具体实施方式

一、材料与方法

1.1试验材料与地点

本次高温胁迫试验选用的材料均为植株健壮、生长状况良好种子起源的一年生多花梾木盆栽苗，其生长高度基本一致，每盆重量6kg(含砂壤土，有机质含量15.827g/kg)左右、叶片数超过80片(不含嫩叶)，每盆1株，每个处理计30盆共3个重复，整个盆栽苗胁迫试验期间在全自动智能人工气候箱内进行。

1.2试验仪器

多功能全自动人工气候箱、CM-700d/600d分光测色仪、SPAD叶绿素含量测定仪、Handy PEA高速连续激发式荧光仪、超低温冰箱、离心机、梅特勒ML204型万分之一天平等。

1.3试验设计

1.3.1预试验

在2019年7～9月进行盆栽苗的初步胁迫试验，拟定两组。根据中国各地引种情况及日本各地栽植情况，拟设定温度分别在35℃和40℃，观察人工气候箱内植株叶片随胁迫进行的反应变化，分别得出相应的平均存活天数约34d和24d，结果如表1和表2所示。

表1 35℃温度胁迫试验多花梾木幼苗平均存活天数

表2 40℃温度胁迫试验多花梾木幼苗平均存活天数

1.2.2胁迫试验

随后根据预试验植株的存活天数，确定胁迫起始温度为35℃，最终温度为45℃，于2019年10月14日进行高温胁迫试验。试验设置两组，同时进行，T为试验组(35℃～45℃的高温胁迫)30盆，3个重复，CK为对照组(35℃保持不变)；试验设计采用单因子完全随机变量(表3)。试验前用与盆栽苗冠幅大小一致的软质透水无纺袋将多花梾木植株土球包裹，并在盆栽苗底部垫有半径一致的托盘，及时浇水保持托盘内水分，利用土壤对水分虹吸能力保持植株水分平衡。

表3单因子完全随机变量试验设计

实验开始，将盆栽苗置于人工气候箱内，并保持相邻两株5cm左右间隔，尽量减少植株间的相互影响，调节气候箱内初始环境参数，光照度3000lx，光处理14h，暗处理10h(为了模拟北半球夏季昼夜长短变化)，其他环境因子保持不变，胁迫初始温度35℃，之后每隔2d上升2℃，当温度达到39℃每隔2d温度上升1℃(根据长江中下游气候特点，39℃己处于高温状态，为缓解高温对植物带来的生理影响，使植物对高温更易适应，利于试验进一步进行，将温度的调整放缓)，直至温度45℃试验结束。试验期间，每隔2d进行指标测定和叶片采样工作，指标测定和叶片采样工作为晚上8点，测定时选定的叶片样本均选自每株盆栽苗的中间部位，含水量测定的样本来自植株基部，采样工作则选择不同植株同样部位的叶片1～3片，共20片，采样完毕后叶片样品立即放入密封袋中，标好序号，用冰袋包裹放置-180℃超低温冰箱密封保存以供后期测样。

二、试验测定指标与方法

2.1叶片生长形态与形色指标测定

植株的外部生长形态通过观察记录叶片的形态变化表示，根据叶片的生长状况和外观质量，将叶片外观形态分为5个等级。其中，Ⅰ级：饱满正常；Ⅱ级：比较饱满正常；Ⅲ级：失水皱缩；Ⅳ级：严重失水皱缩；Ⅴ级：完全失水焦枯(详见表4)。

表4叶片外观形态等级

叶片的形色指标(色度)采用分光测色仪CM-700d/600d进行色差测定，选取植株中上部固定位置较大叶片，使用校正后的分光测色仪测量固定叶片的叶片上部位置，将第一次测定的叶片数据记为初始标准色，其L(照度/亮度)、a(红绿值)、b(黄蓝值)即为初始标准色三参数，此后每次测量所得数据为对比色(对比参数)，以△L、△a、△b作为相应色差指标。△E为总色差变化。其中△E在0～0.5间为变化微小；0.5～2.0为变化一般；2.0～4.0为变化较大；4.0以上则为变化非常大。

计算公式：

2.2叶片含水量测定

叶片含水量通过烘干称重法测定。在植株底部选取大小适中的叶片取样，每株取3片，首先称量叶片采下后的质量，记为叶片鲜重m1；随即将所有称重后的叶片放入蒸馏水中充分浸泡5h后取出并擦干叶片表面水分，此时测量叶片饱和质量记为m2；最后将叶片放置105℃的烘干箱中杀青30min后，再用80℃烘干箱烘烤12h至叶片恒重，此时测量其叶片干物质重，记为叶片干重m3。通过公式计算叶片含水量(LWC)、叶片相对含水量(LRWC)。

计算公式为：

2.3叶片叶绿素含量测定

叶绿素含量测定流程：选择相同植株中上部同一叶片每隔两天使用SPAD叶绿素仪器进行叶绿素相对含量测量，同一叶片测量5次，取平均值作为叶绿素含量，记录数据并比较叶绿素相对含量随试验进行温度升高的变化。

2.4荧光动力学参数测定

荧光动力学参数测定流程：使用Handy PEA高速连续激发式荧光仪测定叶绿素荧光参数，测量前首先选择固定健康叶片部位进行30min金属片闭光暗反应，随后每次测定工作重复3次，测定的叶绿色荧光参数指标包括初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、PSⅡ系统的最大量子效率(Fv/Fm)和PSⅡ量子效率(Fv/Fo)。

计算公式：

2.5生理生化指标测定

试验测定的生理生化指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)，均为植物细胞内存在的化学物质，其指标含量的高低与植物氧代谢活动和植物体衰老及抗逆性有着密切的关系。测定方法如下：

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定，以抑制NBT光化学还原作用从而确定酶活性大小，其中SOD活性单位以抑制NBT光化学还原的50％为一个酶活性单位表示；其中A0：光下对照管吸光度；As：样品测定管吸光度；Vt：样品提取液总体积(mL)；Vs：测定时取粗酶液量(mL)；Fw：样品鲜重(g)。

计算公式为：

过氧化物酶(POD)活性测定：采用愈创木酚比色法测定，以过氧化氢(H₂O₂)将愈创木酚氧化后的产物在470nm处的吸光度变化测定，每分钟A470nm增加0.01记为1个酶活力单位(U)；其中△A470：470nm波长下吸光度值变化；Vt：提取酶液总体积(mL)；Vs：测定时取用酶液体积(mL)；Fw：样品鲜重(g)。

计算公式为：

丙二醛(MDA)含量测定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定,以离心后的多花梾木样片上清液于分光光度计上450、532、600nm处的吸光值A450、A532、A600数值根据公式计算得出。其中A450：450nm波长下吸光度值；A532：532nm波长下吸光度值；A600：600nm波长下吸光度值；Vt：提取酶液总体积(mL)；Fw：样品鲜重(g)。

计算公式为：

三、实验结果

3.1高温胁迫对多花梾木叶片生长形态的影响

从图1-3可知，高温胁迫下，多花梾木叶片的外部生长形态发生了十分显著的改变，具体地，第2d在初始温度35℃的胁迫下，叶片外观为Ⅰ级：叶色正常，叶片饱满完整，无萎蔫焦枯或灼伤现象；第4d至第8d，胁迫温度在37℃～40℃间，叶片叶色基本正常，叶片比较饱满，仅小面积或叶边缘出现萎蔫焦枯或灼伤现象，叶片外观为Ⅱ级；第10d，胁迫温度达到41℃，此时，叶片的外部生长形态发生了较大的变化，其叶色失绿变淡，叶片皱缩，大面积出现萎蔫焦枯或灼伤现象，尚有生命体征，叶片外观为Ⅲ级；胁迫试验进行的第12～14d，叶片外观为Ⅳ级：叶片严重失水枯黄；至第16d，此时在44℃高温下，叶片外观为Ⅴ级：叶片完全失水，全部焦枯，叶片完全失去生命体征。与胁迫试验组T相比，对照组的多花梾木叶片症状变化不大(表5)，经过16d仅在叶边缘出现少许干枯反卷现象。

第14d胁迫温度达到41℃时为胁迫试验叶片变化的分水岭，此时叶片尚有生命体征，在此之前，叶片叶色基本正常，整体饱满；此后多花梾木叶片变化巨大，迅速失水皱缩变淡，直至叶片完全失水死亡。

表5高温胁迫后多花梾木叶片的症状变化

注：空白表示正常；+表示症状同前。a表示渍斑；b表示叶变色；c表示叶脱落或枯萎；d表示植株死亡。

分光测色仪测定的叶片色差指标包括a(红绿值)、b(黄蓝值)、L(照度/亮度)三个参数，对比参数△a、△b、△L。当a、b、L均为正值时，其中△a若为正值，则说明叶色较初始温度胁迫时的标准a色红，反之则表示偏绿；△b若为正值，则说明叶色较初始温度胁迫时的标准b色黄，反之则表示偏蓝；△L若为正值，则说明叶色较初始温度胁迫时的标准L色度明亮，反之则表示偏暗。

色差指标变化结果如图4，图中△a、△L均呈上升趋势，△a上升幅度最大，较初始a(红绿值)最大峰值上升了6.18NBS；△L上升幅度较小，在胁迫试验的16d中仅上升了1.81NBS；而△b呈缓慢下降趋势，其最小值较初始b(黄蓝值)仅下降2.02NBS；由此可知，在胁迫试验中，多花梾木叶片变红变蓝，即由绿色度逐渐变浅，叶片明暗度趋于稳定。总色差变化△E在试验前10d(35℃～41℃)基本介于变化一般与变化较大间，后6d(42℃～44℃)变化非常大。

△a、△b、△L三个指标在37℃～41℃间总体变化不大，在一定小范围内略有波动，整体趋势比较稳定。除△L外，△a、△b变化值占各自总变化值的16.05％、44.45％；41℃～44℃间，△a、△b大幅变化，其中△a在此期间上升值占总上升值的83.95％；△b则为55.55％，△E同样在37℃～41℃间数值变化仅占总变化的33.97％。

综合以上图例，叶片色差△a、△b、△L、△E四个指标的变化趋势和叶片的外部生长形态变化基本一致，以第10d时41℃为界分为两个阶段，第一阶段(胁迫的前10d)叶片外部变化不明显，仅边缘有少量焦枯褐斑，叶色仅有少量变化，绿色略有变淡，叶肉饱满，富有一定弹性，总体生命特征明显；第二阶段(胁迫的后10d)，多花梾木叶片出现大量焦枯褐斑，叶色有较大变化，绿色迅速变黄变褐，叶边缘反卷失水萎缩，叶片变脆变硬，直至完全死亡。

3.2高温胁迫对多花梾木叶片含水量的影响

试验期间，为了减少多花梾木在人工气候箱中除温度外其他因子，每隔一定时间向盆栽苗补水，利用土壤的虹吸效应，保持植株的水分基本平衡，后期温度上升，水分蒸发加快，为继续保持根际微环境的和植株的水分供给，补水的间隔时间进一步缩短。图5对照组CK在35℃下无论是LWC(叶片含水量)还是LRWC(叶片相对含水量)均无较大变化，基本在初始含水量数值上下降了约10％；而在高温胁迫的试验组T，LWC和LRWC随着试验的进行，整体呈下降趋势。以第8d(40℃)为界，之前(含第8d)LWC和LRWC下降趋势较慢，两者分别下降23％、23.2％，第8d之后，LWC和LRWC大幅下降了约45.6％、33.9％。尤其是第8d至第10d(40℃～41℃)，LRWC数值由72.8％直线下降到42.2％，下降了30.6个百分点；同时LWC数值也下降了16.8个百分点；两指标均在第14d(43℃)达到含水量的最小值，约20％，此后第16d(44℃)有一定的小范围的回升。

3.3高温胁迫对多花梾木叶片叶绿素含量的影响

叶绿素含量测定结果如图6，在16d的试验中，试验组T和对照组CK的叶绿素相对含量均随试验进行有不同程度的降低。整个试验T和CK分别由59.59曲折下降至23.52、63.5稳步下降至53.41，各自下降了36.07和10.09个spad相对值。多花梾木试验组以第8d(40℃)为界，第一阶段(第2d至第8d)小幅度下降8.8个spad叶绿素单位，仅占总下降范围的20％；第二阶段(第8d至第16d)大幅度下降27.2个spad叶绿素单位，占总下降范围的80％；尤其是第10d(41℃)，叶绿素相对含量下降了10.75，此后每日下降约5个单位，直至第16d达到最低值23.52，叶片叶绿素含量偏低，植株光合作用能力几乎为零。

3.4高温胁迫对多花梾木叶片荧光动力学参数的影响

植物的荧光参数是三大消耗叶绿素吸收光能的途径，与光合电子转移途径和热耗散途径三者此消彼长，叶绿素荧光参数变化可以反映植物光合作用的基本情况。Fo固定荧光(初始荧光)，作为光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心处于完全开放时的荧光产量，可以反映经过系统的电子传递；Fm最大荧光，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可以反映PSⅡ系统电子传递情况^[19]。

由图7所示，16d的胁迫试验中Fo除第12d稍微下降外，总体基本呈平稳上升趋势；Fm随着高温胁迫时间的延长持续下降，共下降了1408个单位，以第8d(40℃)和第12d(42℃)为分界点，Fm在第2d至第8d第一阶段下降了525个单位，第8d至第12d第二阶段下降了641个单位,第12d至第16d第三阶段下降了242个单位，三阶段分别下降范围占总下降范围的37％、46％、17％，第一、三阶段变化较为平缓，第二阶段下降幅度最大；通常情况下，初始荧光和最大荧光的大小一般不会存在较大的波动，Fo的持续上升和Fm的持续下降反映了PSⅡ系统的净光合速率(Pn)持续下降；进一步说明多花梾木叶片荧光能力也随着下降，光化学量子产量显著下降，光合系统中热耗散途径耗能显著减弱，高温胁迫对叶片光合作用反应机制产生了一定不可逆的伤害。

可变荧光(Fv)是Fm与Fo的差值，可变荧光Fv与最大荧光Fm的比值(Fv/Fm)则是PSⅡ最大光化学量子产量，可变荧光Fv与初始荧光Fo的比值(Fv/Fo)为叶绿素光合潜在活性，其两指标在植物非胁迫条件下生长变化幅度很小，而在胁迫条件下明显降低，尤其是Fv/Fm的降低常被判断是否发生光抑制的重要参数。试验结果如图8所示，Fv/Fm随着试验天数的延长不断下降，由试验初始的0.81降低至0.57，其中第8d到第10d下降幅度最大，比率下降了约0.13，约占整个下降范围的41％；光合潜在活性(Fv/Fo)试验期间下降了3.40，以第8d(40℃)和第10d(42℃)为界，Fv/Fo在第2d至第8d第一阶段下降了1.16，约占整个下降范围的34％；第8d至第10d第二阶段下降幅度最大，下降的1.44个单位约占整个下降范围的43％；最后的第三阶段下降幅度有所减缓，仅降低0.79单位，约占整体23％。两个参数不同幅度的下降进一步表示PSⅡ系统损伤，PSⅡ捕获光能能力和PSⅡ潜在活性的持续下降，反应中心在高温胁迫下受到了严重的损坏。

3.5高温胁迫对多花梾木内部生理生化指标的影响

对多花梾木在高温胁迫下的SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、MDA(丙二醛)含量的测定结果如图9所示，为期16d的高温胁迫试验，SOD酶活性指数总体趋势先降后升，以第8d(40℃)为界，第2d至第6d第一阶段前6dSOD酶含量下降了约35％，并在第6d达到整个试验SOD酶含量的最小值；此后在试验第二阶段接下来的10d中，稳步上升，但含量在第10d至第16d变化幅度不大，无显著差异，由此可知SOD酶在反应前期未过多参与抗氧化机制，后期植物反应中心为确保植株体正常代谢，导致SOD酶活性上升。

高温胁迫下POD(过氧化物酶)活性结果表明，经过16d的高温试验，随着试验处理时间的延长，POD酶含量呈现先减后增的趋势，以第8d(40℃)为界，前6d的POD酶含量以每日约30％的下降率下降到第6d的最低值，此后含量不断上升，并且达到最高值，比初始水平下的POD值增加了43.9％，第16d进一步下降。

高温胁迫下MDA(丙二醛)含量结果表明，经过16d的高温试验，MDA酶含量随时间延长同样呈先减后增的趋势，含量前后上升了15％，第8d最低值和第14d最高值之前相差了约10个单位；第2d至第8d(35℃～40℃)第一阶段MDA含量持续下降，第8d后稳步上升，试验前后MDA含量先减后增，反应多花梾木在面对高温时响应抵抗机制有一定的滞后性，尤其是表现在生理反应方面，试验期间，正值盛夏，前期多花梾木在试验前期并未过多对于外界不良环境的影响，生理代谢活动仍能进行，故MDA含量持平甚至有下降趋势；后期启动抗氧化抵御措施的同时，MDA分泌也被进一步激发，含量明显升高，细胞体内活性氧被高温大量破坏。

由试验过程中多花梾木各方面指标变化表现来看，在高温胁迫下，多花梾木外部形态尤其是叶片发生了巨大的变化。叶片的外部形态在试验开始的6d未发生明显的变化，以第10d为界，这之前植物叶色基本正常，叶片外观保持在Ⅰ～Ⅱ级内，仅部分叶边缘有泛黄现象，整体仍富有生命力，第10d植物尚有生命活力，第10d(41℃)后叶片外部形态不断恶化，褪色现象加剧，叶片萎缩；而体内含水量和叶绿素含量在第8d大幅下降，试验表明高温破坏多花梾木PSⅡ反应中心，使得叶片荧光能力下降，生长过剩光能从而进一步破坏叶绿素光合机构，伤害植株体；内部相关生理的变化临界日期同样比植株外部形态变化临界日期稍有提前。

根据以上各项试验结果来看，从40℃至41℃是多花梾木形态和色泽变化最明显的阶段，也是各个生化指标变化表现最剧烈的时段，所以可以确定40℃是多花梾木适应生存的临界温度，达到41℃就会迅速造成多花梾木叶片枯萎甚至掉落，生理生化受到重创。因此多花梾木的叶片在Ⅱ级时(叶片形态和色差同为Ⅱ级)，可以正常生长，到Ⅲ级时，则不能栽植多花梾木。