一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法
阅读说明：本技术 一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法 (Preparation method of temperature-magnetic field cooperative response drug release calcium phosphate-based bone cement ) 是由 汤玉斐 魏敏 吴子祥 赵康 陈磊 周璇 朴钰 朱馨雨 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法,首先制备改性的Fe-3O-4粒子,并在表面形成负载药物的SiO-2涂层；在Fe-3O-4@SiO-2微球表面形成聚电解质壳层,液蚀刻SiO-2层后形成温度-磁场双响应微胶囊；再包覆P(NIPAM-AA)温敏水凝胶层,最后将P(NIPAM-AA)包覆的温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合,再与固化液混合,加入过氧化氢调和液造孔,即可。本发明的磷酸钙基骨水泥,当出现轻微炎症时,可以自主缓慢释药,当炎症加重时,可以自主加速释药同时也可以人工控制磁场响应药物；磁场消失,药物释放速度减慢；炎症消失,药物停止释放,且可以进行多次响应释药。(The invention discloses a preparation method of calcium phosphate-based bone cement with temperature-magnetic field cooperative response drug release, which comprises the steps of firstly preparing modified Fe 3 O 4 Particles and forming SiO loaded with medicine on the surface 2 Coating; in Fe 3 O 4 @SiO 2 Forming polyelectrolyte shell on the surface of microsphere, liquid etching SiO 2 Forming a temperature-magnetic field double-response microcapsule after layering; coating P (NIPAM-AA) temperature sensitive hydrogel layer, and finally coating P (N)IPAM-AA) coated temperature-magnetic field dual-response microcapsules are mixed with a calcium phosphate bone cement solid phase, then mixed with a curing liquid, and added with a hydrogen peroxide blending liquid to form pores. When slight inflammation occurs, the calcium phosphate-based bone cement can release drugs autonomously and slowly, and when the inflammation is aggravated, the calcium phosphate-based bone cement can release drugs autonomously and quickly and can also control magnetic field response drugs manually; the magnetic field disappears, and the drug release speed is reduced; the inflammation disappears, the medicine stops releasing, and the medicine can be released in multiple responses.)
技术领域
本发明属于生物医用材料制备技术领域，具体涉及一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法。
背景技术
骨植入物在局部可因免疫抑制作用形成纤维炎症区，局部体温会随着环境条件和疾病的变化而变化，轻微炎症局部温度升高至37～38℃，重症炎症局部温度升高至38～39℃。载药磷酸钙骨水泥(CPC)作为骨植入物是目前用于手术部位局部给药研究的趋势。目前对于载药CPC的研究主要集中在药物缓释体系，药物缓释体系对于植入人体一段时间后才产生的感染或炎症无法起到及时治疗效果，且不能完全解决植入体抵抗不同程度炎症的情况。因此开发一种轻炎症时可以自主缓释药物、重炎症时可以自主加速和人为调控、且能多次响应释药的骨水泥是目前该领域的研究重点之一。
中国专利《载纳米银/黄连素缓释涂层的磷酸钙陶瓷材料及制备方法》(申请号：CN109550078A，公开号：109550078A)公开了一种载纳米银/黄连素缓释涂层的磷酸钙陶瓷材料及制备方法，它由磷酸钙陶瓷及负载在磷酸钙陶瓷表面的纳米银/黄连素复合缓释涂层构成。将黄连素与纳米银颗粒的抗菌效果相结合，充分发挥黄连素促进细胞成骨分化的潜在性作用，黄连素与纳米银存在协同抗菌作用，但该方法在不同炎症时无法自主释药。
中国专利《药物微囊复合缺钙磷酸钙骨水泥及使用、制备方法和应用》(申请号：CN101905033A，公开号：101905033B)公开了药物微囊复合缺钙磷酸钙骨水泥及使用、制备方法和应用。该骨水泥使用方法为将药物微囊复合缺钙磷酸钙骨水泥与固化液生理盐水或其它盐溶液均匀混合即可植入体内。该骨水泥植入人体固化后，药物通过固化体的微观结构实现缓释；但是该方法无法在植入体发生炎症时实现精准释药。
中国专利《智能化控释载药骨水泥及其制备方法和应用》(申请号：CN111729131A，公开号：111729131A)提供了一种智能化控释载药骨水泥及其制备方法和应用，载药骨水泥包括粉剂和液剂；粉剂和液剂的液固比为1ml：2-2.2g。通过加入空心聚多巴胺纳米粒子/抗生素载药微球不仅载药量高且稳定，防止药物过早释放，且该微球本身具有pH响应性，能够根据pH变化控释药物，但是无法控制轻微炎症和重症炎症时药物释放量，且无法实现多次响应释药。
中国专利《明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法》(申请号：CN200910068886.2，公开号：CN101564556A)公开了一种明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，通过控制植物油的温度和搅拌时间获得不同粒径的明胶微球，根据明胶微球的降解速率不同来设计包封药物种类，从而实现不同药物释放；但无法根据炎症情况实现自主释药，且无法多次响应释药。
中国专利《一种释药磷酸钙基骨水泥的制备方法》(申请号：CN202010391218.X，公开号：CN 111632191 A)公开了一种温度响应释药磷酸钙基骨水泥，利用相变材料在39℃时会溶解的特性，在炎症发生时局部温度上升至39℃时，相变材料会溶解从而将抗生素释放，抗生素则通过网络进入炎症部位进行消炎；介孔二氧化硅中骨代谢调节剂能通过介孔缓慢释放促进骨长入；在炎症发生时抗生素能自主释放进行消炎。但是响应温度在重症炎症的39℃，无法实现低炎症时的自主释药。
因此，开发一种轻炎症时可以自主缓释药物、重炎症时可以自主加速和人为调控、且能多次响应释药的骨水泥是目前该领域的研究重点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥，解决了现有骨水泥在轻微炎症时无法自主释药、重症炎症时无法加速释药且不能多次响应释药的问题。
本发明所采用的技术方案是：一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备PEG(聚乙二醇)改性的Fe3O4粒子；
步骤2，利用PEG改性的Fe3O4粒子制备Fe3O4@SiO2微球；
步骤3，将Fe3O4@SiO2微球加入去离子水中，加入药物，搅拌，真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
步骤4，将载药Fe3O4@SiO2微球分散在PU(聚氨酯)水溶液中，超声处理用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球，吸附过程重复3-10次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
步骤5，将载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液中，搅拌，干燥，得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
步骤6，向载药温度-磁场双响应微胶囊中加入PNIPAM和AA的混合单体，之后再加入MBA溶液，搅拌，加入引发剂，搅拌30～120s，室温下静止放置6～24h；洗涤，干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
步骤7，将P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
步骤8，将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和固化液搅拌，再加入过氧化氢调和液，搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
本发明的特点还在于，
步骤1中，具体为：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇与水的质量比为1：1；Fe3O4粒子与PEG水溶液固液比为1：100～300g/ml；PEG水溶液的质量分数为2～8％；搅拌时间为12～36h；PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为100～500nm。
步骤2中，具体为：将PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中，搅拌，沉淀CTAB、SiO2和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除CTAB和正己烷，洗涤，得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1：3～5g/ml；混合溶液A包含质量百分比为2.5～4.5％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.7～1.9％的CTAB和质量百分比为0.6～0.8％的正己烷；Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为30～70nm。
步骤3中，药物为抗生素类药物；药物的载药率为30～50％；抗生素类药物为庆大霉素、盐酸万古霉素、硫酸妥布霉素、环丙沙星盐酸盐、萘夫西林、利奈唑胺、头孢曲松、三水合氨苄青霉素、阿莫西林中的任意一种；搅拌时间为6～48h。
步骤4中，载药Fe3O4@SiO2微球与PU水溶液的固液比为：1：45～60g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1：45～60g/ml；PU水溶液的质量分数为1.5～3.5％；磷脂水溶液的质量分数为1.5～3.5％；超声处理的时间均为3～6min。
步骤5中，载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1：10～17g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为20～60％；载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为130～600nm。
步骤6中，PNIPAM和AA质量比为92∶8；MBA溶液中MBA占混合单体的质量百分比为5～10％；引发剂占总混合单体的质量百分比为0.5～2％；引发剂为四甲基乙二胺、过硫酸铵、偶氮二异丁腈中的任意一种。
步骤7中，P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为5～50％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为50～95％，以上各组份的质量百分比总和为100％；磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为40～60％的磷酸四钙和质量百分比为40～60％的碳酸氢钙组成。
步骤8中，固化液为蒸馏水、血液、生理盐水、稀酸、血清、磷酸盐溶液中的任意一种；磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1∶0.3～2.5g/ml；过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的6～10％；搅拌时间为5～30min。
本发明的有益效果是：
本发明方法制备的温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥，当出现轻微炎症时，可以实现自主缓慢释药，当炎症加重时，可以进一步自主加速释药同时也可以人工控制磁场响应药物；磁场消失，药物释放速度减慢；炎症消失，药物停止释放，且可以进行多次响应释药，同时，本发明制备的磷酸钙基骨水泥比传统磷酸钙骨水泥具有更好的力学性能，在临床上具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备改性Fe3O4粒子：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇与水的质量比为1∶1；Fe3O4粒子与聚乙二醇(PEG)水溶液固液比为：1∶100～300g/ml；PEG水溶液的质量分数为2～8％；搅拌时间为12～36h；
PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为100～500nm；
步骤2，制备Fe3O4@SiO2微球：将步骤1中PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中进行搅拌，沉淀十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二氧化硅(SiO2)和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正己烷，随后用乙醇洗涤，得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1∶3～5g/ml；混合溶液A包含质量百分比为2.5～4.5％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.7～1.9％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和质量百分比为0.6～0.8％的正己烷；
制备的Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为30～70nm；
步骤3，制备载药Fe3O4@SiO2微球：将步骤2制备的Fe3O4@SiO2微球加入去离子水中，再加入药物，搅拌6～48h，随后在常温下真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
药物为抗生素类药物；药物的载药率为30～50％；
抗生素类药物为庆大霉素、盐酸万古霉素、硫酸妥布霉素、环丙沙星盐酸盐、萘夫西林、利奈唑胺、头孢曲松、三水合氨苄青霉素、阿莫西林中的任意一种；
步骤4，制备载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体：将载药Fe3O4@SiO2微球分散在聚氨酯(PU)水溶液中，超声处理3～6min，用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理3～6min，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球，吸附过程重复3-10次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
载药Fe3O4@SiO2微球与聚氨酯(PU)水溶液的固液比为：1：45～60g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1：45～60g/ml；
聚氨酯(PU)水溶液的质量分数为1.5～3.5％；磷脂水溶液的质量分数为1.5～3.5％；
步骤5，制备载药温度-磁场双响应微胶囊：将步骤4中制备的载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液中，搅拌；随后常温干燥，得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1：10～17g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为20～60％；
载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为130～600nm；
步骤6，向步骤5中得到的载药温度-磁场双响应微胶囊中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)的混合单体，之后再加入NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液，充分搅拌，随后向反应的溶液中加入引发剂，搅拌30～120s，室温下静止放置6～24h；洗涤，干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)质量比为92∶8；NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液中MBA占混合单体的质量百分比为5～10％；引发剂占总混合单体的质量百分比为0.5～2％；
引发剂为四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(AP)、偶氮二异丁腈中的任意一种；
制备的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为140～650nm；
步骤7，制备磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉，将步骤6得到的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为5～50％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为50～95％，以上各组份的质量百分比总和为100％；
磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为40～60％的磷酸四钙和质量百分比为40～60％的碳酸氢钙组成；
步骤8，制备磷酸钙基骨水泥：将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和固化液搅拌，再加入过氧化氢调和液，搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
固化液为蒸馏水、血液、生理盐水、稀酸、血清、磷酸盐溶液中的任意一种；
磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1：0.3～2.5g/ml；
过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的6～10％；搅拌时间为5～30min。
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，首先制备了聚乙二醇(PEG)改性的Fe3O4粒子；并在改性Fe3O4粒子表面形成SiO2涂层，得到Fe3O4@SiO2微球，接着对Fe3O4@SiO2微球负载药物；得到载药Fe3O4@SiO2微球；其次采用层层自组装法在Fe3O4@SiO2微球表面采用带相反电荷且含有温敏性的材料形成聚电解质壳层，接着用氢氧化钠水溶液蚀刻SiO2层，形成温度-磁场双响应微胶囊；随后在温度-磁场双响应微胶囊外面包覆P(NIPAM-AA)温敏水凝胶层，最后将P(NIPAM-AA)包覆的温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相均匀混合，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液混合，再加入过氧化氢调和液进行造孔，搅拌后注射，得到温度-磁场协同响应释药多孔磷酸钙基骨水泥。
其优点在于：1、采用过氧化氢调和液调和使得所制备的磷酸钙基骨水泥为多孔磷酸钙基骨水泥；2、利用P(NIPAM-AA)温敏水凝胶层在37℃会溶解的特性，当出现轻微炎症时，包覆的P(NIPAM-AA)温敏水凝胶层会溶解促使抗生素缓慢释放；3、利用聚电解质层中磷脂会在39～40℃发生溶解的特性，当局部炎症加重至39℃时，磷脂溶解进一步促进抗生素释放；4、可以人为调控磁场强度，使得磁性粒子核促使聚电解质壳层产生不同程度的变形从而使中间层抗生素产生不同程度的释放，进一步促进重症炎症的治疗；5、当磁场去除，药物释放速度缓慢，当炎症消失，温度敏感层关闭，药物不再释放，可以实现多次响应释药；6、磁性纳米粒子具有提高磷酸钙骨水泥力学性能的作用；因此温度-磁场协同响应释药一定程度减少了药物缓释系统存在的耐药性问题，在炎症发生时实现智能释药，在临床上具有较好的应用前景。
实施例1
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备改性Fe3O4粒子：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇、水混合液质量比为1:1；Fe3O4粒子与聚乙二醇(PEG)水溶液固液比为：1:100g/ml；PEG水溶液的质量分数为2％；搅拌时间为12h；
PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为500nm；
步骤2，制备Fe3O4@SiO2微球：将步骤1中PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中进行搅拌，沉淀十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二氧化硅(SiO2)和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正己烷，随后用乙醇洗涤得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1:3g/ml；混合溶液A包含质量百分比为2.5％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.7％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和质量百分比为0.6％正己烷；
制备的Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为30nm；
步骤3，制备载药Fe3O4@SiO2微球：将步骤2制备的Fe3O4@SiO2颗粒加入去离子水中，再加入庆大霉素(载药率为30％)，搅拌6h，随后在常温下真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
步骤4，制备载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体：将载药Fe3O4@SiO2微球分散在聚氨酯(PU)水溶液中，超声处理3min，用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理3min，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球。吸附过程重复3次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
载药Fe3O4@SiO2微球与聚氨酯(PU)水溶液的固液比为1:45～60g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1:45g/ml；
聚氨酯(PU)水溶液的质量分数为1.5％；磷脂水溶液的质量分数为1.5％；
步骤5，制备载药温度-磁场双响应微胶囊：将步骤4中制备的载药磁响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液搅拌；随后常温干燥得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1:10g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为20％；载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为600nm；
步骤6，向步骤5中得到的载药温度-磁场双响应微胶囊中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)混合单体，再加入NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液充分搅拌，随后向反应的溶液中加入引发剂搅拌30s，室温下静止放置6h；洗涤后干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)质量比为92:8；NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液中MBA占混合单体质量百分比的5％；引发剂占总单体质量百分比为0.5％；引发剂为过硫酸铵(AP)；制备的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为650nm；
步骤7，制备磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉，将步骤6得到的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为5％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为95％，以上各组份的质量百分比总和为100％；
磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为40％的磷酸四钙和质量百分比为60％的碳酸氢钙组成；
步骤8，制备磷酸钙基骨水泥：将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和蒸馏水搅拌，再加入过氧化氢调和液搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1:0.3g/ml；过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的6％；搅拌时间为5min。
实施例2
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备改性Fe3O4粒子：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇、水混合液质量比为1:1；Fe3O4粒子与聚乙二醇(PEG)水溶液固液比为：1:150g/ml；PEG水溶液的质量分数为4％；搅拌时间为18h；
PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为200nm；
步骤2，制备Fe3O4@SiO2微球：将步骤1中PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中进行搅拌，沉淀十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二氧化硅(SiO2)和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正己烷，随后用乙醇洗涤得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1:3.5g/ml；混合溶液A包含质量百分比为3％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.75％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和质量百分比为0.65％正己烷；
制备的Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为40nm；
步骤3，制备载药Fe3O4@SiO2微球：将步骤2制备的Fe3O4@SiO2颗粒加入去离子水中，再加入萘夫西林，载药率为35％，搅拌20h，随后在常温下真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
,步骤4，制备载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体：将载药Fe3O4@SiO2微球分散在聚氨酯(PU)水溶液中，超声处理4min，用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理4min，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球。吸附过程重复4次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
步骤4中载药Fe3O4@SiO2微球与聚氨酯(PU)水溶液的固液比为：1:50g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1:50g/ml；
聚氨酯(PU)水溶液的质量分数为2％；磷脂水溶液的质量分数为2％；
步骤5，制备载药温度-磁场双响应微胶囊：将步骤4中制备的载药磁响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液搅拌；随后常温干燥得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1:13g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为30％；载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为240nm；
步骤6，向步骤5中得到的载药温度-磁场双响应微胶囊中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)混合单体，再加入NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液充分搅拌，随后向反应的溶液中加入引发剂搅拌50s，室温下静止放置10h；洗涤后干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)质量比为92:8；NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液中MBA占混合单体质量百分比的6％；引发剂占总单体质量百分比为0.6％；引发剂为四甲基乙二胺(TEMED)；制备的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为260nm；
步骤7，制备磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉，将步骤6得到的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为25％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为75％，以上各组份的质量百分比总和为100％；
磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为45％的磷酸四钙和质量百分比为55％的碳酸氢钙组成；
步骤8，制备磷酸钙基骨水泥：将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和血液搅拌，再加入过氧化氢调和液搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1:0.65g/ml；过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的7％；搅拌时间为15min。
实施例3
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备改性Fe3O4粒子：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇、水混合液质量比为1:1；Fe3O4粒子与聚乙二醇(PEG)水溶液固液比为：1:200g/ml；PEG水溶液的质量分数为5％；搅拌时间为24h；
PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为300nm；
步骤2，制备Fe3O4@SiO2微球：将步骤1中PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中进行搅拌，沉淀十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二氧化硅(SiO2)和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正己烷，随后用乙醇洗涤得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1:4g/ml；混合溶液A包含质量百分比为3.5％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.8％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和质量百分比为0.7％正己烷；
制备的Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为50nm；
步骤3，制备载药Fe3O4@SiO2微球：将步骤2制备的Fe3O4@SiO2颗粒加入去离子水中，再加入环丙沙星盐酸盐，药物的载药率为40％；搅拌27h，随后在常温下真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
步骤4，制备载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体：将载药Fe3O4@SiO2微球分散在聚氨酯(PU)水溶液中，超声处理4.5min，用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理4.5min，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球。吸附过程重复6次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
载药Fe3O4@SiO2微球与聚氨酯(PU)水溶液的固液比为：1:53g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1:53g/ml；
聚氨酯(PU)水溶液的质量分数为2.5％；磷脂水溶液的质量分数为2.5％；
步骤5，制备载药温度-磁场双响应微胶囊：将步骤4中制备的载药磁响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液搅拌；随后常温干燥得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1:13.5g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为40％；载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为365nm；
步骤6，向步骤5中得到的载药温度-磁场双响应微胶囊中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)混合单体，NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液充分搅拌，随后向反应的溶液中加入引发剂搅拌80s，室温下静止放置15h；洗涤后干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)质量比为92:8；NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液中MBA占混合单体质量百分比的7％；引发剂占总单体质量百分比为1.25％；引发剂为偶氮二异丁腈；制备的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为405nm；
步骤7，制备磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉，将步骤6得到的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为27.5％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为72.5％，以上各组份的质量百分比总和为100％；
磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为50％的磷酸四钙和质量百分比为50％的碳酸氢钙组成；
步骤8，制备磷酸钙基骨水泥：将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和稀酸搅拌，再加入过氧化氢调和液搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1:1.4g/ml；过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的8％；搅拌时间为17.5min。
实施例4
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备改性Fe3O4粒子：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇、水的质量比为1:1；Fe3O4粒子与聚乙二醇(PEG)水溶液固液比为：1:250g/ml；PEG水溶液的质量分数为6％；搅拌时间为30h；
PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为400nm；
步骤2，制备Fe3O4@SiO2微球：将步骤1中PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中进行搅拌，沉淀十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二氧化硅(SiO2)和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正己烷，随后用乙醇洗涤得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1:4.5g/ml；混合溶液A包含质量百分比为4％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.85％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和质量百分比为0.75％正己烷；
制备的Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为60nm；
步骤3，制备载药Fe3O4@SiO2微球：将步骤2制备的Fe3O4@SiO2颗粒加入去离子水中，再加入三水合氨苄青霉素，药物的载药率为45％；搅拌36h，随后在常温下真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
步骤4，制备载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体：将载药Fe3O4@SiO2微球分散在聚氨酯(PU)水溶液中，超声处理5min，用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理5min，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球。吸附过程重复8次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
载药Fe3O4@SiO2微球与聚氨酯(PU)水溶液的固液比为1:55g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1:55g/ml；
聚氨酯(PU)水溶液的质量分数为3％；磷脂水溶液的质量分数为3％；
步骤5，制备载药温度-磁场双响应微胶囊：将步骤4中制备的载药磁响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液搅拌；随后常温干燥得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1:15g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为50％；
载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为500nm；
步骤6，向步骤5中得到的载药温度-磁场双响应微胶囊中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)混合单体，NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液充分搅拌，随后向反应的溶液中加入引发剂搅拌100s，室温下静止放置20h；洗涤后干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
中聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)质量比为92:8；NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液中MBA占混合单体质量百分比的9％；引发剂占总单体质量百分比为1.5％；引发剂为偶氮二异丁腈；制备的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为540nm；
步骤7，制备磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉，将步骤6得到的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为35％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为65％，以上各组份的质量百分比总和为100％；
磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为45％的磷酸四钙和质量百分比为55％的碳酸氢钙组成；
步骤8，制备磷酸钙基骨水泥：将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和稀酸搅拌，再加入过氧化氢调和液搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1∶2.2g/ml；过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的9％；搅拌时间为25min。
实施例5
本发明一种温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，制备改性Fe3O4粒子：将Fe3O4采用乙醇和水的混合液进行洗涤，之后将洗涤后的Fe3O4粒子加入PEG水溶液中搅拌，得到PEG改性的Fe3O4粒子；
乙醇、水的质量比为1:1；Fe3O4粒子与聚乙二醇(PEG)水溶液固液比为：1:300g/ml；PEG水溶液的质量分数为8％；搅拌时间为36h；
PEG改性的Fe3O4粒子平均粒径为100nm；
步骤2，制备Fe3O4@SiO2微球：将步骤1中PEG改性的Fe3O4粒子加入混合溶液A中进行搅拌，沉淀十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二氧化硅(SiO2)和正己烷壳层；收集微球后在丙酮溶液中回流去除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正己烷，随后用乙醇洗涤得到Fe3O4@SiO2微球；
PEG改性的Fe3O4粒子与混合溶液A的固液比为1:5g/ml；混合溶液A包含质量百分比为4.5％正硅酸四乙酯、质量百分比为1.9％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和质量百分比为0.8％正己烷；
Fe3O4@SiO2微球的二氧化硅层厚度为70nm；
步骤3，制备载药Fe3O4@SiO2微球：将步骤2制备的Fe3O4@SiO2颗粒加入去离子水中，再加入阿莫西林，药物的载药率为50％，搅拌48h，随后在常温下真空干燥，得到载药Fe3O4@SiO2微球；
步骤4，制备载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体：将载药Fe3O4@SiO2微球分散在聚氨酯(PU)水溶液中，超声处理6min，用磁铁收集微球；随后将微球分散在磷脂水溶液中，超声处理6min，用去离子水洗涤并用磁铁收集磁球。吸附过程重复10次，得到载药温度-磁场双响应微胶囊前驱体；
载药Fe3O4@SiO2微球与聚氨酯(PU)水溶液的固液比为1:45～60g/ml；Fe3O4@SiO2微球与磷脂水溶液的固液比为1:60g/ml；
聚氨酯(PU)水溶液的质量分数为3.5％；磷脂水溶液的质量分数为3.5％；
步骤5，制备载药温度-磁场双响应微胶囊：将步骤4中制备的载药磁响应微胶囊前驱体加入氢氧化钠水溶液搅拌；随后常温干燥得到载药温度-磁场双响应微胶囊；
载药温度-磁场双响应微胶囊与氢氧化钠水溶液的固液比为1:17g/ml；氢氧化钠水溶液的质量分数为60％；
载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为130nm；
步骤6，向步骤5中得到的载药温度-磁场双响应微胶囊中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)混合单体，再加入NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液充分搅拌，随后向反应的溶液中加入引发剂搅拌120s，室温下静止放置24h；洗涤后干燥，得到P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊；
聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和丙烯酸(AA)质量比为92:8；NN-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶液中MBA占混合单体质量百分比的10％；引发剂占总单体质量百分比为2％；引发剂为过硫酸铵(AP)；制备的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的平均粒径为140nm；
步骤7，制备磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉，将步骤6得到的P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊与磷酸钙骨水泥固相混合均匀，得到磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉；
P(NIPAM-AA)包覆的载药温度-磁场双响应微胶囊的质量百分比为50％，磷酸钙骨水泥固相的质量百分比为50％，以上各组份的质量百分比总和为100％；
磷酸钙骨水泥固相组分由质量百分比为60％的磷酸四钙和质量百分比为40％的碳酸氢钙组成；
步骤8，制备磷酸钙基骨水泥：将磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉和磷酸盐溶液搅拌，再加入过氧化氢调和液搅拌后注射，得到磷酸钙基骨水泥。
磷酸钙基骨水泥前驱体固相粉与固化液的固液比为1:2.5g/ml；过氧化氢调和液占骨水泥总质量百分比的10％；搅拌时间为30min。
将本发明实施例1、2、3、4、5制备的一种磷酸钙基骨水泥与传统磷酸钙骨水泥在正常、低炎症温度下和高炎症及有磁场控制时抗生素释药率如表1及表2所示：
表1正常及低炎症温度下抗生素释药率
由表1可以看出，在未发生炎症时，本发明所制备的骨水泥不释药；当发生轻微炎症时，本发明所制备的骨水泥进行药物缓释，30天最高释药量达到40.4％，60天最高释药量达51.3％；且从实施例1～5可以看出：随着过氧化氢发泡剂含量从6％～10％，药物释放量不断增高从16.8％～40.4％，这是因为过氧化氢发泡剂促使磷酸钙骨水泥变成多孔磷酸钙骨水泥，抗生素可以通过这些孔道释放出来，形成孔越多，药物释放越快。
表2低炎症和高炎症及有磁场控制时抗生素释药率
由表2可以看出在高炎症且不加磁场时，药物释放量提高，这是因为磷脂在39℃融化进一步促进了药物释放；当施加低磁场强度时，骨水泥释药率有所上升，当施加高磁场强度时，释药率进一步提高，说明炎症严重时，可以通过人工调控不同磁场强度可以控制药物释放量；实施例1—5，释药率随着所加磁响应微胶囊比例的增加而增加。相比于传统释药骨水泥而言，本发明所制备的骨水泥可在低炎症时自主释药，高炎症时只能调控加人工促进，可以根据磁场强度、磁响应微胶囊含量使释药可控，有望成为一种有前景的临床应用骨水泥。
将本发明实施例1、2、3、4、5制备的一种磷酸钙基骨水泥与传统磷酸钙骨水泥在常温下浸泡在模拟体液中0、30、60天观察抗压强度的变化，如表3所示；
表3本发明与传统CPC在常温下浸泡0d、30d、60d时抗压强度的比较
由表3可以看出，本发明制备的温度-磁场协同响应释药磷酸钙基骨水泥力学性能随着磁响应微胶囊的增加而增加；且随着浸泡时间的变化抗压强度基本不发生变化，为临床应用奠定了基础。
为了测试在不同炎症发生时的药物释放情况，将实施例1、2、3、4、5制备的一种磷酸钙基骨水泥与传统磷酸钙骨水泥分别在37.5℃、39℃不同炎症情况下的模拟体液中测定该骨水泥的试药率，同时在39℃高炎症下分别施加磁场强度为0、0.5T响应10min，将以上释放记为第一次响应释放，接着将其在常温下放置24h，再放置于不同温度的模拟体液中，对样品施加10min磁场强度为0、0.5T的刺激，测定试药率，记为第二次响应释放，本发明的磷酸钙基骨水泥与传统CPC第一次与第二次响应释放抗生素释药率，如表4所示；
表4本发明与传统CPC的第一次与第二次响应释放抗生素释药率
由表4可以看出本发明制备得到的磷酸钙基骨水泥会在低炎症时自主释药，在重症炎症时，可以进一步自主加速释药，同时可以人工调控不同磁场进一步药物释放，且至少能在两次不同炎症条件下、不同磁场刺激下释放药物，且释药率基本不随次数变化而变化，可以实现药物可控释放；随着骨水泥中磁性粒子含量增加，在不同磁场刺激下，磁响应释药骨水泥释药率增加。
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