一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法
阅读说明：本技术 一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法 (Preparation method of hydrogel dressing capable of quickly gelling and slowly reinforcing after injection ) 是由 杨晋涛 袁静锋 郑司雨 张冬 于 2021-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及水凝胶材料领域,公开了一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法,包括：1)利用醛基化改性剂对多糖大分子进行改性,得到醛基化改性多糖大分子；2)将甲基丙烯酸磺酸甜菜碱和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚制得含有环氧基团的亲水性共聚物；3)将壳聚糖溶液、含醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物的混合溶液在混合的同时进行注射,得到水凝胶敷料。本发明成胶方式在室温或37℃下均可实现快速成胶,且在后期还可利用氨基和环氧基团的缓慢交联来增强网络,弥补了可注射水凝胶本身强度不足的缺点。此外,本发明水凝胶还具有降解时间可调,可自愈合,安全无毒的特点,可有效促进伤口愈合以及骨修复。(The invention relates to the field of hydrogel materials, and discloses a preparation method of a hydrogel dressing capable of quickly gelling and slowly reinforcing after injection, which comprises the following steps: 1) modifying polysaccharide macromolecules by using an aldehyde modifying agent to obtain aldehyde modified polysaccharide macromolecules; 2) copolymerizing sulfobetaine methacrylate and glycidyl methacrylate to prepare a hydrophilic copolymer containing an epoxy group; 3) and (3) mixing the chitosan solution, the mixed solution containing the aldehyde modified polysaccharide macromolecules and the hydrophilic copolymer containing the epoxy group, and injecting to obtain the hydrogel dressing. The gel forming mode of the invention can realize quick gel forming at room temperature or 37 ℃, and the slow crosslinking of amino and epoxy groups can be used for reinforcing the network at the later stage, thus overcoming the defect of insufficient strength of the injectable hydrogel. In addition, the hydrogel disclosed by the invention has the characteristics of adjustable degradation time, self-healing, safety and no toxicity, and can effectively promote wound healing and bone repair.)
技术领域
本发明涉及水凝胶材料领域，尤其涉及一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法。
背景技术
在日常生活过程中，由于各种情况导致的组织损伤时有发生，如不小心的运动擦伤，尖物划伤，又或是术后留有的伤口等。本身外组织是重要的天然屏障，保护着内部组织的正常运作。当外组织受损时，伤口处容易出现出血、感染或是炎症等反应，大大影响了伤口的愈合效率，甚至造成更严重的并发症。因此，敷料能够在伤口处形成一层后天的屏障，及时充当外组织的作用，来抵御细菌或是病毒的侵害。
目前，已有形形色色的材料来作为伤口敷料，比如多孔泡沫，电纺纤维，水凝胶材料，生物膜等等。由于敷料是在外组织出现损伤时代替那部分受伤组织来达到止血和抵御外界污染的目的，那么尽可能地去模仿外组织的环境对于伤口的愈合无疑是有利的。其中，生物相容性水凝胶敷料由于本身具有的生物相容性、多孔结构以及润湿性能，可以很好地模拟组织环境。在充当屏障作用的同时，提供了很好的透气性和润湿性。
目前，基于水凝胶伤口敷料的相关研究正在不断推进。作为伤口敷料，水凝胶需要应对伤口愈合过程中的止血，炎症，增殖和重塑这四个过程。本身水凝胶的多孔结构和润湿性可以为伤口提供一个良好的愈合环境。在此基础上，通过功能的选择和结构的设计，可以赋予水凝胶更多的性能去协助对于伤口的包覆和愈合。目前最为常见的是块状水凝胶，它们通过预先制备好水凝胶的方式，再以贴剂的形式覆盖在伤口上。然而对于这种块状凝胶，它在使用上比较方便，但是缺点也很明显。它只能用在比较常见的平整的表皮伤口上，对于那些不规则的伤口，或是狭缝处的伤口，它的应用就会受限。以牙齿颌骨部位的骨缺损为例，本身口腔内的环境就小而复杂，因此对于术后颌骨部位的骨缺损，需要合适的材料去对伤口进行填充和修复。相较之下，可注射水凝胶由于其优异的可注射性能和快速成胶的方式更适合各种情况下伤口的修复。
但是，目前的可注射水凝胶敷料也面临着一系列的问题：1）水凝胶的成胶条件要尽可能地去符合生物体的环境；2）水凝胶敷料多功能性实现的同时需要满足良好的生物相容性；3）可注射水凝胶可以达到快速填充不规则伤口并迅速成胶的目的，但是一般的可注射凝胶较弱，力学性能较差（拉伸和压缩）；4）水凝胶不可降解或者降解时间不可控。因此，为了解决上述问题，制备出能够适用于各种情况伤口的可注射多功能水凝胶敷料仍然是个巨大的挑战。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法。本发明方法先制备醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物，再将上述两者的混合溶液与壳聚糖溶液在混合的同时注射，利用席夫碱反应可快速形成水凝胶网络——在室温或者37℃下均可实现在30s内快速成胶，且在后期还可利用氨基和环氧基团的缓慢交联来增强网络，不仅弥补了可注射水凝胶本身强度不足的缺点，并且还能够给予伤口边沿组织一定的缓冲时间，以去缓慢适应水凝胶的填充和包覆，防止由于填充物的突然完全固化导致的对于周围组织的挤压与二次损伤。此外，本发明水凝胶还具有降解时间可调，可自愈合，对伤口安全无毒的特点，可有效促进伤口愈合以及骨修复。
本发明的具体技术方案为：一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
1）醛基化改性多糖大分子的制备：在避光条件下，将醛基化改性剂水溶液滴加至搅拌中的多糖大分子水溶液中，滴加完毕后继续避光反应，然后加入过量的乙二醇以猝灭反应；将所得悬浮液抽滤，对所得截留物进行透析，冷冻干燥后保存，得到醛基化改性多糖大分子。
2）含有环氧基团的亲水性共聚物的制备：将两性离子单体甲基丙烯酸磺酸甜菜碱和带有环氧基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯在引发剂作用下共聚反应，经透析、冷冻干燥后制得含有环氧基团的亲水性共聚物。
3）以壳聚糖溶液为A组分，以醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物的混合溶液作为B组分，将A组分与B组分在混合的同时进行注射，利用席夫碱反应快速形成水凝胶网络，再通过氨基和环氧基团的反应缓慢增强，最终得到水凝胶敷料。
作为优选，步骤1）中，所述多糖大分子为纤维素纳米晶、葡聚糖或透明质酸；所述醛基化改性剂为高碘酸钠。
作为优选，步骤1）中，所述多糖大分子与醛基化改性剂的质量比范围为3：（1-2）。
作为优选，步骤1）中，所述避光反应温度为室温，时间为20-30h。
作为优选，步骤1）中，透析的截留分子量为3000-4000Da，透析时间为2-4天。
作为优选，步骤2）中，所述两性离子单体甲基丙烯酸磺酸甜菜碱和带有环氧基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯的质量比范围为（2-10）：1。
作为优选，步骤2）中，反应温度为50-70℃，反应时间为4-8h。
作为优选，步骤2）中，透析的截留分子量为3000-4000Da，透析时间为2-4天。
作为优选，步骤3）中，所述A组分为含有壳聚糖的磷酸缓冲盐溶液，所述B组分为含有醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物的磷酸缓冲盐溶液；注射时，壳聚糖、醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物的质量比范围为2：（1-2）：（1-2）。
作为优选，步骤3）中，通过双注射头注射。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1）本发明方法利用席夫碱反应快速成胶，该成胶方式在室温或者37℃（符合生物体环境）下均可实现在30s内快速成胶。与现有的其他成胶方式相比，不仅成胶迅速，还可以及时保护伤口，同时不需要外加条件去促成反应，不会对组织造成影响。
2）本发明方法在先利用席夫碱反应快速成胶后，在后期还可利用氨基和环氧基团的缓慢交联来增强网络，不仅弥补了可注射水凝胶本身强度不足的缺点，并且该缓慢固化增强的特点，还能够给予伤口边沿组织一定的缓冲时间，以去缓慢适应水凝胶的填充和包覆，防止由于填充物的突然完全固化导致的对于周围组织的挤压与二次损伤。
3）本发明方法引入了poly(SBMA-co-GMA)亲水性共聚物链，在提供防污性能防止细菌附着的同时，通过调整第二交联网络的交联密度，可以有效调控水凝胶的降解时间，以应对不同伤口的愈合时间上的差异。
4）本发明方法制得的水凝胶敷料用的主要是生物大分子材料，对于伤口安全无毒，可以有效促进伤口愈合以及骨修复。
附图说明
图1为本发明制备方法的反应流程示意图；
图2为实施例1所制备的水凝胶敷料的拉伸性能随反应成胶时间的变化图；
图3为实施例1所制备的水凝胶敷料在酶和PBS环境中的降解性能图；
图4为实施例1所制备的水凝胶敷料的自修复性能图；
图5为实施例1所制备的水凝胶敷料对大鼠颌骨修复的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种注射后可快速成胶并缓慢增强的水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
1）醛基化改性多糖大分子的制备：在避光条件下，将醛基化改性剂高碘酸钠水溶液滴加至搅拌中的多糖大分子（纤维素纳米晶、葡聚糖或透明质）水溶液中，多糖大分子与醛基化改性剂的质量比范围为3：（1-2），滴加完毕后继续室温避光反应20-30h，然后加入过量的乙二醇以猝灭反应；将所得悬浮液抽滤，对所得截留物透析（截留分子量为3000-4000Da）2-4天，冷冻干燥后保存，得到醛基化改性多糖大分子。
2）含有环氧基团的亲水性共聚物的制备：将质量比范围为（2-10）：1的两性离子单体甲基丙烯酸磺酸甜菜碱和带有环氧基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯在引发剂作用下50-70℃共聚反应4-8h，经透析（截留分子量为3000-4000Da）2-4天、冷冻干燥后制得含有环氧基团的亲水性共聚物。
3）以壳聚糖PBS溶液为A组分，以醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物的混合PBS溶液作为B组分，将A组分与B组分在混合的同时进行注射，利用席夫碱反应快速形成水凝胶网络，再通过氨基和环氧基团的反应缓慢增强，最终得到水凝胶敷料。其中，壳聚糖、醛基化改性多糖大分子和含有环氧基团的亲水性共聚物的质量比范围为2：（1-2）：（1-2）
实施例1
将1g纤维素纳米晶（CNC）加入到250mL圆底烧瓶中，用50mL去离子水充分搅拌溶解并用铝箔纸包裹。将0.44g高碘酸钠溶解在50mL去离子水中，在室温下边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢滴加高碘酸钠溶液，滴加完后保持室温下避光反应24h，然后加入过量乙二醇并继续反应2h进行猝灭。结束后把得到的悬浮液进行抽滤，把截留下来的物质放入3500分子量透析袋中透析72h。把透析后的产物冻干保存，得到醛基化改性的纤维素纳米晶（DACNC）。
将3.32g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱（SBMA）、78μL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入到50mL圆底烧瓶中，用20mL溶剂溶解（去离子水：甲醇=1:1），并在N2气氛下搅拌10min。然后加入0.034g过硫酸钾并在N2氛围下搅拌15min。然后撤去N2并升温至60℃，反应6h后把得到的聚合物用3500分子量透析袋透析72h。将透析后的产物进行冻干并保存，得到干燥的poly(SBMA-co-GMA)。
将100mg的CS溶解在1mL的PBS溶液中，作为A组分；将50mg的poly(SBMA-co-GMA)共聚物溶解在1ml的PBS溶液中，再加入100mg的DACNC并均匀分散，作为B组分。利用双注射头，将A，B组分在混合的同时进行注射，水凝胶预聚液会在注射后30s内成胶并将伤口封闭。
实施例2
将1g透明质酸（HA）加入到250mL圆底烧瓶中，用100mL去离子水充分搅拌溶解并用铝箔纸包裹。将0.44g高碘酸钠溶解在20mL去离子水中，在室温下边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢滴加高碘酸钠溶液，滴加完后保持室温下避光反应24h，然后加入过量乙二醇并继续反应2h进行猝灭。结束后倒入3500分子量透析袋中透析72h。把透析后的产物冻干保存，得到醛基化改性的透明质酸（OHA）。
将3.32g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱（SBMA）、78μL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入到50mL圆底烧瓶中，用20mL溶剂溶解（去离子水：甲醇=1:1），并在N2气氛下搅拌10min。然后加入0.034g过硫酸钾并在N2氛围下搅拌15min。然后撤去N2并升温至60℃，反应6h后把得到的聚合物用3500分子量透析袋透析72h。将透析后的产物进行冻干并保存，得到干燥的poly(SBMA-co-GMA)。
将100mgCS溶解在1mL的PBS溶液中，作为A组分；将50mg的poly(SBMA-co-GMA)共聚物溶解在1ml的PBS溶液中，再加入100mg的OHA并均匀分散，作为B组分。利用双注射头，将A，B组分在混合的同时进行注射，水凝胶预聚液会在注射后30s内成胶并将伤口封闭。
实施例3
将1g葡聚糖（Dex）加入到50mL圆底烧瓶中，用10mL去离子水充分搅拌溶解并用铝箔纸包裹。将0.44g高碘酸钠溶解在10mL去离子水中，在室温下边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢滴加高碘酸钠溶液，滴加完后保持室温下避光反应24h，然后加入过量乙二醇并继续反应2h进行猝灭。结束后倒入3500分子量透析袋中透析72h。把透析后的产物冻干保存，得到醛基化改性的葡聚糖（ODex）。
将3.32g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱（SBMA）、78μL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入到50mL圆底烧瓶中，用20mL溶剂溶解（去离子水：甲醇=1:1），并在N2气氛下搅拌10min。然后加入0.034g过硫酸钾并在N2氛围下搅拌15min。然后撤去N2并升温至60℃，反应6h后把得到的聚合物用3500分子量透析袋透析72h。将透析后的产物进行冻干并保存，得到干燥的poly(SBMA-co-GMA)。
将100mgCS溶解在1mL的PBS溶液中，作为A组分；将50mg的poly(SBMA-co-GMA)共聚物溶解在1ml的PBS溶液中，再加入100mg的ODex并均匀分散，作为B组分。利用双注射头，将A，B组分在混合的同时进行注射，水凝胶预聚液会在注射后30s内成胶并将伤口封闭。
实施例4
将1g纤维素纳米晶（CNC）加入到250mL圆底烧瓶中，用50mL去离子水充分搅拌溶解并用铝箔纸包裹。将0.44g高碘酸钠溶解在50mL去离子水中，在室温下边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢滴加高碘酸钠溶液，滴加完后保持室温下避光反应24h，然后加入过量乙二醇并继续反应2h进行猝灭。结束后把得到的悬浮液进行抽滤，把截留下来的物质放入3500分子量透析袋中透析72h。把透析后的产物冻干保存，得到醛基化改性的纤维素纳米晶（DACNC）。
将4.47g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱（SBMA）、529μL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)加入到50mL圆底烧瓶中，用20mL溶剂溶解（去离子水：甲醇=1:1），并在N2气氛下搅拌10min。然后加入0.054g过硫酸钾并在N2氛围下搅拌15min。然后撤去N2并升温至60℃，反应6h后把得到的聚合物用3500分子量透析袋透析72h。将透析后的产物进行冻干并保存，得到干燥的poly(SBMA-co-GMA)。
将100mgCS溶解在1mL的PBS溶液中，作为A组分；将50mg的poly(SBMA-co-GMA)共聚物溶解在1ml的PBS溶液中，再加入100mg的DACNC并均匀分散，作为B组分。利用双注射头，将A，B组分在混合的同时进行注射，水凝胶预聚液会在注射后30s内成胶并将伤口封闭。
性能测试
试验例：以实施例1所得的水凝胶敷料作试验材料。
如图2所示为所制备的水凝胶敷料的拉伸性能随反应成胶时间（0.25-48h）的变化趋势；该趋势证实了本发明的水凝胶敷料在注射后的一定时间内强度会缓慢增强。该现象的产生主要是由于水凝胶中的氨基和环氧基可在该温度下缓慢交联。该注射后缓慢增强的特点，不仅弥补了可注射水凝胶本身强度不足的缺点，并且该缓慢固化增强的特点，还能够给予伤口边沿组织一定的缓冲时间，以去缓慢适应水凝胶的填充和包覆，防止由于填充物的突然完全固化导致的对于周围组织的挤压与二次损伤。
由于颌骨处伤口的愈合时间在2周左右，对实施例1所制备的水凝胶敷料的降解性能进行了测试，结果如图3所示，相较于在PBS中，水凝胶在酶的作用下的降解速率更快，在16天后的降解达到了50%以上，与颌骨处伤口的愈合时间基本吻合。
由于颌骨总是处于运动之中，因此作为伤口敷料的DACNC-CS-PSG水凝胶在使用过程中会受到挤压和剪切力的作用而破损。但是由于席夫碱键是一种可逆共价键，可以实现水凝胶的自修复。如图4所示，对实施例1所制备的水凝胶的自修复性能进行了测试，发现水凝胶在对半切开后仍然可以拼合，甚至可以将圆形缺口自动修复完整，说明水凝胶拥有很好的自修复能力。
通过大鼠颌骨修复实验评估了实施例1制备的水凝胶的促进骨修复的能力。在大鼠颌骨处制造了一个3mm×2mm×1mm的缺损。实验组大鼠的伤口处注入了DACNC-CS-PSG水凝胶，对照组大鼠不注射水凝胶。一周后观察伤口情况并拍摄CT。结果如图5所示，相较于对照组，实施例1制备的水凝胶具有促进骨修复的能力。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。