计靶向gfp报告基因模板链上核糖体结合位点(RBS)正下游T1靶点的crRNA，并构建相应的crRNA质粒pECR-T1。将其与编码质粒pEAC01的ddAsCpf1一起转化，以引发基因沉默反应。结果与对照相比，T1靶点被CRISPR-ddAsCpf1结合的细菌在显微镜下观察GFP荧光完全消失(图1D)，这表明CRISPR-ddAsCpf1系统在希瓦氏细菌胞内实现了有效的基因沉默。
2、表征CRISPR-ddAsCpf1结合不同靶点对基因沉默效果的影响
为了促进CRISPR-ddAsCpf1在快速靶向基因位点的使用，我们进一步研究了不同的crRNA靶向位点对基因沉默效果的影响。首先我们设计并构建了三个分别靶向NT1，P1和NP1的crRNA质粒(图2A)。其中P1位于DNA模板链上，与T1相同。NP1和NT1在非模板链上。P1和NP1位于PL启动子的下游，而T1和NT1位于RBS1的下游。用5mM IPTG诱导CRISPR-ddAsCpf1靶向这些位点，并通过细菌GFP荧光强度变化评估了结合靶点对CRISPR-ddAsCpf1的基因沉默效果的影响。结果发现crRNA-T1和crRNA-NT1都导致细菌GFP荧光的完全淬灭，实现了gfp基因表达水平大约100％强度的抑制(图2B)。而crRNA-P1和crRNA-NP1在18h分别导致细菌GFP荧光下降60.42％和63.87％。总之，这些结果表明：模板DNA或非模板DNA上的ddAsCpf1结合靶点对基因沉默效果的影响有限。与位于启动子下游的靶点相比，选择位于RBS下游的结合靶点可以更有效地抑制基因表达。
3、通过CRISPR-ddAsCpf1系统实现调控希瓦氏细菌电子流
接下来将已建立的CRISPR-ddAsCpf1系统用来重新改变S.oneidensis MR-1中的电子通量以提高其胞外电子传递速率。我们选择了十个与沙门氏菌MR-1的能量代谢有关的代表性细胞色素基因进行测试(图3A)，并建立相应的crRNA库以靶向位于基因组中的这些基因(表3)。
表3：选择的希瓦氏胞内10个细胞色素基因信息
通过qRT-PCR进一步验证了CRISPR-ddAsCpf1系统单独靶向选择的基因后，这些基因的转录水平相比于对照组均明显下降(图3B)。
然后使用WO3探针进一步表征了CRISPR-ddAsCpf1调控后的希瓦氏细胞的胞外电子传递能力。结果发现所选择的十个基因靶中的七个基因被CRISPR-ddAsCpf1抑制后，希瓦氏细菌的胞外电子传递能力与对照相细菌比增强了(图3C)。其中五个靶点基因(sorB，SO0717，fccA，dhc和coxB)被抑制后，细菌显示出比对照组高出1倍的胞外电子传递速率，并且crRNA-coxB的增强效果比对照高出2倍。这表明电子流调控策略可以有效地调节电子通量流向并使得希瓦氏细菌展现更高的胞外电子传递效率。
实施例2、CRISPR-ddCpf1增强Shewanella oneidensis MR-1降解污染物
一、材料与方法
1、菌株、质粒与培养条件
本实施例采用的菌株、质粒与培养条件与实施例1保持一致。
2、污染物还原实验
六价铬Cr(VI)被选作目标污染物用于测试CRISPR-ddAsCpf1系统强化后的希瓦氏细菌的污染物还原能力变化。污染物还原实验在含有20ml乳酸钠矿物盐的厌氧血清小瓶中进行，其中乳酸钠作为唯一电子供体，污染物作为唯一电子受体。小瓶中加入终浓度10μg/ml的氯霉素，5μg/ml的四环素和1mM的IPTG。开始污染物降解实验之前，将重悬浓缩的细菌加入小瓶中，Cr(VI)还原实验的细菌浓度为每毫升培养基含有1.86毫克细菌，Cr(VI)还原的初始浓度为20mg/L。Cr(VI)还原实验在厌氧手套箱内进行。所有实验设置3个平行组。
二、实验结果
使用Cr(VI)作为代表污染物，我们进一步验证了电子流调控策略增强胞外电子传递能力和生物还原污染物的效果。Cr(VI)的生物还原实验得到了相似的结果。如图4所示，我们通过CRISPR-ddAsCpf1系统筛选确定了6个有效的Cr(VI)还原增强基因，其中五个基因被抑制后细菌的Cr(VI)还原增幅超过25％(图4A)。而dmsE基因被抑制后，细菌在Cr(VI)还原率方面表现出相对最高的增强效果(提高38.14％)(图4B)。该实施例中筛选的基因与实施例1中筛选的基因不同，这应是由于电子受体不同所致。这些结果表明电子流调控策略成功地应用于增强Cr(VI)的还原速率。因此，该策略提供了一种有效增加细菌胞外电子传递能力进而促进细菌还原污染物的途径。
总而言之，我们设计了一种使用CRISPR-ddAsCpf1来重新改变希瓦氏MR--1细菌电子通量以增强其胞外电子传递能力的方法。在该方法中，我们首先根据遗传分析和前人的研究选择潜在的基因靶标。其次，构建crRNA文库以寻找基因靶标。第三，将crRNA文库和ddAsCpf1编码质粒都转化到异化金属还原菌胞内，并筛选有效的胞外电子传递能力增强的基因靶标。除了希瓦氏MR-1细菌外，我们将已开发的CRISPR-ddAsCpf1系统也在大肠杆菌中成功验证基因沉默的效果，借以表明该系统可扩展至其他细菌。CRISPR-ddAsCpf1系统介导的这种转向电子通量策略也可以扩展到其他异化金属还原细菌物种。因此，它为探索不同基因的功能提供了一个有效的平台，并为使用合成生物工具设计异化金属还原细菌进行更有效的环境修复应用(例如处理富含染料的废水和修复重金属污染的土壤和地下水)奠定了基础。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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