一种肺靶向载药外泌体及应用和治疗肺部疾病药物
阅读说明：本技术 一种肺靶向载药外泌体及应用和治疗肺部疾病药物 (Lung targeting drug-loaded exosome and application and lung disease treatment drug ) 是由 姜海涛 王天怡 于 2021-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,公开了一种肺靶向载药外泌体及应用和治疗肺部疾病药物,由用于治疗肺部疾病的药物导入到具有肺组织靶向性的外泌体中获得,具有肺组织靶向性的外泌体来源于结直肠细胞；肺部肿瘤治疗药物包含上述肺靶向载药外泌体。与现有技术相比,本发明使用结直肠细胞分泌的外泌体不需要作任何修饰就可以在肺部富集,用结直肠细胞来源的外泌体,解决了外泌体产量的问题,具有很好的应用前景；而且用结直肠细胞来源的外泌体可以装载不同药物或活性分子,通过靶向肺组织给药,提高肺部疾病的治疗效果,降低药物毒副反应。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and discloses a lung targeting drug-loaded exosome and a drug for applying and treating lung diseases, wherein the drug for treating lung diseases is introduced into the exosome with lung tissue targeting property, and the exosome with the lung tissue targeting property is derived from colorectal cells; the lung tumor treatment drug comprises the lung targeting drug-loaded exosome. Compared with the prior art, the invention uses the exosome secreted by the colorectal cell to enrich in the lung without any modification, and uses the exosome derived from the colorectal cell to solve the problem of the output of the exosome, thereby having good application prospect; moreover, the exosome from the colorectal cell can be loaded with different drugs or active molecules, and the drug delivery is carried out by targeting lung tissues, so that the treatment effect of lung diseases is improved, and the drug toxic and side effects are reduced.)
技术领域
本发明属于生物医药
技术领域
，特别是一种肺靶向载药外泌体及应用和治疗肺部疾病药物。背景技术
肺脏是人体重要的器官之一，肺脏的异常会引起各种肺脏疾病。包括支气管炎、肺纤维化、肺气肿、肺脓肿、肺栓塞、慢性阻塞性肺疾病、肺炎、肺结核、气胸、肺大泡、肺部结节、肺部肿瘤等。肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。尽管癌症的诊断和治疗取得了一定进展，在癌肿病例中，肺癌是发病率和病死率位居第一位的癌症。
靶向给药体系是指能将治疗药物或活性物质专一性地导向所需发挥作用的器官或部位，而对非靶组织没有或几乎没有相互作用的治疗手段。由于靶向制剂可以提高药效、降低毒性，可以提高药品的安全性、有效性、可靠性和病人用药的顺应性，所以日益受到国内外医药界的广泛重视。目前癌症治疗无论是化药还是生物分子，都涉及到以下三个问题，第一：药物由于缺乏靶向性，对正常组织产生杀伤作用，导致毒副作用高，患者耐受性差。第二：很多药物分子由于是水溶性的，很难被细胞摄取，在细胞内难以达到有效药物治疗浓度；第三：药物分子在体内的稳定性问题，到达病灶前，身体内会有很多酶系对其降解，生物大分子稳定性差，在体内容易被降解。因此，目前亟需一种药物递送系统，其应同时具备生物相容性好，跨膜递送能力强，具有组织靶向性，稳定性高的特点。
纳米药物递送系统的开发在一定程度上解决了上述问题。然而，基于脂质体或白蛋白的纳米载体在血液中不能稳定存在，易被网状内皮系统(或单核吞噬细胞系统清除)，缺乏组织靶向性，难以达到理想治疗效果。近年来，外泌体作为新兴的药物递送载体，受到了越来越多研究者们的关注。外泌体可以作为载体，装载药物并递送到相邻或者远处的细胞。与被广泛研究的脂质体相比，外泌体显示出更大的优势，其具备良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，稳定性以及低免疫原性。因此，制备具有肺靶向作用的外泌体载药体系是治疗肺部疾病理想的解决方案。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有抗肿瘤凋亡、促进有丝分裂、调节细胞周期、参与血管生成和放化疗耐受等多种功能，因此受到了国内外学者的广泛关注。Survivin具有肿瘤特异性，它几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性的表达。在胚胎早期细胞中检测到survivin的表达，表明survivin参与了正常胚胎组织的发育过程，然而，当组织发育成熟后，就很难检测到survivin的表达，在绝大多数成人组织中几乎没有表达。因此针对survivin的抗肿瘤治疗可以将毒副作用降至最低。
因此，制备一种高效的肺靶向外泌体载药体系对肺部相关疾病进行治疗是亟需的。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种肺靶向载药外泌体及应用和治疗肺部疾病药物，通过靶向肺组织给药，提高肺部疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种肺靶向载药外泌体，所述肺靶向载药外泌体由用于治疗肺部疾病的药物导入到具有肺组织靶向性的外泌体中获得，所述具有肺组织靶向性的外泌体来源于结直肠细胞。
当然，结直肠细胞也可以进行基因修饰或改造以使其对肺组织具有靶向性，包括但不限于基因改造，基因修饰、基因过表达或删除、分子修饰等；结直肠细胞的外泌体也可以进行表面修饰或改造以使其对肺组织具有靶向性，包括但不限于表面蛋白修饰、表面蛋白改造、表面小分子修饰等。
作为本发明的优选方案，所述结直肠细胞包括但不限于人结直肠细胞、动物结直肠细胞、人结直肠癌细胞、动物结直肠癌细胞、诱导多能干细胞诱导的结直肠细胞。
作为本发明的优选方案，所述动物结直肠细胞和动物结直肠癌细胞中的动物包括但不限于猴、小鼠、仓鼠、大鼠；所述人结直肠细胞包括但不限于正常人结直肠组织上皮细胞NCM460、HCoEpiC、FHC、CCD841CoN、NCOL-1、NCM356；正常人结直肠组织成纤维细胞CCD-18Co、BNCC342560、CCD-33Co、CCD-112CoN；
作为本发明的优选方案，所述用于治疗肺部疾病的药物包括但不限于siRNA-survivin、microRNA、siRNA、蛋白、抗体、紫杉醇、卡铂、依托泊苷、阿霉素、多柔比星、长春新碱。
进一步地，用于治疗肺部疾病的药物导入到具有肺组织靶向性的外泌体的具体步骤为：
1)将用于治疗肺部疾病的药物和具有肺组织靶向性的外泌体放入电转杯中；
2)采用指数或方形波，使用50-300V电压对用于治疗肺部疾病的药物和具有肺组织靶向性的外泌体进行电转；
3)将电转产物于37℃中水浴30min后，在100000g离心力下离心120min去除游离的药物，得到纯化后肺靶向载药外泌体。
本发明的第二个目的是要提供肺靶向载药外泌体在治疗肺部疾病药物制备中的应用。
本发明的第三个目的是要提供一种治疗肺部疾病药物，包含上述肺靶向载药外泌体。
与现有技术相比，本发明使用结直肠细胞分泌的外泌体不需要作任何修饰就可以在肺部富集，用结直肠细胞来源的外泌体，解决了外泌体产量的问题，具有很好的应用前景；而且用结直肠细胞来源的外泌体可以装载不同药物或活性分子，通过靶向肺组织给药，提高肺部疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。
附图说明
图1为正常人结直肠组织上皮细胞FHC分泌的外泌体标志性蛋白检测图。
图2为正常人结直肠组织上皮细胞FHC分泌的外泌体粒径分布检测图。
图3为PKH67标记结直肠细胞外泌体在不同组织中分布图。
图4为载有用于治疗肺部疾病的药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体抗肿瘤活性体外检测图。
图5为载有用于治疗肺部疾病的药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体抗肿瘤活性体内检测图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
收集正常人结直肠组织上皮细胞FHC(本实施例以正常人结直肠组织上皮细胞FHC为例)。取正常人结直肠组织上皮细胞FHC的培养液(结直肠细胞培养液为无外泌体血清和DMEM培养基进行培养的)在2000g离心力下离心10min，取上清液；再在10000g离心力下离心30min，取上清液，弃去细胞碎片及沉淀物；将离心后的细胞培养液在100000g(g为重力加速度)离心力下离心2h，沉淀用无菌PBS重悬收集，4℃短期保存，即得肺靶向外泌体。提取分离所得的肺靶向外泌体表面标记蛋白及粒径分布如图1、图2所示。对结直肠细胞分泌的外泌体表达量进行测定，BCA法检测结直肠细胞分泌的外泌体蛋白浓度为(2.46μg/μL)。
实施例2
取正常人结直肠组织上皮细胞FHC分泌的外泌体，用PKH67染色，对结直肠细胞分泌的外泌体在体内的分布进行示踪，具体步骤如下：
取100μg的结直肠细胞分泌的外泌体，与1μL PKH67 4℃避光孵育过夜，在100000g(g为重力加速度)离心力下离心2h，弃掉上清，用PBS清洗两次后，无菌PBS重悬结直肠细胞分泌的外泌体，经尾静脉注射入C57bl/6小鼠体内，需要说明的是：本实施例中，雄性C57bl/6(4-6周)小鼠(4-6周)购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于SPF级设施；24h后，麻醉小鼠，取小鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏、胃和肠做冰冻切片，Hoechst33342染细胞核后，观察结直肠细胞分泌的外泌体在小鼠各个器官的生物分布。结果显示：本实施例的结直肠细胞分泌的外泌体在肺组织中出现明显富集(图3)，肺靶向效率可高达65％-90％；而在其他组织中未出现富集，说明本实施例制备的肺靶向外泌体具有肺组织靶向性。
实施例3
本实施例中，选用用于治疗肺部疾病的药物siRNA-survivin进行示例性说明，siRNA-survivin序列为：5’-GAAUUUGAGGAAACUGCGATT-3’
5’-UCGCAGUUUCCUCAAAUUCTT-3’合成于上海吉玛公司。
本实施例是将用于治疗肺部疾病的药物导入到肺靶向外泌体制备肺部肿瘤靶向治疗药物，具体操作如下：
1)取150μg肺靶向外泌体与带有荧光的siRNA-survivin混合，电转缓冲液可以为(PBS、DMEM、Cytomix、Tris-HCl)将其补足至150μL，转移至不同规格(0.2cm、0.4cm)电转杯中。采用不同波形(指数波、方形波)，使用不同的电压(50V，100V，200V，300V)分别对肺靶向外泌体及siRNA-survivin进行电转；
2)将电转产物于100000g离心力下超速离心120min，收集上清测载药量。载药量为(OD总siRNA-OD电击组siRNA)/OD总siRNA。
结果：对于siRNA-survivin，150μg肺靶向外泌体与150pmol siRNA-survivin在250V的电压下进行电转，效率最高，可达25.7％。酶标仪荧光结果显示：siRNA-survivin成功载入了肺靶向外泌体中。
实施例4
本实施例通过体内外实验进一步验证载有用于治疗肺部疾病的药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体对肺癌的治疗作用，本实施例中，Balb/c nude小鼠(4-6周)购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于SPF级设施。具体步骤如下：
体外实验：
将A549肺癌细胞铺于96孔板中，每孔5×103个细胞，分别加入肺靶向外泌体(对照组)、载有肺部肿瘤治疗药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体，MTT检测载有肺部肿瘤治疗药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体对肺癌细胞的杀伤作用。在体外实验中，载有肺部肿瘤治疗药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体相较于单纯的肺靶向外泌体可以有效的杀伤肿瘤细胞，其结果如图4所示。
体内实验：
在体内实验中，建立肺癌模型，将5×106个A549细胞注射至Balb/c nude小鼠皮下，待其生长到约100mm3时，尾静脉注射载有肺部肿瘤治疗药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体，每3天注射一次，共注射4次，随后隔天测量肿瘤体积，肿瘤体积＝1/2×a×b2。a代表长径，b代表短径。
在体内实验中，如图5所示，载有肺部肿瘤治疗药物siRNA-survivin的肺靶向外泌体(外泌体包载siRAN-survivin)，较等剂量的游离抗肿瘤药物组(siRAN-survivin)可显著降低小鼠的肿瘤大小。
对于本领域技术人员而言，显然本发明实施例不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明实施例的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明实施例。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明实施例的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明实施例内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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