一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of coreopsis glabra extract ) 是由 张颖 李嘉 巫凯 杨海船 张赟赟 陈锋 何春欢 于 2021-01-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用,属于医药技术领域。本发明公开的一种光茎栓果菊提取物在制备治疗肺癌药物中的应用,首次将光茎栓果菊提取物用于制备抗肺癌药物,为中药提取物抗肺癌作用的研究与开发提供了新的思路。(The invention discloses a preparation method and application of a coreopsis glabra extract, and belongs to the technical field of medicines. The application of the echinacea phoma extract in preparing the medicine for treating lung cancer disclosed by the invention is to use the echinacea phoma extract in preparing the anti-lung cancer medicine for the first time, and provide a new thought for the research and development of the anti-lung cancer effect of the traditional Chinese medicine extract.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用。
背景技术
肺癌是目前发病率较高的恶性肿瘤，随着环境污染的加重，肺癌的发病率和死亡率还在呈明显上升的趋势，严重威胁人民的生命健康。目前，临床治疗肺癌的主要方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗以及免疫治疗等。虽然这些技术在延长病人生存期、减少病人痛苦、提高病人生存质量方面做出巨大贡献，但是也存在一定的局限性。中医药在治疗肿瘤方面已经取得了相当大的成就，尤其是开发中草药中的抗癌有效组分。
光茎栓果菊Launaea acaulis为菊科栓果菊属植物，又称土蒲公英、滑背草鞋，主要分布于广西、广东、贵州、云南等地。全草或根入药，具有清热解毒，利尿之功效。用于痈疽疔疮，尿路感染。但是光茎栓果菊的化学成分、药理作用研究等仍处于空白，且药效物质基础不明确，不能指导其临床使用。
因此，提供一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用，光茎栓果菊提取物用于制备治疗肺癌的药物，副作用较少，且具有较好的临床疗效，具有多方位、多靶点的特点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种光茎栓果菊提取物在制备治疗肺癌药物中的应用。
进一步，所述光茎栓果菊提取物的制备方法如下：
(1)将光茎栓果菊药材干燥粉碎，以料液比1:8的比例加入体积百分浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，每次2h；滤过，滤液回收乙醇至无醇味，浓缩得乙醇提取物I；
(2)将乙醇提取物I加水制成混悬液，采用等体积的石油醚萃取，弃去石油醚液，剩余部分为提取物II；
(3)将提取物II用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩成膏，得光茎栓果菊提取物。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种光茎栓果菊提取物的制备方法及其应用，为研究开发治疗肺癌的高效低毒的新药物奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明不同浓度的光茎栓果菊提取物作用后不同细胞形态变化；其中，A：空白对照，DMSO终浓度为0.1％；B：阳性对照药，终浓度为1μΜ；C：提取物终浓度为5μg/ml；D：提取物终浓度为10μg/ml；E：提取物终浓度为20μg/ml。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种光茎栓果菊提取物的制备方法，具体步骤如下：
光茎栓果菊药材干燥，粉碎后以料液比1:8的质量体积(kg/L)比加入体积百分浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，浓缩得乙醇提取物I；
将乙醇提取物I加水制成混悬液，采用等体积的石油醚萃取，弃去石油醚液，剩余部分为提取物II；
将提取物II用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩成膏，得光茎栓果菊提取物。
实施例2
(1)MTS法检测肺腺癌A549细胞活性
①接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)将肺腺癌A549细胞配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，细胞提前12～24h接种培养。
②加入提取物溶液：提取物用DMSO溶解，以100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml终浓度复筛，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。
③显色：37℃培养48h后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μl和含10％胎牛血清的培养液100μl；悬浮细胞弃100μl培养上清液，每孔加20μl的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μl和培养液100μl的混合液)，继续孵育2～4h，使反应充分进行后测定光吸收值。
④比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算提取物的IC50值。
阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC50值。
分别以0.16μg/ml、0.8μg/ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml的光茎栓果菊提取物对肺腺癌A549细胞作用48h后，采用MTS法检测肺腺癌A549细胞的存活率，结果见表1。
表1光茎栓果菊提取物对A549细胞活性抑制结果
表1结果表明，光茎栓果菊提取物抑制肺腺癌A549细胞活性与浓度相关，光茎栓果菊提取物半数致死量浓度(IC50)约为11.75μg/ml。
(2)MTS法检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B活性
采用MTS法检测光茎栓果菊提取物对人正常肺上皮细胞BEAS-2B活性抑制，计算提取物的IC50值。过程同步骤(1)。
分别以0.16μg/ml、0.8μg/ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml的光茎栓果菊提取物对人正常肺上皮细胞BEAS-2B作用48h后，采用MTS法检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B的存活率，结果见表2。
表2光茎栓果菊提取物对人正常肺上皮细胞BEAS-2B活性抑制结果
表2结果表明，光茎栓果菊提取物浓度小于20μg/ml时，对人正常肺上皮细胞BEAS-2B活性没有明显的抑制作用，光茎栓果菊提取物半数致死量浓度(IC50)约为66.54μg/ml。
(3)通过AnnexinV-PE/7-AAD检测细胞死亡方式
①取对数生长期的细胞A549(肺腺癌细胞)，以每孔3*105个细胞接种到6孔板，每孔体积2ml，细胞提前24h接种到含10％胎牛血清的培养液中培养。
②24h后加入提取物，提取物(DMSO溶解)终浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml；以阿霉素(Doxorubicin)为阳性对照药，终浓度为1μΜ；以DMSO为空白对照，终浓度为0.1％。
③24h后收集细胞，300g离心5min，弃上清，用预冷的PBS重悬，300g离心洗涤2次。
④加入100μl 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞。
⑤单染管分别加入5μl PE Annexin V或5μl 7-AAD，样本管加入5μl PE AnnexinV和5μl 7-AAD，轻轻混匀，室温避光孵育15min。
Annexin V-PE/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，购自BD Pharmingen；
⑥在1h内进行流式细胞仪检测，检测时，用空白管调节FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿并依次收集实验组的数据。结果见图1。
分别以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的光茎栓果菊提取物预先处理A549细胞，然后经Annexin V-PE/7-AAD双染色法染色，最后流式细胞学结果为：活细胞，即PE Annexin V阴性/7-AAD阴性的数量明显下降(P<0.001)；凋亡细胞(PE Annexin V阳性/7-AAD阴性)未见明显变化(P＝0.1780)；但表现为PE AnnexinV阳性/7-AAD阳性和PE Annexin V阴性/7-AAD阳性的坏死细胞数量较阳性对照药明显增加(P<0.001)。
从对照组的数据分析看，机械损伤的比例几乎为零，所以推断光茎栓果菊提取物具有导致肺癌细胞A549坏死的作用。光茎栓果菊提取物以坏死的方式诱导A549细胞死亡。
综上所述，光茎栓果菊提取物给药浓度为20μg/mL时，与阳性对照组比较，可致肺腺癌细胞A549坏死约71.0％，而对人正常肺上皮细胞BEAS-2B活性影响不大。所以推断光茎栓果菊提取物以坏死的方式诱导A549细胞死亡。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。