具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。本领域技术人员将认识到在本公开的实践中可以使用许多方法。事实上，本公开绝不限于所描述的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文引用的任何参考文献(包括例如所有专利和公开)都通过引用以其整体并入。

如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。

当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将阐述的数值的上下边界扩大10％来修改该范围。

如本文所使用的，短语诸如“小于”、“大于”、“至少”、“至多”、“大约”、“低于”、“高于”和“约”当与一系列数值结合使用时，修饰这一系列中的每个数值。例如，“小于1％、2％或3％”的表述相当于“小于1％、小于2％或小于3％”。

如本文所使用的，烟草植物是指来自烟草属物种的植物。

烟草中尼古丁的生物合成始于：使用S-腺苷-甲硫氨酸作为辅因子，将多胺(腐胺)通过酶(腐胺N-甲基转移酶(PMT))甲基化为N-甲基腐胺。这是使前体代谢物参与尼古丁生物合成的步骤。PMT酶在酶分类系统下归类为EC 2.1.1.53。在烟草中，五个基因编码腐胺N-甲基转移酶，命名为PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4。表1A列出了TN90植物中这五个PMT基因的基因组DNA序列、cDNA序列和蛋白质序列。本公开描述了用于编辑PMT基因以产生尼古丁水平降低同时保持叶质量的pmt突变植物的组合物和方法。

如本文所使用的，“PMT1b”或“PMT1b基因”是指在烟草中编码在TN90中具有如SEQID No：11所述的示例性氨基酸序列的多肽的基因座。

如本文所使用的，“PMT1a”或“PMT1a基因”是指在烟草中编码在TN90中具有如SEQID No.12所述的示例性氨基酸序列的多肽的基因座。

如本文所使用的，“PMT2”或“PMT2基因”是指是指在烟草中编码在TN90中具有如SEQ ID No.13所述的示例性氨基酸序列的多肽的基因座。

如本文所使用的，“PMT3”或“PMT3基因”是指是指在烟草中编码在TN90中具有如SEQ ID No.14所述的示例性氨基酸序列的多肽的基因座。

如本文所使用的，“PMT4”或“PMT4基因”是指是指在烟草中编码在TN90中具有如SEQ ID No.15所述的示例性氨基酸序列的多肽的基因座。

如本文所使用的，突变是指引入到基因中以减少、抑制或消除由所述基因编码的产物的表达或活性的可遗传的基因修饰。这种修饰可以在基因的任何序列区域中，例如在启动子、5’UTR、外显子、内含子、3’UTR或终止子区域中。在一个方面中，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。如本文所使用的，“突变体等位基因”是指来自其中等位基因包含突变的基因座的等位基因。

如本文所使用的，“pmt突变体”是指在一个或多个PMT基因中包含一个或多个突变的烟草植物。pmt突变体可以是单突变体、双突变体、三突变体、四突变体或五突变体。如本文所使用的，单、双、三、四或五pmt突变体分别指在一、二、三、四或五个PMT基因中具有修饰的突变体。pmt突变体也可以是一个或多个PMT基因中的纯合突变体、杂合突变体或杂等位基因突变体组合。

如本文所使用的，基因名称或基因座名称大写并以斜体显示，例如PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4。蛋白质或多肽名称大写单并不使用斜体，例如PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4。突变体名称(用于指代基因或一组基因中的一般突变，或指代特定突变体等位基因)以小写和斜体显示，例如pmt、pmt1a、pmt1b、pmt2、pmt3和pmt4。

在一个方面中，本公开提供了一种烟草植物或其部分，其在至少一个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少一个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生尼古丁水平低于来自不具有所述一个或多个突变体等位基因的对照烟草植物的叶的尼古丁水平的叶。在一个方面中，提供了单pmt突变体烟草植物。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，单pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平低于不具有单pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在进一步的方面中，当在相似的生长条件下生长时，单pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平为不具有单pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％。

在另一个方面中，烟草植物在至少两个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少两个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在一个方面中，提供了一种双pmt突变体烟草植物。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，双pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平低于不具有双pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在进一步的方面中，当在相似的生长条件下生长时，双pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平为不具有双pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％。

在进一步的方面中，烟草植物在至少三个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少三个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在一个方面中，提供了三pmt突变体烟草植物。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，三pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平低于不具有三pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在进一步的方面中，当在相似的生长条件下生长时，三pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平为不具有三pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％。

在另一个方面中，烟草植物在至少四个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少四个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在一个方面中，提供了四pmt突变体烟草植物。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，四pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平低于不具有四pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在进一步的方面中，当在相似的生长条件下生长时，四pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平为不具有四pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％。

在进一步的方面中，烟草植物在五个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述五个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在一个方面中，提供了五pmt突变体烟草植物。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，五pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平低于不具有五pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在进一步的方面中，当在相似的生长条件下生长时，五pmt突变体烟草植物包含的尼古丁水平为不具有五pmt突变的对照植物的尼古丁水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％。

在一个方面中，烟草植物是如表8A至8E中列出的单pmt突变体、双pmt突变体、三突变体、四突变体或五突变体。在另一个方面中，烟草植物包含一个或多个表5A至5E和表12A至12E中列出的pmt突变体等位基因。还提供了表5A至5E和表12A至12E中列出的pmt突变体等位基因的每种组合，以产生单pmt突变体、双pmt突变体、三突变体、四突变体或五突变体。每个突变的位点可以是纯合的或杂合的，或者包含杂等位基因组合。在另一个方面中，烟草植物包含pmt突变体基因型组合，如针对表4A至4E和表10中列出的每个单独品系所示。在一个方面中，烟草植物包含pmt突变体等位基因序列，所述pmt突变体等位基因序列选自由SEQID Nos.21至200、410至441、474至505、538至569、602至633和666至697组成的群组。在另一个方面中，本公开提供了一种包含pmt突变体等位基因序列的双pmt突变体、三突变体、四突变体或五突变体，所述pmt突变体等位基因序列选自由SEQ ID Nos.21至200、410至441、474至505、538至569、602至633、和666至697组成的群组。

在一个方面中，当在相当的条件下生长和加工时，烟草植物能够产生尼古丁水平低于来自对照烟草植物的叶的尼古丁水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％的叶。在另一个方面中，当在相当的条件下生长和加工时，烟草植物能够产生尼古丁水平为对照烟草植物的尼古丁水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％的叶。

在另一个方面中，当在相当的条件下生长和加工时，烟草植物能够产生总生物碱水平低于对照烟草植物的总生物碱水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％的叶。在另一个方面中，当在相当的条件下生长和加工时，烟草植物能够产生总生物碱水平为对照烟草植物的总生物碱水平的1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％的叶。

在进一步的方面中，当在相当的条件下生长和加工时，烟草植物能够产生总生物碱水平低于来自对照烟草植物的叶的总生物碱水平的40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的叶。

在一个方面中，突变pmt等位基因包含PMT序列区域中的突变，所述PMT序列区域选自由以下组成的群组：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、第三内含子、第四外显子、第四内含子、第五外显子、第五内含子、第六外显子、第六内含子、第七外显子、第七内含子、第八外显子、3’UTR、终止子及其任意组合。在另一个方面中，突变pmt等位基因包含表1D至1H中列出的PMT基因组序列区域中的突变。

在另一个方面中，突变pmt等位基因包含一种或多种突变类型，所述突变类型选自由无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任意组合组成的群组。在一个方面中，突变pmt等位基因是无效等位基因或敲除等位基因。

在一个方面中，突变pmt等位基因导致以下中的一种或多种：PMT蛋白截短、不可翻译的PMT基因转录物、非功能性PMT蛋白、PMT基因中的过早终止密码子及其任意组合。

在另一个方面中，突变pmt等位基因包含选自由以下组成的群组的突变：相对于野生型PMT基因的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。

在一个方面中，pmt突变体包含合子状态，所述合子状态选自由纯合的、杂合的和杂等位基因组成的群组。在另一个方面中，pmt突变体在至少1、2、3、4或5个PMT基因中是纯合的或杂等位基因的。在一个方面中，pmt突变体在至少4个PMT基因中是纯合的或杂等位基因的。在另一个方面中，pmt突变体在所有五个PMT基因中都是纯合的或杂等位基因的。在另一个方面中，pmt突变体包含PMT1a和PMT3中的突变。

在一个方面中，烟草植物能够产生尼古丁水平选自由以下组成的群组的叶：小于0.15％、小于0.125％、小于0.1％、小于0.08％、小于0.06％、小于0.05％、小于0.04％、小于0.03％、小于0.02％和小于0.01％干重。

在另一个方面中，烟草植物能够产生总生物碱水平选自由以下组成的群组的叶：小于1％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％和小于0.2％干重。

在进一步的方面中，烟草植物能够产生总TSNA水平为以下的调制叶：2至0.05ppm、1.9至0.05ppm、1.8至0.05ppm、1.7至0.05ppm、1.6至0.05ppm、1.5至0.05ppm、1.4至0.05ppm、1.3至0.05ppm、1.2至0.05ppm、1.1至0.05ppm、1.0至0.05ppm、0.9至0.05ppm、0.8至0.05ppm、0.7至0.05ppm、0.6至0.05ppm、0.5至0.05ppm、0.4至0.05ppm、0.3至0.05ppm、0.2至0.05ppm、0.15至0.05ppm或0.1至0.05ppm。

在一个方面中，烟草植物能够在调制时产生具有USDA等级指数值的叶，所述USDA等级指数值选自由50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高组成的群组。在另一个方面中，在相似的条件下生长和调制时，烟草植物在调制时能够产生USDA等级指数值与对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中除了修饰之外，对照植物与烟草植物共享基本上相同的遗传背景。在进一步的方面中，在相似的条件下生长时，烟草植物在调制时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，其中除了修饰之外，所述对照植物与烟草植物共享基本上相同的遗传背景。在进一步的方面中，烟草植物在调制时能够产生具有对照植物的USDA等级指数值的65％至130％、70％至130％、75％至130％、80％至130％、85％至130％、90％至130％、95％至130％、100％至130％、105％至130％、110％至130％、115％至130％或120％至130％的USDA等级指数值的叶。在进一步的方面中，烟草植物在调制时能够产生具有对照植物的USDA等级指数值的70％至125％、75％至120％、80％至115％、85％至110％或90％至100％的USDA等级指数值的叶。

在一个方面中，在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的尼古丁水平低于对照植物的尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，其中除了修饰以外，所述对照植物与烟草植物共享基本上相同的遗传背景。

在进一步的方面中，烟草植物包含一个或多个pmt突变体等位基因，并且进一步包含直接抑制一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变，所述基因编码产物，所述产物选自由以下组成的群组：MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、尼古丁吸收透性酶(NUP)和MATE转运蛋白组成的群组。

在一个方面中，烟草植物包含一个或多个pmt突变体等位基因，并且进一步包含Nic2基因座的ERF基因中的突变。在一个方面中，烟草植物进一步包含选自由ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF 17和ERF168组成的群组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种基因中的一种或多种突变。参见Shoji等人，Plant Cell,(10):3390-409(2010)；和Kajikawa等人，Plant physiol.2017,174:999-1011。在一个方面中，烟草植物进一步包含ERF189、ERF115或两者中的一个或多个突变。

在一个方面中，烟草植物包含一个或多个qpt突变体等位基因，并且进一步包含Nic1基因座(或如在2019年1月11日提交的以WO/2019/140297公开的PCT/US2019/013345中的Nic1b基因)的ERF基因中的突变。还参见WO/2018/237107。在一个方面中，烟草植物进一步包含选自由ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2组成的群组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或七种或更多种基因中的一个或多个突变。参见Kajikawa等人，Plantphysiol.2017,174:999-1011。在一个方面中，烟草植物进一步包含选自由ERFnew、ERF199、ERF19、ERF29、ERF210和ERF91L2组成的群组的一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或所有六种基因中的一个或多个突变。

在一个方面中，本公开进一步提供了pmt突变烟草植物或其部分，其包含选自由以下组成的群组的尼古丁或总生物碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％、小于0.05％、小于0.025％、小于0.01％和小于0.005％，其中所述烟草植物在调制时能够产生USDA等级指数值为50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高的叶。在另一个方面中，这种pmt突变烟草植物包含低于0.02％的尼古丁水平，并且在调制时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。在进一步的方面中，这种烟草植物包含低于0.01％的尼古丁水平，并且在调制时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。

在一个方面中，本发明还提供了一种包含非转基因突变的烟草植物或其部分，其中在相似的生长条件下生长时，所述非转基因突变将烟草植物的尼古丁或总生物碱水平降低至低于对照植物尼古丁水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，其中所述烟草植物在调制时能够产生具有与对照植物的USDA等级指数值相当的USDA等级指数值的叶，并且其中所述对照植物除了非转基因突变之外与所述烟草植物共享基本上相同的遗传背景。

在一个方面中，烟草植物包含通过选自由随机诱变和靶向诱变组成的群组的方法引入的pmt突变。在另一个方面中，pmt突变通过选自由巨核酸酶、锌指核酸酶、TALEN和CRISPR组成的群组的靶向诱变方法引入。

除非另有说明，否则本文提及的烟草植物、品种、栽培品种或品系的生物碱或尼古丁水平(或另一叶化学或性质表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，包括例如单个植物的多个叶的平均值或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物群体的平均测量值。

除非另有说明，否则在从打顶后编号3、4和5的叶采集的混合叶样品中，在打顶后测量烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或特性表征)。如本文所使用的，每当提及来自两种植物(例如，突变植物与对照植物)的叶之间的比较时，来自相同或相当的烟叶部位(stalk position)和发育阶段的叶是有意的，使得比较可以证明由于基因型差异而不是来自其他因素的影响。作为说明，野生型对照植物的叶3旨在作为与pmt突变植物的叶3进行比较的参考点。在一个方面中，将包含至少一个pmt突变的烟草植物与相同烟草品种的对照烟草植物进行比较。

烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或特性特征)也可以用替代方法测量。在一个方面中，烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或性质特征)是在打顶后在具有最高尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或性质特征)的叶中测量的。在一个方面中，烟草植物的尼古丁或生物碱水平在打顶后在编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的叶中测量。在另一个方面中，烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或特性特征)在打顶后在具有连续叶编号的混合的两个或更多个叶中测量，所述连续叶编号选自由叶编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30组成的群组。在另一个方面中，烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或性质特征)在打顶后在具有选自由以下组成的群组的叶编号的叶中测量：1至5、6至10、11至15、16至20、21至25和26至30。在另一个方面中，烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或性质特征)在打顶后在具有选自由以下组成的群组的叶编号的混合的两个或更多个叶中测量：1至5、6至10、11至15、16至20、21至25和26至30。在另一个方面中，烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或性质特征)在打顶后在具有选自由以下组成的群组的叶编号的混合的三个或更多个叶中测量：1至5、6至10、11至15、16至20、21至25和26至30。

如本文所使用的，叶编号基于烟草茎杆上的烟叶部位(leaf position)，其中叶编号1是打顶后最年轻的叶(在顶部)，并且最高的叶编号被分配给最老的叶(在底部)。

用于确定平均测量值(例如，生物碱或尼古丁水平或叶等级)的烟草植物的群体或烟叶的集合可以是任何大小，例如，5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循行业公认的标准协议来确定平均测量值或等级指数值。

如本文所使用的，“打顶”是指当烟草植物接近营养成熟且接近生殖生长开始时，除去茎尖，包括SAM、花和至多几片相邻的叶。通常，烟草植物在现蕾期(在花开始出现后不久)打顶。例如，当50％的植物具有至少一朵开放的花时，温室或大田种植的烟草植物可以打顶。给烟草植株打顶导致顶端优势丧失，并且还诱导生物碱产量增加。

除非另有说明，否则在打顶后2周测量烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或特性表征)。可替代地，可以使用其他时间点。在一个方面中，在打顶后约1、2、3、4或5周测量烟草植物的尼古丁或生物碱水平(或另一叶化学或性质表征)。在另一个方面中，在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量烟草植物的尼古丁、生物碱或多胺水平(或另一叶化学或性质表征)。

如本文所使用的，“相似的生长条件”或“相当的生长条件”是指相似的环境条件和/或农艺实践，用于在两种或更多种植物基因型之间生长和进行有意义的比较，使得环境条件或农艺实践都不会促成或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。农艺实践包括，例如，播种、剪叶、挖底(undercutting)、移栽、打顶和抹芽。参见Chapters 4B and 4C of Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford(1999),pp 70-103。

“生物碱”是复杂的含氮化合物，其天然存在于植物中并且对人和动物具有药理作用。“尼古丁”是商业化卷烟中主要的天然生物碱，并且占烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其他主要生物碱包括可替宁、去甲烟碱、麦斯明烟草碱、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。烟草中的次要生物碱包括尼古丁-N-氧化物、N-甲基新烟草碱、N-甲基假木贼碱、假氧尼古丁、2,3-联吡啶等。

生物碱水平可以通过本领域已知的方法测定，例如通过基于气-液色谱法、高效液相色谱法、放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法的定量。例如，尼古丁生物碱水平可以通过基于CORESTA推荐方法No.7(1987)的GC-FID方法和ISO标准(ISO TC 126N 394E，也可参见Hibi等人，Plant Physiology 100:826-35(1992))的使用配备有毛细管柱和FID检测器的气相-液相色谱的方法来测量。

除非另有特别说明，否则生物碱和尼古丁水平使用符合CORESTA方法62(Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by GasChromatographic Analysis，2005年2月)以及美国疾病控制和预防中心在1999年3月23日在Federal Register第64卷第55期上发表的Protocol for Analysis of Nicotine,TotalMoisture and pH in Smokeless Tobacco Products(并且2009年1月7日在第74卷第4期上修订)中定义的方法来测量。可替代地，可以使用为分析烟草样品而开发的分段流动比色法来测量烟草总生物碱，该方法由Skalar Instrument Co(West Chester，PA)改编，并由Collins等人，Tobacco Science 13:79-81(1969)描述。简而言之，在分析总生物碱和还原糖之前，可以对烟草的样本进行干燥、研磨和提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水提取和木炭用于脱色。总生物碱的测定基于：氯化氰与尼古丁类生物碱在芳香胺的存在下的反应，形成在460nm下测量的有色复合物。除非另有说明，否则本文所示的总生物碱水平或尼古丁水平基于干重(例如，总生物碱百分比或尼古丁百分比)。

在一个方面中，烟草植物的平均尼古丁或总生物碱水平选自由以下组成的群组：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％干重。在另一个方面中，烟草植物的平均尼古丁或总生物碱水平选自由以下组成的群组：约0.01％至0.02％、0.02％至0.05％、0.05％至0.75％、0.75％至0.1％、0.1％至0.15％、0.15％至0.2％、0.2％至0.3％、0.3％至0.35％、0.35％至0.4％、0.4％至0.5％、0.5％至0.6％、0.6％至0.7％、0.7％至0.8％、0.8％至0.9％、0.9％至1％、1％至1.1％、1.1％至1.2％、1.2％至1.3％、1.3％至1.4％、1.4％至1.5％、1.5％至1.6％、1.6％至1.7％、1.7％至1.8％、1.8％至1.9％、1.9％至2％、2％至2.1％、2.1％至2.2％、2.2％至2.3％、2.3％至2.4％、2.4％至2.5％、2.5％至2.6％、2.6％至2.7％、2.7％至2.8％、2.8％至2.9％、2.9％至3％、3％至3.1％、3.1％至3.2％、3.2％至3.3％、3.3％至3.4％、3.4％至3.5％以及3.5％至3.6％干重。在进一步的方面中，烟草植物的平均尼古丁或总生物碱水平选自由以下组成的群组：约0.01％至0.1％、0.02％至0.2％、0.03％至0.3％、0.04％至0.4％、0.05％至0.5％、0.75％至1％、0.1％至1.5％、0.15％至2％、0.2％至3％、和0.3％至3.5％干重。

本公开还提供了具有改变的尼古丁水平而对其他烟草性状(例如，叶等级指数值)没有负面影响的烟草植物。在一个方面中，低尼古丁或不含尼古丁的烟草品种提供商业上可接受等级的调制烟草。烟草等级根据以下因素进行评估，所述因素包括但不限于：叶柄部位、叶尺寸、叶颜色、叶的均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的着色强度和深度以及光泽相关)、吸湿性(烟叶吸收和保持周围水分的能力)以及绿色的细微差别或偏色。例如，可以使用由美国农业部农业市场服务局公布的官方标准等级(7U.S.C.§511)来确定叶等级。参见，例如白肋烟官方标准等级(美国31型和外国93型)，1990年11月5日生效(55F.R.40645)；烤烟官方标准等级(美国11、12、13、14型和外国型92型)，1989年3月27日生效(54F.R.7925)；宾夕法尼亚籽叶烟草的官方标准等级(美国41型)，1965年1月8日生效(29F.R.16854)；俄亥俄州雪茄叶烟草的官方标准等级(美国42、43和44型)，1963年12月8日生效(28F.R.11719和28F.R.11926)；威斯康星州雪茄烟混合型烟草的官方标准等级(美国54和55型)，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；威斯康星州雪茄烟混合型烟草的官方标准等级(美国54和55型)，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；佐治亚州和弗罗里达州荫生雪茄包装烟草的官方标准等级(美国62型)，1971年4月生效。USDA等级指数值可以根据行业认可的等级指数确定。参见，例如，Bowman等人，Tobacco Science,32:39-40(1988)；传统烟草文献图书馆(Bates文件#523267826-523267833，1988年7月1日，Memorandum on theProposed Burley Tobacco Grade Index)；和Miller等人，1990,Tobacco Intern.,192:55-57(所有前述参考文献都通过引用以其整体并入)。在一个方面中，USDA等级指数是所接收的联邦等级的0-100数值表示，并且是所有烟叶部位的加权平均值。较高的等级指数指示较高的质量。可替代地，可以通过高光谱成像确定叶等级。参见，例如WO 2011/027315(于2011年3月10日公布，并通过引用以其整体并入)。

在一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含相似水平的一种或多种烟草香气化合物。在另一个方面中，当在相似的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含相似水平的一种或多种选自由以下组成的群组的烟草香气化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。

如本文所使用的，烟草香气化合物是与烟草烟雾的风味和香气相关的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷和labdenoid二萜以及糖酯。烟草香气化合物的浓度可以通过本领域中任何已知的代谢物谱方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱法(GC-MS)、核磁共振光谱法、液相色谱-质谱联用。参见Weckwerth和Kahl编辑的“The Handbook of Plant Metabolomics”(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。

如本文所使用的，“还原糖”是具有游离的或潜在游离的醛基团或酮基团的任何糖(单糖或多糖)。葡萄糖和果糖通过降低烟气pH和有效地减少“游离的”未质子化的尼古丁的量，在卷烟烟气中充当尼古丁缓冲剂。还原糖例如通过改变尼古丁和其他烟草生物碱的感官影响来平衡烟气味道。已经报道在各种烟草品种之间、在同一品种内以及在同一植物品系内，因种植条件引起的糖含量与生物碱含量之间的反比关系。还原糖水平可以使用由Skalar Instrument Co(West Chester，PA)改良并如Davis,Tobacco Science 20:139-144(1976)描述的用于分析烟草样品的分段流动比色法来测量。例如，样品用碳酸钠溶液透析。将铜新亚铜试剂(Copper neocuproin)添加到样品中并且加热溶液。在糖的存在下，铜新亚铜试剂螯合物被还原，形成在460nm处测量的有色复合物。

在一个方面中，烟草植物在一个或多个PMT基因座中包含一个或多个非天然存在的突变体等位基因，其降低或消除了一个或多个PMT基因座的PMT酶促活性。在一个方面中，这些突变体等位基因导致较低的尼古丁水平。突变pmt等位基因可以通过本领域中已知的任何方法(包括随机或靶向诱变方法)引入。

此类诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering和Verkerk,In,The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon press,pp317-320,1965)或UV-辐射、X-射线和快中子辐照(参见，例如Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；和Poehlman,Breeding Field Crops,Van NostrandReinhold,New York(3.sup.rd ed),1987)、转座子标签(Fedoroff等人，1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)以及T-DNA插入法(Hoekema等人，1983；美国专利号5,149,645)。EMS诱导的诱变由在基因组的长度上化学诱导随机点突变组成。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大量缺失。转座子标签包含在内源基因内插入转座子以减少或消除基因的表达。例如，可能存在于烟草基因中的突变的类型包括点突变、缺失、插入、复制和逆转。此类突变期望存在于烟草基因的编码区域中。然而，烟草基因的启动子区、和内含子或非翻译区中的突变也可能是期望的。

此外，用于筛选化学诱导的突变的快速并且可自动化的方法，TILLING(定向诱导基因组局部突变)也适用于本公开，其使用变性HPLC或选择性核酸内切酶消化选择的PCR产物。参见McCallum等人(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。影响基因表达或干扰基因的功能的突变可以使用本领域公知的方法来确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守性残基中的突变可以特别有效地抑制蛋白的功能。在一个方面中，烟草植物包含本文所述的一个或多个PMT基因的无义(例如，终止密码子)突变。

应当理解，当鉴定突变时，内源参考DNA序列应当来自相同品种的烟草。例如，如果包含突变的修饰的烟草植物来自品种TN90，那么内源参考序列必须是内源TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，K326)的同源序列。类似地，如果包含突变的修饰的烟草细胞是TN90细胞，那么内源参考序列必须是内源TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，K326)的烟草细胞的同源序列。

在一个方面中，本公开还提供了一种具有改变的尼古丁水平同时保持商业上可接受的叶质量的烟草品系。这一品系可以通过经由精确的基因组工程技术将突变引入到一个或多个PMT基因中产生，例如转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、巨核酸酶、锌指核酸酶和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/Csm1系统及其组合(参见，例如美国专利申请公开2017/0233756)。参见，例如，Gaj等人，Trends inBiotechnology,31(7):397-405(2013)。

诱变的烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的示例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNase保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定，以及蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀法以及用于检测多肽的酶联免疫测定法。诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的其他技术也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于实施所有引用的技术的方法是已知的。

在一个方面中，本文提供的烟草植物或植物基因组通过选自由以下组成的群组的酸酶突变或编辑：巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶或CRISPR/Csm1核酸酶。

如本文所使用的，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个核苷酸的靶向诱变，或内源植物基因组核酸序列的去除或置换。在一个方面中，所提供的编辑的核酸序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在一个方面中，所提供的编辑的核酸序列与选自由SEQ ID NOs:1至10组成的群组的多核苷酸及其片段具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在另一个方面中，所提供的编辑的核酸序列与编码选自由SEQ ID NOs:11至15组成的群组的多肽的多核苷酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。

巨核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶位点处诱导双链DNA断裂，然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程修复。然后，在切割位点发生序列修饰，其可以包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或通过HR整合供体核酸序列。在一个方面中，所提供的方法包括用核酸酶编辑植物基因组，所述核酸酶用以通过HR用供体多核苷酸突变植物基因组中的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或多于10个核苷酸。在一个方面中，所提供的突变由使用核酸酶的基因组编辑引起。在另一个方面中，所提供的突变由非同源末端连接或同源重组引起。

巨核酸酶(其通常在微生物中鉴定)是具有高活性和长识别序列(＞14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的巨核酸酶的工程改造版本通常具有延伸的DNA识别序列(例如，14至40bp)。由于巨核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中相互交织，因此巨核酸酶的工程改造可能比ZFN和TALEN更具挑战性。诱变和高通量筛选的专门方法已经被用于产生识别独特序列并具有改进的核酸酶活性的新型巨核酸酶变体。

ZFN是由与FokI限制性内切酶的切割结构域融合的工程改造的锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质。ZFN可以被设计成切割几乎任何长度的双链DNA，以用于修饰锌指DNA结合结构域。ZFN从由FokI核酸内切酶的非特异性DNA切割结构域构成的单体形成二聚体，所述结构域与经工程改造以结合靶DNA序列的锌指阵列融合。

ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列构成。相对于锌指∞-螺旋起点的-1、+2、+3和+6位置的氨基酸(其有助于与靶DNA的位点特异性结合)可以改变和定制，以适合特定的靶序列。其他氨基酸形成共有骨架(consensus backbone)，以生成具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则是本领域已知的。

FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，因此需要两个带有C-末端区域的ZFN来结合切割位点的相反DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以修饰靶位点。如本文所使用的，术语“ZFN”是广义的，并且包括在没有另一个ZFN的帮助的情况下可以切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN也用于指一对ZFN中的一个或两个成员，它们被工程改造成一起工作以在同一位点切割DNA。

不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可以使用各种方法之一进行重新工程改造，所以理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。公开可用的用于工程改造锌指结构域的方法包括上下文依赖组装(CoDA)、寡聚体库工程(OPEN)和模块化组装。

TALEN是通过将转录激活子样效应子(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚并导致在靶位点处双链DNA断裂。如本文所使用的，术语TALEN是广义的，并且包括在没有另一个TALEN的帮助下可以切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也用于指一对TALEN中的一个或两个成员，它们共同作用以在同一位点处切割DNA。

转录激活子样效应子(TALE)可以被工程改造以结合几乎任何DNA序列。TALE蛋白是来源于黄单胞菌属的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。在感染过程中，黄单胞菌属病原体向宿主植物细胞中分泌TALE。TALE移动至细胞核，在细胞核中识别并结合至宿主基因组中特定基因的启动子区域中特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体构成的中央DNA结合结构域。除12和13位的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸是高度保守的。这两种可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这一简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程改造特异性DNA结合结构域。

除野生型FokI切割结构域外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体，以提高切割特异性和切割活性。FokI结构域起二聚体的作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于在靶基因组中具有适当取向和间隔的位点。TALEN DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基的数量都是用于实现高水平活性的参数。

TALE结合结构域的氨基酸序列和DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works等软件程序可以用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见，Doyle等人，Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122；Cermak等人，Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。

CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Csm1或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代物。CRISPR系统基于RNA引导的工程改造的核酸酶，其利用互补碱基配对来识别靶位点处的DNA序列。

CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免受核酸(诸如病毒)的入侵。免疫通过入侵DNA的短片段的整合获得，这些短片段被称为CRISPR基因座的近端处的两个相邻重复序列之间的间隔序列。CRISPR阵列(包括间隔序列)在随后与侵入性DNA相遇时被转录，并被加工成长度约40nt的小干扰CRISPR RNA(cr RNA)，其与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)结合，以激活和引导Cas9核酸酶。这将切割入侵DNA中被称为原间隔子的同源双链DNA序列。切割的先决条件是在靶DNA的下游存在保守的前间区序列邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，但通常NAG较低。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓的“种子序列”提供，它必须在RNA和靶DNA之间匹配。Cpf1和Csm1以与Cas9相似的方式起作用，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。

在又一个方面中，本文提供的烟草植物包含一个或多个pmt突变，并且进一步包含编码尼古丁去甲基化酶(例如，CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)的一个或多个基因座中的一个或多个突变，与在编码尼古丁去甲基化酶的一个或多个基因座中缺乏一个或多个突变的对照植物相比，所述突变使去甲烟碱的量降低(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面中，当在相当的条件下生长和调制时，与对照植物相比，所描述的烟草植物进一步包含降低的尼古丁脱甲基酶活性。

在一个方面中，pmt突变烟草植物进一步包含这样的突变，即，当在相当的条件下生长和加工时，所述突变能够产生假木贼碱水平低于来自野生型对照烟草植物的叶的假木贼碱水平低的叶。在另一个方面中，pmt突变烟草植物进一步包含这样的突变，即，在相当的条件下生长和加工时，所述突变能够产生假木贼碱水平低于来自野生型对照烟草植物的叶的假木贼碱水平的5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的叶。

在一个方面中，pmt突变烟草植物包含能够产生这样的叶的进一步的突变，即，当在相当的条件下生长和加工时，与来自对照烟草植物的叶相比，所述叶的新烟草碱水平降低大于2倍。在另一个方面中，pmt突变烟草植物包含能够产生这样的叶的进一步的突变，即，当在相当的条件下生长和加工时，与来自野生型对照烟草植物的叶相比，所述叶的新烟草碱水平降低大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13倍。在一个方面中，提供较低水平的新烟草碱的突变是在美国申请公开第2014/0283165号和美国申请公开第2016/0010103号中描述的突变。在另一个方面中，pmt突变体进一步包含喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)或喹啉酸合成酶(QS)基因中的突变。在进一步的方面中，pmt突变植物进一步包含抑制QPT或QS基因的表达或活性的转基因或突变。

在一个方面中，当在相当的条件下生长和加工时，pmt突变烟草植物进一步包含能够提供去甲烟碱水平低于来自野生型对照烟草植物的叶的去甲烟碱水平的80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％或35％的突变。

在一个方面中，pmt突变烟草植物能够产生总N-亚硝基去甲基尼古丁(NNN)水平为以下的调制叶：小于2、小于1.9、小于1.8、小于1.7、小于1.6、小于1.5、小于1.4、小于1.3、小于1.2、小于1.1、小于1.0、小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2、小于0.15、小于0.1或小于0.05ppm。

在另一个方面中，pmt突变烟草植物能够产生总NNN水平为以下的调制叶：2至0.05、1.9至0.05、1.8至0.05、1.7至0.05、1.6至0.05、1.5至0.05、1.4至0.05、1.3至0.05、1.2至0.05、1.1至0.05、1.0至0.05、0.9至0.05、0.8至0.05、0.7至0.05、0.6至0.05、0.5至0.05、0.4至0.05、0.3至0.05、0.2至0.05、0.15至0.05或0.1至0.05百万分之一(ppm)。

在一个方面中，pmt突变烟草植物能够产生总尼古丁衍生的亚硝胺酮(NNK)水平为以下的调制叶：小于2、小于1.9、小于1.8、小于1.7、小于1.6、小于1.5、小于1.4、小于1.3、小于1.2、小于1.1、小于1.0、小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2、小于0.15、小于0.1或小于0.05ppm。

在另一个方面中，pmt突变烟草植物能够产生总NNK水平为以下的调制叶：2至0.05、1.9至0.05、1.8至0.05、1.7至0.05、1.6至0.05、1.5至0.05、1.4至0.05、1.3至0.05、1.2至0.05、1.1至0.05、1.0至0.05、0.9至0.05、0.8至0.05、0.7至0.05、0.6至0.05、0.5至0.05、0.4至0.05、0.3至0.05、0.2至0.05、0.15至0.05或0.1至0.05ppm。

在一个方面中，pmt突变烟草植物进一步包含提供水平增加的一种或多种抗氧化剂的突变或转基因。在另一个方面中，pmt突变烟草植物进一步包含内源基因中的遗传修饰，并且与缺少遗传修饰的对照调制烟叶相比，在调制叶中进一步包含水平增加的一种或多种抗氧化剂，其中内源基因编码抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合。在进一步的方面中，pmt突变烟草植物进一步包含转基因，并且与缺乏转基因的对照调制烟叶相比，在调制叶中进一步包含水平增加的一种或多种抗氧化剂，其中所述转基因编码或直接调节抗氧化剂生物合成酶、抗氧化剂的调节转录因子、抗氧化剂转运蛋白、抗氧化剂代谢酶或其组合。在一个方面中，pmt突变烟草植物进一步包含表达一种或多种基因的转基因或同源转基因构建体，所述一种或多种基因选自由AtPAP1、NtAN2、NtAN1、NtJAF13、NtMyb3、分支酸变位酶和阿罗酸脱水酶(ADT)组成的群组。在另一个方面中，pmt突变烟草植物进一步包含一种或多种用于增加抗氧化剂或减少一种或多种TSNA的转基因或遗传修饰，如在WIPO公开第2018/067985号或美国公开第2018/0119163号中所描述的。

在一个方面中，所描述的烟草植物是修饰的烟草植物。如本文所使用的，在植物的上下文中，“修饰的”是指包含为了某些目的和超出天然多态性而引入的遗传改变的植物。

在一个方面中，所描述的烟草植物是同源转基因植物。如本文所使用的，“同源转基因”或“同源转基因的”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。在一个方面中，所提供的植物、植物细胞或植物基因组是同源转基因的。所提供的同源转基因植物、植物细胞和植物基因组可以导致即用型烟草品系。在另一个方面中，所提供的烟草植物不包含非烟草遗传材料或序列。

如本文所使用的，“基因表达”或基因的表达是指基因产物的生物合成或生产，包括基因产物的转录和/或翻译。

在一个方面中，所提供的烟草植物包含一个或多个pmt突变，并且进一步包含参与尼古丁生物合成或转运的一个或多个基因的降低的表达或活性。参与尼古丁生物合成的基因包括但不限于精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基胞嘧啶氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(PRAI)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尽管已经提出了两个候选基因(A622和NBB1)，但尚未阐明对烟酸衍生物和甲基吡咯鎓阳离子之间的缩合步骤进行催化的尼古丁合成酶。参见US 2007/0240728 A1和US 2008/0120737 A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白。此外，一些转运蛋白可能参与尼古丁的转运。已经克隆并表征了一种名为MATE的转运蛋白基因(Morita等人，PNAS106:2447-52(2009))。

在一个方面中，所提供的烟草植物包含一个或多个pmt突变，并且与对照烟草植物相比，进一步包含一个或多个基因的水平降低的mRNA、蛋白或两者，所述一个或多个基因编码选自由以下组成的群组的产物：MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。在另一个方面中，所提供的烟草植物包含一个或多个pmt突变，并且进一步包含直接抑制一个或多个基因的表达的转基因，所述一个或多个基因编码选自由以下组成的群组的产物：MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。在另一个方面中，所提供的烟草植物包含一个或多个pmt突变，并且进一步包含抑制一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变，所述一个或多个基因编码选自由以下组成的群组的产物：MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。

在一个方面中，所提供的烟草植物来自选自由以下组成的群组的烟草类型：烤烟、晾烟、深色晾烟、深色熏烟、Galpao烟和东方烟。在另一个方面中，所提供的烟草植物来自选自由以下组成的群组的烟草类型：白肋烟、马里兰烟和深色烟。

在一个方面中，所提供的烟草植物处于烤烟背景中或表现出本文所述的一种或多种烤烟特征。烤烟(也被称为弗吉尼亚或淡色烟)占世界烟草产量的约40％。烤烟通常也被称为“淡色烟”，因为它在调制期间呈现金黄色到深橙色。烤烟具有清淡的香气和味道。烤烟通常含糖量高且含油量低。主要的烤烟种植国为阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面中，在烤烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由以下组成的群组：CC 13、CC 27、CC 33、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC 102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT 220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236以及主要从前述任何一个品种衍生的任何品种。在另一个方面中，在烤烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由以下组成的群组：Coker 48、Coker 176、Coker 371-Gold、Coker 319、Coker 347、GL 939、K149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC 60、NC71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、McNair 373、McNair 944、Ox207、Ox 414NF、Reams 126、Reams 713、Reams 744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG 22、RG81、RG H4、RG H51、Speight H-20、Speight G-28、Speight G-58、Speight G-70、SpeightG-108、Speight G-l11、Speight G-l17、Speight 168、Speight 179、Speight NF-3、Va116、Va 182以及主要从前述任何一个品种衍生的任何品种。参见WO 2004/041006 A1。在进一步的方面中，在任何烤烟背景下，低生物碱或低尼古丁烟草植物、种子、杂交种、品种或品系选自由K326、K346和NC196组成的群组。

在一个方面中，所提供的烟草植物在晾烟背景下或表现出本文所述的一种或多种晾烟特征。晾烟包括白肋烟、马里兰烟和深色烟。共同的因素是调制主要在没有人为热源和湿度的情况下进行。白肋烟的颜色为从浅色到深棕色，含油量高，且含糖量低。白肋烟在烤房里晾制。主要的白肋烟种植国为阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。马里兰烟非常蓬松，具有良好的燃烧特性、低尼古丁和中性香气。主要的马里兰烟种植国包括美国和意大利。在一个方面中，白肋烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由以下组成的群组：Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。在进一步的方面中，在任何烤烟背景下，低生物碱或低尼古丁烟草植物、种子、杂交种、品种或品系选自由TN 90、KT 209、KT 206、KT212和HB 4488组成的群组。在另一个方面中，在马里兰烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md872和Md 341组成的群组。

在一个方面中，所提供的烟草植物在深色晾烟背景下或表现出本文所述的一种或多种深色晾烟特征。深色晾烟与其他类型的区别主要在于其调制过程，调制过程使深色晾烟具有中至深棕色和独特的香气。深色晾烟主要用于生产嚼烟和含烟。在一个方面中，在深色晾烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由以下组成的群组：Sumatra、Jatim、Dominican Cubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginia晒烟和Paraguan Passado。

在一个方面中，所提供的烟草植物在深色熏烟背景下或表现出本文所述的一种或多种深色熏烟特性。深色熏烟通常在封闭的调制房的地板上用低燃木熏制。它们的叶含糖量低，但尼古丁含量高。深色烤烟用于制造混合烟斗丝、卷烟、嚼烟、含烟和味道浓烈的雪茄烟。深色熏烟的主要种植地区是美国田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。在一个方面中，在深色的烤烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由以下组成的群组：窄叶Madole、改良的Madole、Tom Rosson Madole、Newton’s VH Madole、LittleCrittenden、Green Wood、Little Wood、Small Stalk Black Mammoth、DT 508、DT 518、DT592、KY 171、DF 911、DF 485、TN D94、TN D950、VA 309和VA 359。

在一个方面中，所提供的烟草植物在东方烟背景下或表现出本文所述的一种或多种东方烟特征。东方烟也被称为希腊、芳香和土耳其烟，因为它们通常生长在东地中海地区，诸如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚。今天的东方品种所特有的小植株和叶尺寸，以及其独特的香气特性，都是植物适应贫瘠的土壤和恶劣的气候条件的结果，在过去的许多世纪里，植物都是在这种气候条件下生长的。在一个方面中，在东方烟背景下，所提供的低生物碱或低尼古丁烟草植物或种子选自由以下组成的群组：Izmir、Katerini、Samsun、Basma和Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova、Sinop、Izmit、Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir和基本上衍生自前述品种中的任何一种的任何品种。

在一个方面中，低生物碱或低尼古丁烟草植物、种子、杂交种、品种或品系基本上来源于或在以下的遗传背景下：BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、窄叶Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal SmithMadole、OXFORD 207、`Perique`tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA309、或VA359、Maryland 609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。

所有前述提及的深色晾制、白肋、马里兰、深色熏制或东方类型的特定品种仅出于示例性目的列出。在本申请中还考虑了任何另外的深色晾制、白肋、马里兰、深色熏制、东方品种。

还提供了所描述的烟草植物的群体。在一个方面中，烟草植物的群体具有以下种植密度：每英亩约5,000至约8,000、约5,000至约7,600、约5,000至约7,200、约5,000至约6,800、约5,000至约6,400、约5,000至约6,000、约5,000至约5,600、约5,000至约5,200、约5,200至约8,000、约5,600至约8,000、约6,000至约8,000、约6,400至约8,000、约6,800至约8,000、约7,200至约8,000或约7,600至约8,000株植物。在另一个方面中，烟草植物的群体处于低至中等肥力的土壤类型中。

还提供了所述的来自烟草植物的种子的容器。本工艺的烟草种子的容器可以包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以容纳至少或大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或更多的种子。可替代地，容器可以容纳至少或大于约1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多的种子。烟草种子的容器可以是本领域中可获得的任何容器。作为非限制性示例，容器可以是盒、袋、包、小袋、带卷、管或瓶。

还提供了由所述的低生物碱或低尼古丁烟草植物制成的调制烟草材料。进一步提供了由所述具有较高水平的总生物碱或尼古丁的烟草植物制成的调制烟草材料。

“调制”是醇化过程，其减少水分并破坏叶绿素，使烟叶呈现金黄色，并通过这一过程将淀粉转化为糖。因此，与收获的初烤烟相比，调制烟草具有较高的还原糖含量和较低的淀粉含量。在一个方面中，所提供的初烤烟烟草可以使用常规手段来调制，例如，烘烤、烤房调制、熏制、晾制或晒制。对不同类型调制方法的描述，参见，例如Tso(1999，Chapter 1 inTobacco，Production，Chemistry and Technology，Davis&Nielsen，eds.，BlackwellPublishing，Oxford)。调制烟草通常在压缩条件下在木桶(例如，猪头桶)或纸板箱中醇化数年(例如，二至五年)，含水量范围为10％至约25％。参见，美国专利第4,516,590和5,372,149号。然后可以对调制和醇化的烟草进行进一步加工。进一步的加工包括在不同的温度下在引入或不引入蒸汽的情况下在真空下增温增湿烟草，巴氏杀菌和发酵。发酵通常的特征在于高的初始水分含量，热量产生以及10％至20％的干重损失。参见例如美国专利第4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149号；美国公开第2005/0178398号；和Tso(1999,Chapter 1 in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。调制、醇化和发酵的烟草可以被进一步加工(例如，切割、切碎、膨胀或混合)。参见例如美国专利第4,528,993、4,660,577和4,987,907号。在一个方面中，本公开的调制烟草材料是晒制的。在另一个方面中，本公开的调制烟草材料是烘烤的、晾制的或熏制的。

调制烟草上霉菌的存在会显著地降低调制叶的质量和可销售性(例如，叶等级)。霉菌生长是一个常见问题，其可以在约10℃(50°F)至32.2℃(90°F)的温度在高湿度(例如，相对湿度大于70％)的延长时间段期间发生。在较高的温度下，霉菌更容易存在。

与低生物碱烟草品种LA Burley 21(LA BU 21)相比，本文提供的在一个或多个PMT基因、两个或更多个PMT基因、三个或更多个PMT基因、四个或更多个PMT基因或五个PMT基因中包含突变体等位基因的烟草植物、品种和品系表现出降低的霉菌感染。类似地，与低生物碱烟草品种LA Burley 21(LA BU 21)相比，本文提供的包含下调一个或多个PMT基因、两个或更多个PMT基因、三个或更多个PMT基因、四个或更多个PMT基因或五个PMT基因的表达或翻译的RNAi构建体的烟草植物、品种和品系表现出降低的霉菌感染。

LA BU 21是一种低总生物碱烟草品系，其通过数次回交将来自古巴雪茄烟品种的低生物碱基因掺入到白肋烟21中而产生(Legg等人，Crop Science,10:212(1970))。其具有约0.2％的总生物碱(干重)，而其母体白肋烟21的总生物碱为约3.5％(干重)。LA BU 21具有远低于商业上可接受的标准品的叶等级。

在一个方面中，包含pmt1a的突变体等位基因的调制烟叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，包含pmt1b的突变体等位基因的调制烟叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，包含pmt2的突变体等位基因的调制烟叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，包含pmt3的突变体等位基因的调制烟叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，包含pmt4的突变体等位基因的调制烟叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，包含pmt1a的突变体等位基因、pmt1b的突变体等位基因、pmt2的突变体等位基因、pmt3的突变体等位基因和pmt4的突变体等位基因的调制烟叶不包含可观察到的霉菌感染。

在一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制烟叶相比，包含pmt1a的突变体等位基因的调制烟叶包含减少的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制烟叶相比，包含pmt1b的突变体等位基因的调制烟叶包含减少的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制烟叶相比，包含pmt2的突变体等位基因的调制烟叶包含减少的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制烟叶相比，包含pmt3的突变体等位基因的调制烟叶包含减少的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU21的对照调制烟叶相比，包含pmt4的突变体等位基因的调制烟叶包含减少的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制烟叶相比，包含pmt1a的突变体等位基因、pmt1b的突变体等位基因、pmt2的突变体等位基因、pmt3的突变体等位基因和pmt4的突变体等位基因的调制烟叶包含减少的霉菌感染。

在一个方面中，来自在表4A至4E、表10或表14中的任一个中提供的烟草植物、品种或品系的调制叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制烟叶相比，来自表4A至4E、表10或表14中的任一个中提供的烟草植物、品种或品系的调制叶包含减少的霉菌感染。

在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含表5A至5E和表12A至12E中的任一个中提供的一个或多个pmt突变的调制叶不包含可观察到的霉菌感染。在另一个方面中，与来自品种LA BU 21的对照调制叶相比，来自烟草植物、品种或品系的包含表5A至5E和表12A至12E中的任一个中提供的一个或多个pmt突变的调制叶包含减少的霉菌感染。

在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含pmt1a的突变体等位基因的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含pmt1b的突变体等位基因的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含pmt2的突变体等位基因的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含pmt3的突变体等位基因的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含pmt4的突变体等位基因的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。在另一个方面中，来自植物、品种或品系的包含pmt1a的突变体等位基因、pmt1b的突变体等位基因、pmt2的突变体等位基因、pmt3的突变体等位基因和pmt4的突变体等位基因的调制叶包含比来自品种LABU 21的对照调制叶更高的叶等级。

在一个方面中，来自表4A至4E、表10或表14中的任一个中提供的烟草植物、品种或品系的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。

在一个方面中，来自烟草植物、品种或品系的包含表5A至5E和表12A至12E中的任一个中提供的一个或多个pmt突变的调制叶包含比来自品种LA BU 21的对照调制叶更高的叶等级。

在一个方面中，“减少的霉菌感染”是指受感染叶的面积减少。在另一个方面中，“减少的霉菌感染”是指在受感染的叶上存活的霉菌孢子的数量减少。检测和计数活的霉菌孢子的标准方法在本领域中是已知的和可用的。

在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少1％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少2％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少3％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少4％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少5％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少10％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少15％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少20％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少25％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少30％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少35％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少40％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少50％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少60％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少70％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少75％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少80％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少90％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少至少95％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少100％。

在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至90％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至80％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至70％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至60％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至50％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至40％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至30％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至20％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少1％至10％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少10％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少20％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少30％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少40％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少50％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少60％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少70％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少80％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少90％至100％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少10％至75％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少25％至75％。在一个方面中，与对照叶相比，减少的霉菌感染包括受感染叶面积减少25％至50％。

在一个方面中，感染调制烟草的霉菌的属选自由枝孢霉、青霉、链格孢霉、曲霉菌和毛霉菌组成的群组。

从本公开的烟草品系、品种或杂交种获得的烟草材料可以用于制造烟草制品。如本文所使用的，“烟草制品”被定义为由烟草制成或衍生自烟草的旨在供人类使用或消费的任何制品。

所提供的烟草制品包括但不限于卷烟制品(例如，卷烟和比迪卷烟)、雪茄制品(例如，雪茄外包皮烟和小雪茄烟)、烟斗丝制品、源自烟草的制品、源自烟草的尼古丁制品、无烟气烟草制品(例如，湿烟粉、干烟粉和嚼烟)、烟膜、可咀嚼物、接片、成型部件、凝胶、可消耗单元、不溶性基质、中空形状、再造烟叶、膨胀烟叶等。参见例如美国专利公开第US 2006/0191548号。

如本文所使用的，“卷烟”是指具有“杆”和“填充物”的烟草制品。卷烟“杆”包括卷烟纸、过滤嘴、滤棒成型纸(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填充物)固定在过滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填充物”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟叶和膨胀烟叶，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随辊压在卷烟纸内的烟草的其他香料)，(3)料液，(4)香精，和(5)所有其他添加剂(它们被混合到烟草和替代品中并辊压到卷烟中)。

如本文所使用的，“再造烟叶”是指烟草填充物的一部分，其由烟草粉尘和其他烟草废料制成，被加工成片状并切割成条，以类似于烟草。除了节约成本之外，再造烟叶还非常重要，因为它通过利用氨和糖之间的反应来加工风味形成，对卷烟口味做出贡献。

如本文所使用的，“膨胀烟叶”是指烟草填充物的一部分，其通过合适气体的膨胀进行加工，使得烟草被“膨化”，导致密度降低和填充能力更大。它减少了卷烟中使用的烟草的重量。

来源于本公开的植物的烟草制品还包括卷烟和其他燃吸品，特别是包括过滤元件的那些燃吸品，其中可燃吸材料的杆包括在叶组配方内的调制烟草。在一个方面中，本公开的烟草制品选自由以下组成的群组：小雪茄烟、非通风的凹槽过滤卷烟、通风的凹槽过滤卷烟、雪茄烟、含烟、烟斗丝、雪茄烟草、卷烟烟草、嚼烟、烟叶、水烟烟草、切碎烟丝和烟丝组成的群组。在另一个方面中，本公开的烟草制品是无烟气烟草制品。无烟气烟草制品不燃烧，并且包括但不限于嚼烟、潮湿的无烟气烟草、含烟和干烟粉。嚼烟是粗分的烟叶，其通常包装在大的袋状包装中，并且以板烟条(plug)或旋转切片(twist)使用。潮湿的无烟气烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，其以松散形式或以袋装形式提供并且通常包装在圆形罐中，用作夹袋或放在成年烟草消费者的脸颊与牙龈之间的袋中。含烟是一种经过热处理的无烟气烟草。干烟粉是放入口腔或经鼻使用的精细研磨的烟草。在进一步的方面中，本公开的烟草制品选自由松散的嚼烟、板烟条嚼烟、湿烟粉和鼻烟组成的群组。在又一个方面中，本公开的烟草制品选自由电子加热卷烟、电子烟、电子蒸发装置组成的群组。

在一个方面中，本公开的烟草制品可以是混合烟草制品。在另一个方面中，本公开的烟草制品可以是低尼古丁烟草制品。在进一步的方面中，本公开的烟草制品可以包含低于约3mg/g水平的去甲烟碱。例如，这种制品中的去甲烟碱含量可以是3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750μg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g或不可检测的。

在一个方面中，提供的调制烟草材料或烟草制品的平均尼古丁或总生物碱水平选自由以下组成的群组：基于干重的约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面中，所提供的调制烟草材料或烟草制品的平均尼古丁或总生物碱水平选自由以下组成的群组：基于干重的约0.01％至0.02％、0.02％至0.05％、0.05％至0.75％、0.75％至0.1％、0.1％至0.15％、0.15％至0.2％、0.2％至0.3％、0.3％至0.35％、0.35％至0.4％、0.4％至0.5％、0.5％至0.6％、0.6％至0.7％、0.7％至0.8％、0.8％至0.9％、0.9％至1％、1％至1.1％、1.1％至1.2％、1.2％至1.3％、1.3％至1.4％、1.4％至1.5％、1.5％至1.6％、1.6％至1.7％、1.7％至1.8％、1.8％至1.9％、1.9％至2％、2％至2.1％、2.1％至2.2％、2.2％至2.3％、2.3％至2.4％、2.4％至2.5％、2.5％至2.6％、2.6％至2.7％、2.7％至2.8％、2.8％至2.9％、2.9％至3％、3％至3.1％、3.1％至3.2％、3.2％至3.3％、3.3％至3.4％、3.4％至3.5％和3.5％至3.6％。在进一步的方面中，所提供的调制烟草材料或烟草制品的平均尼古丁或总生物碱水平选自由以下组成的群组：基于干重的约0.01％至0.1％、0.02％至0.2％、0.03％至0.3％、0.04％至0.4％、0.05％至0.5％、0.75％至1％、0.1％至1.5％、0.15％至2％、0.2％至3％和0.3％至3.5％。

本公开还提供了用于培育包含所需水平的总生物碱或尼古丁，例如低尼古丁或无尼古丁的烟草品系、栽培品种或品种的方法。培育可以通过任何已知的程序进行。DNA指纹、SNP作图、单倍型作图或类似技术可以用于标记辅助选择(MAS)培育程序，以将所需的性状或等位基因转移或培育到烟草植物中。例如，育种者可以使用F1杂交种植物或进一步将F1杂交种植物与具有农艺学上期望的基因型的其他供体植物杂交，在F₂或回交世代中产生分离群体。使用本领域中已知或本文列出的技术之一，可以筛选F₂或回交世代中的植物的所需的农艺性状或所需的化学剖面。根据预期的遗传模式或所用的MAS技术，可以在每个回交周期前对所选的植物进行自花授粉，以帮助鉴定所需的单独的植物。可以重复回交或其他育种程序，直到恢复轮回亲本的所需表型。本公开中的轮回亲本可以是烘烤品种、白肋烟品种、深色晾制品种、深色熏制品种或东方品种。其他育种技术可以在例如Wernsman,E.A.和Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698 In:CultivarDevelopment.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Go.,Inc.,NewYork,N.Y.,(其通过引用以其整体并入本文)中找到。

使用所述烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的可用的品系、栽培品种、变种、子代、近交系和杂交种。如本文所使用的，术语“品种”是指共享使它们与相同物种的其他植物分离的恒定特征的植物群体。尽管并不总是如此，但品种经常是商业化销售的。虽然具有一个或多个区别性的性状，但品种的进一步的特征是该品种内的个体之间的总体变异非常小。“纯品系”品种可以通过几代自花传粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本进行营养繁殖而产生。品种本质上可以衍生自另一品系或品种。如由国际公约对植物新品种保护所定义的(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)，品种“基本上衍生”自初始品种，如果：a)它主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由初始品种的基因型或基因型的组合产生的必要特征的表达；b)它与初始品种有明显区别；以及c)除了由衍生行为产生的差异，它在由初始品种的基因型或基因型的组合导致的必要特征的表达中与初始品种相符合。例如，可以通过选择天然或诱导的突变体、体细胞无性变体、来自初始品种植物的变异个体、回交或转化来获得基本上衍生的品种。认为第一烟草品种和第二烟草品种(第一烟草品种基本上衍生自第二烟草品种)具有基本上相同的遗传背景。与品种不同，“品系”最通常是指非商业化使用，例如用于植物研究的一组植物。品系通常在个体间的一个或多个目标性状上显示非常小的总体差异，尽管在个体间其他性状可能存在一些差异。

在一个方面中，本公开提供了烟草植物、品种、品系或细胞，其包含表5A至5E和表12A至12E中的任一个中提供的一种或多种pmt突变。

在另一个方面中，本公开提供了来源于表4A至4E、表10或表14中的任一个中提供的任何烟草植物、品种或品系的烟草植物、品种、品系或细胞。

在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH203，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH341，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1678，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1680，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1804，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1898，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH207，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH342，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH343，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH348，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH349，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH355，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH359，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH64，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH682，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH692，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH697，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH922，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH957，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1808，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1810，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1886，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1888和，由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1889，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH189，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1893，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1901，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1902，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH3，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH125，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH208，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH403，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH414，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH434，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH436，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH437，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH449，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH706，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH709，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH710，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH716，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH729，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH731，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH752，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH756，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH768，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH771，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH776，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH800，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH818，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH10，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH1004，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH1033，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH132，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH134，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH217，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH456，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH457，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH460，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH465，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH71，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH830，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH831，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH836，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH841，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH974，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH981，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH994，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1905，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH128，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH130，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH131，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH133，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH136，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH216，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH227，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH5，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH6，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH65，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH66，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH69，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH72，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH73，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH74，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH78，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH79，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH8，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH9，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1696，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1717，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1719，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1729，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1736，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1737，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1739，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1740，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1835，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1848，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1849，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1912，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1937，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1940，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1943，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1944，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH1051，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH22，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH34，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH473，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH49，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH50，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH848，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH850，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH851，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1699，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1708，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1722，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1724，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1725，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1845，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1846，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1847，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1911，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1912，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1915，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1918，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1928，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1932，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1933，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1936，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH20，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH28，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH31，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH47，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH51，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH52，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS107，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS106，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS115，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1809-13，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS111，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS112，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1678-60，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS131，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH709-01，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH709-08，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH414-11，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH414-19，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH437-04，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH437-08，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH437-32，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH437-39，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH449-26，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH449-33，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH125-48，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS102，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS103，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1719-30，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1740-36，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1698-22，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1700-13，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1702-17，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1849-01，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1849-48，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系17GH1737-24，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS118，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS133，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS120，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH1108-07，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH2162，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS164，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS163，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS146，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS147，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS150，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS151，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS148，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS149，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS152，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS153，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS143，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH2169，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH2171，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS165，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系CS118，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。在一个方面中，本公开提供了烟草品系18GH2254-7，和由其衍生的F₁或F₂烟草植物或雄性不育烟草植物。

在一个方面中，本公开公开了一种将低尼古丁性状导入到烟草品种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低尼古丁性状的第一烟草品种与不包含低尼古丁性状的第二烟草品种杂交，以产生一种或多种子代烟草植物；(b)对一种或多种子代烟草植物进行pmt突变体等位基因的基因分型，所述pmt突变体等位基因选自由表4A至4E、表5A至5E、表10和表12A至12E中列出的那些；以及(c)选择包含pmt突变体等位基因的子代烟草植物。在另一个方面中，这些方法进一步包括将所选子代烟草植物与第二烟草品种回交。在进一步的方面中，这些方法进一步包括：(d)将所选子代植物与其自身或与第二烟草品种杂交以产生一个或多个进一步的子代烟草植物；和(e)选择包含低尼古丁性状的进一步的子代烟草植物。在一个方面中，选择的步骤(e)包括标记辅助选择。在一个方面中，这些方法产生包含低尼古丁性状的单基因转化。在一个方面中，这些方法产生包含pmt突变体等位基因的单基因转化。在一个方面中，第二烟草品种是优良品种。在另一个方面中，这些方法的基因型分型步骤涉及一种或多种分子标记物测定。在另一个方面中，基因分型可以涉及多态性标记物，其包括选自由以下组成的群组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。

如本文所使用的，“基因座”是其中多态性核酸、性状决定簇、基因或标记物所在的染色体基因座或区域。“基因座”可以由两条同源染色体共享，以指代它们相应的基因座或区域。如本文所使用的，“等位基因”是指基因或特定基因座处的替代核酸序列(例如，与相同基因或基因座的其他等位基因不同的基因或基因座的核酸序列)。如果相对于野生型等位基因在突变体等位基因的核酸序列中存在一个或多个突变或编辑，则可以认为这种等位基因是(i)野生型或(ii)突变体。相对于野生型等位基因，基因的突变体等位基因可能具有降低或消除的基因活性或表达水平。对于二倍体生物体，诸如烟草，第一等位基因可以出现在一条染色体上，并且第二等位基因可以出现在第二条同源染色体上的同一基因座处。如果植物的一条染色体上某个基因座处的一个等位基因是突变体等位基因，而所述植物的同源染色体上的另一个相应等位基因是野生型，那么所述植物被描述为所述突变体等位基因的杂合子。然而，如果基因座处的两个等位基因都是突变体等位基因，那么所述植物被描述为对于突变体等位基因的纯合子。基因座处的突变体等位基因的植物纯合子可以包含相同的突变体等位基因或不同的突变体等位基因(如果是杂等位基因的或双等位基因的)。

如本文所使用的，“导入”或“将……导入”是指遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递到另一个遗传背景。

如本文所使用的，“杂交的”或“杂交”是指通过受精(例如，细胞、种子或植物)产生子代，并且包括在植物(有性)和自花受精(自交)之间的杂交。

如本文所使用的，“回交(backcross)”和“回交(backcrossing)”是指后代植物被反复地杂交回其亲本之一的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待导入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被导入其中的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，以此类推。在一些方面中，反复地进行回交，其中每个连续回交世代的后代个体本身回交至相同的亲本基因型。

如本文所使用的，“单基因转化的”或“单基因转化”是指使用被称为回交的植物育种技术或通过基因工程改造开发的植物，其中除了通过回交技术或通过遗传工程改造转移到品种的单基因之外，恢复了品种基本上全部的所需形态和生理特征。

如本文所使用的，“优良品种”意指由育种和选择得到的农艺学表现优异的任何品种。

如本文所使用的，在标记辅助选择或育种的上下文中的“选择(selecting)”或“选择(selection)”是指基于某些预定标准，一般从群体中挑选或选取所需个体的行为。

如本文所使用的，术语“性状”是指可以被基因型影响的细胞或生物体的一种或多种可检测特征。表型可以通过裸眼，或通过本领域已知的任何其他评估手段来观察，例如显微镜检查、生化分析、遗传分析、特定疾病耐受性的测定等。在一些情况下，表型直接由单个基因或遗传基因座控制，例如“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

如本文所使用的，“标记物测定”意指用于使用特定的方法来检测特定基因座处的多态性的方法，例如测量至少一种表型(诸如种子颜色、花的颜色或其他视觉可检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术等。

如本文所使用的，“标记辅助选择”(MAS)是基于标记物基因型选择表型的过程。“标记辅助选择育种”是指通过检测来自植物的一种或多种核酸选择一株植物或多株植物中所需的一个或多个性状的过程，其中核酸与所需性状相关，然后选择具有那些一种或多种核酸的植物或种质。

如本文所使用的，“多态性”是指群体中一种或多种变异的存在。多态性可以表现为核酸的核苷酸序列中的变异或蛋白的氨基酸序列中的变异。多态性包括在一个或多个个体的群体中的一个或多个基因座处存在核酸序列或核酸特征的一个或多个变异。变异可以包括但不限于一个或多个核苷酸碱基的改变、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可以通过突变从核酸复制中的随机过程产生作为移动基因组元件的结果、从拷贝数变异产生以及在减数分裂过程期间(诸如不等交换、基因组复制以及染色体断裂和融合)产生。变异可以在群体内普遍发现或可能以低频率存在，前者在一般的植物育种中具有更大的效用，而后者可能与罕见但重要的表型变异相关。可用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。基因标记物、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5'非翻译区、基因的3'非翻译区、微RNA、siRNA、耐受基因座、卫星标记物、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式也可以包含多态性。另外，前述拷贝数的存在、不存在或变异可以包含多态性。

如本文所使用的，“SNP”或“单核苷酸多态性”意指当基因组序列中的单个核苷酸(A、T、C或G)被改变或可变时发生的序列变异。当SNP被映射到基因组上的位点时，存在“SNP标记物”。

如本文所使用的，“标记物”或“分子标记物”或“标记物基因座”是用于表示足够独特地表征基因组上的特定基因座的核酸或氨基酸序列的术语。任何可检测的多态性性状都可以用作标记物，只要它是差异性遗传的并且与感兴趣的表型性状表现出连锁不平衡。因此，每个标记物都指示DNA的特定片段，具有独特的核苷酸序列。映射位置提供特定标记物相对于彼此的相对位置的测量。当性状被描述为与给定的标记物相关时，应当理解，其序列影响性状的实际DNA片段通常与标记物共分离。如果在性状的两侧都鉴定出了标记物，则可以获得更精确且更确切的性状定位。通过测量杂交的子代中标记物的出现，可以通过相对简单的分子测试来检测性状的存在，而不需要实际评估性状本身的出现(其可能是困难的且耗时的)，因为性状的实际评估需要植物生长到其中可以表达性状的阶段和/或环境条件。

应当理解，本公开的任何烟草植物可以进一步包含另外的农艺上期望的性状，例如，通过使用本领域中已知的技术用遗传构建体或转基因转化。非限制性地，期望性状的示例是除草剂抗性、害虫抗性、疾病抗性；高产量；高等级指标值；调制性；调制质量；机械收获性；持有能力；叶质量；高度、植株成熟(例如，早熟、早至中熟、中熟、中至晚熟或晚熟)；柄尺寸(例如，小、中或大柄)；或每株植物的叶数目(例如，小的(例如，5-10个叶)、中的(例如，11-15个叶)或大的(例如，16-21个叶数目)或任意组合。在一个方面中，所公开的低尼古丁或无尼古丁的烟草植物或种子包含一种或多种表达一种或多种杀虫蛋白的转基因，所述杀虫蛋白诸如例如是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的晶体蛋白或蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的植物杀虫蛋白，诸如VIP3(参见例如，Estruch等人，(1997)Nat.Biotechnol.15:137)。在另一个方面中，烟草植物进一步包含赋予对褐茎腐病的抗性(美国专利第5,689,035号)或对囊肿线虫的抗性(美国专利第5,491,081号)的导入的性状。

本公开还提供了pmt突变烟草植物，其包含改变的尼古丁或总生物碱水平，但产量与没有这种尼古丁水平改变的相应初始烟草植物的产量相当。在一个方面中，pmt突变品种提供选自由以下组成的群组的产量：约1200至3500、1300至3400、1400至3300、1500至3200、1600至3100、1700至3000、1800至2900、1900至2800、2000至2700、2100至2600、2200至2500以及2300至2400lbs/英亩。在另一个方面中，pmt突变烟草品种提供选自由以下组成的群组的产量：约1200至3500、1300至3500、1400至3500、1500至3500、1600至3500、1700至3500、1800至3500、1900至3500、2000至3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500以及3100至3500lbs/英亩。在进一步的方面中，pmt突变烟草植物提供的产量为对照植物产量的65％至130％、70％至130％、75％至130％、80％至130％、85％至130％、90％至130％、95％至130％、100％至130％、105％至130％、110％至130％、115％至130％或120％至130％，所述对照植物除pmt突变外具有基本上相同的遗传背景。在进一步的方面中，pmt突变烟草植物提供的产量为对照植物的产量的70％至125％、75％至120％、80％至115％、85％至110％或90％至100％，所述对照植物除pmt突变外具有基本上相同的遗传背景。

在一个方面中，所公开的烟草植物(例如，低尼古丁、无尼古丁或低生物碱烟草品种)包括赋予所需的性状(例如，低尼古丁、无尼古丁或低生物碱)的修饰，而基本上不影响选自由以下组成的群组的性状：产量、成熟和衰老、对昆虫虫食的易感性、打顶后的多胺含量、叶绿素水平、每单位叶面积的叶肉细胞数量和调制后的最终制品质量。

在一个方面中，所公开的烟草植物包括赋予所需的性状(例如，低尼古丁、无尼古丁或低生物碱)的修饰，并进一步包括与未修饰的对照植物基本上相当的性状，其中所述性状选自由以下组成的群组：产量、成熟和衰老、对昆虫虫食的易感性、打顶后的多胺含量、叶绿素水平、每单位叶面积叶肉细胞数量和调制后的最终制品质量。

在一个方面中，所公开的烟草植物包括赋予所需的性状(例如，低尼古丁、无尼古丁或低生物碱)的修饰，并且进一步包括以下产量：相对于未修饰的对照植物的产量大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。在一个方面中，所公开的烟草植物包括赋予所需的性状(例如，低尼古丁、无尼古丁或低生物碱)的修饰，并且进一步包括以下产量：相对于未修饰的对照植物的产量的70％至140％、75％至135％、80％至130％、85％至125％、90％至120％、95％至115％或100％至110％。在一个方面中，所公开的烟草植物包括赋予所需的性状(例如，低尼古丁、无尼古丁或低生物碱)的修饰，并且进一步包括以下产量：相对于未修饰的对照植物的产量的70％至80％、75％至85％、80％至90％、85％至95％、90％至100％、95％至105％、105％至115％、110％至120％、115％至125％、120％至130％、125％至135％、或130％至140％。

在一个方面中，所公开的低尼古丁或无尼古丁的烟草品种适于机器收获。在另一个方面中，公开的低尼古丁或无尼古丁烟草品种机械收获。

在一个方面中，所提供的烟草植物是杂交种植物。可以通过以下来产生杂交种：防止第一品种的母本植物(例如，种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的父本植物的花粉使母本植物受精，并且允许在雌植株上形成F1杂交种种子。可以通过在花发育的早期阶段将花去雄来防止雌植株的自花授粉。可替代地，可以使用雄性不育的形式防止在母本植物上的花粉形成。例如，雄性不育可以由雄性不育(MS)或转基因雄性不育(其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成)或自交不亲和性产生。含有MS的母本植物是特别有用的。在其中母本植物是MS的方面中，可以从雄性可育植物收获花粉并人工施用到MS母本植物的柱头上，并收获所得的F1种子。

植物可以用于形成单交烟草F1杂交种。将来自父本植物的花粉人工转移到去雄的母本植物或雄性不育的母本植物以形成F1种子。可替代地，可以进行三交，其中将单交F1杂交种用作母本，并与不同的父本杂交。作为另一种选择，可以生成双交杂交种，其中两个不同的单交F1子代本身杂交。特别有利地是，自交不相容性可以在形成双交杂交种时用于防止母本的自花授粉。

在一个方面中，低尼古丁或无尼古丁烟草品种是雄性不育的。在另一个方面中，低尼古丁或无尼古丁烟草品种是细胞质雄性不育的。雄性不育的烟草植物可以通过本领域已知的任何方法产生。产生雄性不育烟草的方法描述在Wernsman,E.A.,和Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698 In:Cultivar Development.CropSpecies.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp中。

在一个方面中，本公开提供了一种雄性不育烟草植物、品种或品系，其包含表5A至5E和表12A至12E中的任一个中提供的一个或多个pmt突变。

在另一个方面中，本公开提供了一种雄性不育烟草植物、品种或品系，其衍生自表4A至4E、表10或表14中的任一个中提供的任何烟草植物、品种或品系。

在一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS11。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS12。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS13。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS14。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS15。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS16。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS17。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dCS18。在另一个方面中，本公开提供了雄性不育品系dS697。

在进一步的方面中，所提供的烟草部分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚果、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、嫩芽、细胞和原生质体。在一个方面中，所提供的烟草部分不包括种子。在一个方面中，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面中，本公开还提供了作为繁殖材料并且介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面中，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面中，本公开提供了体细胞烟草植物细胞。与繁殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。

细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、嫩芽、茎、荚果、花、花序、柄、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、花萼、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物叶绿体。在进一步的方面中，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、叶毛或根毛、储藏根或块茎。在另一个方面中，本公开提供了烟草原生质体。

本领域技术人员理解，烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。在一个方面中，本公开提供了烟草胚乳。在另一个方面中，本公开提供了烟草胚乳细胞。在进一步的方面中，本公开提供了雄性或雌性不育烟草植物，其在没有人工干预的情况下不能繁殖。

在一个方面中，本公开提供了一种核酸分子，其包含与选自由SEQ ID NOs:1至10组成的群组的序列及其片段的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个方面中，本公开提供了一种多肽或蛋白质，其包含与选自由SEQ ID NOs:11至15组成的群组的氨基酸序列的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

如本文所使用的，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中的术语“序列同一性”或“同一性”是指当在特定的比较窗口上比对最大一致性时，两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比用于指蛋白时，可以认识到，不相同的残基位置经常因保守的氨基酸取代而不同，其中用氨基酸残基取代具有相似化学性能(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并且因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以上调序列同一性百分比以校正取代的保守性质。

本公开进一步提供了一种从公开的烟草植物制造包含烟草材料的烟草制品的方法。在一个方面中，方法包括增温增湿由烟草植物制备的醇化烟草材料，以将其含水量从约12.5％-约13.5％增加至约21％，混合经增温增湿的烟草材料以生产所需的混合物。在一个方面中，制造烟草制品的方法进一步包含对混合物进行加料或加香。通常，在加料过程中，向混合物中添加料液或调味材料，以通过平衡化学组成来提高其质量，并开发某些所需的风味特性。关于加料过程的进一步细节可以在Tobacco Production,Chemistry andTechnology,Edited by L.Davis and M.Nielsen,Blackwell Science,1999中找到。

所提供的烟草材料还可以使用包括但不限于热处理(例如，熟化、调制)、加香、酶处理、膨胀和/或调制的方法加工。可以使用这些技术来加工发酵的烟草和未发酵的烟草。合适的加工烟草的示例包括深色晾制、深色熏制、白肋、烘烤和雪茄茄芯或茄衣，以及来自全叶去梗操作的制品。在一个方面中，以鲜重计，烟草纤维包括高达70％的深色烟。例如，如在美国公开第2004/0118422或2005/0178398号中所述，烟草可以通过加热、发酵(sweating)和/或巴氏消毒步骤进行调节。

所提供的烟草材料可以经历发酵。通常，发酵的特征在于高的初始含水量、热产生、10-20％的干重损失。参见，例如美国专利第4,528,993、4,660,577、4,848,373和5,372,149号。除了改变叶的香气外，发酵还可以改变叶的颜色、质地或两者。并且，在发酵过程期间，可以产生逸出气体，可以吸收氧气，可以改变pH，并且可以改变保留的水量。参见，例如美国公开第2005/0178398号和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistryand Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。调制的、或调制并且发酵的烟草可以在引入到口用型制品中之前被进一步加工(例如，切丝、膨化、混合、研磨或粉碎)。在一些情况下，在与共聚物和任选的调味剂和其他添加剂混合之前，烟草是烘箱挥发物含量为48-50重量％的长切丝发酵的调制湿烟草。

在一个方面中，可以将所提供的烟草材料加工成所需的尺寸。在一个方面中，可以将烟草纤维加工成小于200微米的平均纤维尺寸。在一个方面中，烟草纤维为75-125微米。在另一个方面中，将烟草纤维加工成具有75微米或更小的尺寸。在一个方面中，烟草纤维包括长切烟丝，其可以被切丝或切碎成约10丝/英寸至约110丝/英寸的宽度和约0.1英寸至高达约1英寸的长度。双切丝烟草纤维可以具有一定范围的颗粒尺寸，使得双切丝烟草纤维的约70％落入-20目至80目的网目尺寸中。

可以将所提供的烟草材料加工成具有约10重量％或更大；约20重量％或更大；约40重量％或更大；约15重量％-约25重量％；约20重量％-约30重量％；约30重量％-约50重量％；约45重量％-约65重量％或约50重量％-约60重量％的总烘箱挥发物含量。本领域技术人员将会理解，“湿”烟草通常是指烘箱挥发物含量为约40重量％-约60重量％(例如，约45重量％-约55重量％或约50重量％)的烟草。如本文所使用的，通过计算样品在预热的强力通风烘箱中在110℃下干燥3.25小时之后的重量损失百分比来确定“烘箱挥发物”。与用于制备口用型制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量相比，口用型制品可以具有不同的总体烘箱挥发物含量。所描述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。

现在已经一般性地描述了本公开，通过参考以下实例将更容易理解本公开，这些实例是以说明的方式提供的，并且不旨在限制本公开，除非特别说明。

实例

实例1：五个PMT基因的表达谱。

尼古丁的生物合成始于多胺腐胺通过腐胺N-甲基转移酶(PMT)转化为N-甲基腐胺。这是使前体代谢物参与尼古丁生物合成的步骤。编码PMT(PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4)的基因存在于烟草(Nicotiana tabacum)基因组中。表1A列出了五个PMT基因的基因组DNA序列、cDNA序列和蛋白质序列。表1B和1C提供了五个PMT基因之间的序列同一性。从打顶前到收获时的混合表达水平提供了以下支持，即，不受任何特定理论的限制，PMT1a和PMT3代表两个主要的PMT基因(图1)。

表1A：五个烟草PMT基因的序列。

表1B：由Clustal 2.1确定的五个烟草PMT基因间的cDNA序列同一性

表1C：由Clustal 2.1确定的五个烟草PMT基因间的蛋白序列同一性

表1D：PMT1b基因组序列(SEQ ID No.1)注释。

表1E：PMT1b基因组序列(SEQ ID No.2)注释。

表1F：PMT2基因组序列(SEQ ID No.3)注释。

表1G：PMT3基因组序列(SEQ ID No.4)注释。

表1H：PMT4基因组序列(SEQ ID No.5)注释。

实例2：PMT基因组编辑和烟草品系开发

通过编辑各种PMT基因来产生PMT敲除突变体。使用聚乙二醇(PEG)用编码基因组编辑技术1(GET 1)蛋白质或基因组编辑技术(GET)2蛋白的质粒和靶向PMT基因的特定导向RNA(gRNA)在所需的位置转染烟草原生质体。表2列出了用于PMT编辑的gRNA序列。将一些gRNA(例如，Nos.6和7)混合在一起，以用于在单次转染中靶向多个PMT基因。

然后，将转染的原生质体固定在1％琼脂糖珠中并进行组织培养。当愈伤组织生长到直径约1mm时，它们被铺在TOM2平板上。使用片段分析筛选愈伤组织在目标位置的插入或缺失(indel)。选择与野生型对照相比显示出尺寸偏移的候选者用于进一步培养，并再次通过片段分析测试随后的芽，以确认indel的存在。将生根的芽盆栽并对目标位置进行测序，以确定缺失的确切序列。收获来自每株植物的幼叶，并使用phirekit对PMT片段进行PCR扩增。对每一品系的PMT文库进行索引，并使用Miseq对384个品系进行汇总和测序。

进行SNP分析，以确定精确编辑的pmt突变体等位基因序列和每个PMT基因座处的合子状态。表3提供了代表性编辑的植物的合子信息。表4A至4E提供了各种烟草品种(例如，K326、TN90、NLM、东方)的各编辑的品系的indel序列信息。表5A至5E提供了来自每个pmt突变体等位基因的约40个核苷酸的基因组序列，其中编辑的位点位于基因组序列的中间(例如，在缺失的或插入的序列位点每侧的20个核苷酸)。

表2：在2种基因组编辑技术中使用的gRNA序列及其靶基因。“Y”表示gRNA靶向该PMT基因，而“-”表示gRNA不靶向该PMT基因。

表3：通过使用GET2进行基因组编辑产生的各种背景下所选的pmt突变体中各个PMT基因座的合子性。数字一(1)表示单个突变体等位基因的纯合子。数字2至5表示具有2至5个indel的杂等位基因组合。连字符表示无数据。详细的基因型信息在表4A至4D中示出。

实例3：PMT编辑的品系的生物碱分析

基因组编辑的烟草植物与对照一起在温室中用75PPM肥料种植在10”盆中。在开花期，对植物进行打顶，并且在打顶后两周从来自顶部的3、4、5片叶采集叶片样品，并使用符合CORESTA方法62(2005年2月，Determination of Nicotine in Tobacco and TobaccoProducts by Gas Chromatographic Analysis)和美国疾病控制与预防中心1999年3月23日在联邦公报第64卷第55期上发表的Protocol for Analysis of Nicotine，TotalMoisture and pH in Smokeless Tobacco Products(以及2009年1月7日第74卷第4期修订版))中规定的方法测定生物碱含量(表6A至6C)。

简而言之，使用液/液提取法将约0.5g的烟草提取到含有内标物的有机溶剂中，并且通过气相色谱法(GC)利用火焰离子化检测(FID)进行分析。结果可以按原样或干重的重量百分比(Wt％)报告。基于干重来报告数据需要测定烘箱挥发物(OV)。除非另有说明，否则本文所示的总生物碱水平或尼古丁水平或者单独的生物碱水平或尼古丁水平均基于干重(例如，总生物碱百分比或尼古丁百分比)。

还在田间种植、收获植物，并测试调制烟草中的生物碱和TSNA水平。还评估了PMT编辑的植物的叶产量和叶等级。进一步地，产生并测试了单独的PMT基因的不同突变体组合(例如，单、双、三或四突变体)。

实例4：将五pmt敲除突变体与其他低生物碱烟草植物进行比较。

五pmt敲除突变体品系CS15(对于基因型，参见表4E，在NLM(Ph Ph)背景下)与PMTRNAi转基因系(在VA359背景下，如在US 2015/0322451中所述)和低尼古丁KY171(“LNKY171”)品种(带有nic1和nic2双突变的KY171背景)并排生长。叶被收割并通过深色熏制法调制。分析每个品系的尼古丁和总生物碱水平、叶产量和叶质量(图2至5)。数据表明，通过编辑所有五个PMT基因来抑制PMT基因活性能降低尼古丁水平，而不损害叶产量或质量。

实例5：获得在一个或多个PMT基因中具有编辑的突变体等位基因的烟草品系。

从表3中列出的烟草品系获得在单独的PMT基因或PMT基因的选定组合中具有突变的烟草品系。将五、四、三或双突变体(分别在五个、四个、三个或两个PMT基因中具有突变)与未突变的对照品系杂交，并为特定的PMT突变组合选择分离的子代植物。表7A至7E表示所获得的可能的突变体组合。对于突变，每个突变的基因可以是纯合子或杂合子。表4A至4E和表10中列出的每种突变体等位基因均可以用于产生单、双、三、五或四突变体。在表9A至9E中列出了示例性的单独的pmt突变体等位基因。

实例6：通过将pmt突变与其他基因中的突变相结合以进一步减少总生物碱。

为了进一步减少总生物碱和/或选定的单独的生物碱，将pmt突变体与烟草中生物碱生物合成相关的另外的基因中的突变相结合，诸如喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)或喹啉酸合酶(QS)。简而言之，基因编辑用于在期望的pmt突变体背景(例如，四或五pmt突变体)下突变选择的QPT和/或QS基因。在得到的组合的qpt/pmt或qs/pmt突变体中，在调制烟草中对生物碱和TSNA水平进行测试。还评估了叶产量和叶等级。

表6A：K326中PMT编辑的品系中的生物碱水平(本文及表6B、6C和7所示为每克叶片的重量百分比(干重))

表6B：TN90中PMT编辑的品系中的生物碱水平

表6C：窄叶Madole(NLM)中PMT编辑的品系中的生物碱水平

表7：不同品种五pmt敲除突变体中尼古丁和总生物碱水平的相对变化。尼古丁和总生物碱的平均百分比水平根据来自如表6A至6C所示的单独的品系的百分比水平数据来计算。相对变化反映了五pmt突变体相对于其对照的尼古丁或总生物碱水平。

表8A：用五个PMT基因的各种基因型组合(单基因突变)获得的突变体的列表

表8B：用五个PMT基因的各种基因型组合(双基因突变)获得的突变体的列表

表8C：用五个PMT基因的各种基因型组合(三基因组合)获得的突变体的列表

表8D：用五个PMT基因的各种基因型组合(四基因组合)获得的突变体的列表

表8E：用五个PMT基因的各种基因型组合(五基因组合)获得的突变体的列表

实例7：PMT基因组编辑和烟草品系开发

通过编辑不同烟草品系中的所有五个PMT基因(PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4)来产生另外的PMT敲除突变体。使用聚乙二醇(PEG)用编码基因组编辑技术(GET2)蛋白的质粒和靶向PMT基因的特定导向RNA(gRNA)在所需的位置转染烟草原生质体。表9列出了用于PMT编辑的gRNA序列。将一些gRNA(例如，Nos.6和7)混合在一起，以用于在单次转染中靶向多个PMT基因。

表9：在实例7中使用的GET2的导向RNA。“Y”表示gRNA能够靶向该PMT基因，而“-”表示gRNA不靶向该PMT基因。

然后，将转染的原生质体固定在1％琼脂糖珠中并进行组织培养。当愈伤组织生长到直径约1mm时，它们被铺在TOM2平板上。使用片段分析筛选愈伤组织在目标位置的插入或缺失(indel)。选择与野生型对照相比显示出尺寸偏移的候选者用于进一步培养，并再次通过片段分析测试随后的芽，以确认indel的存在。将生根的芽盆栽并对目标位置进行测序，以确定缺失的确切序列。收获来自每株植物的幼叶，并使用phirekit对PMT片段进行PCR扩增。对每一品系的PMT文库进行索引，并使用Miseq对384个品系进行汇总和测序。

进行SNP分析以确定精确编辑的pmt突变体等位基因序列和每个PMT基因座处的合子状态。表10提供了各种烟草品种(例如，Basma、K326、Katerini、TN90、Izmir)的各编辑的品系中的indel序列信息。

表11提供了如表10中提供的每一品系中每个基因的每种PMT indel的长度(以核苷酸计)。

表11.表10中提供的所选品系的每种indel的长度(以核苷酸计)。

表12A至12E提供了来自每个pmt突变体等位基因的约90个核苷酸的基因组序列，其中编辑的位点位于基因组序列的中间(例如，在缺失的或插入的序列位点每侧45个核苷酸)。

实例8.PMT编辑的品系的生物碱分析。

将来自实例7的纯合基因组编辑的烟草品系与对照品系一起在田间生长。在开花期，对植物进行打顶，并且在打顶后两周从来自植物的顶部的第三、第四、第五片叶采集叶片样品，并使用符合CORESTA方法62(Determination of Nicotine in Tobacco andTobacco Products by Gas Chromatographic Analysis，2005年2月)以及美国疾病控制和预防中心在1999年3月23日在Federal Register第64卷第55期上发表的Protocol forAnalysis of Nicotine，Total Moisture and pH in Smokeless Tobacco Products(并且2009年1月7日在第74卷第4期上修订)中定义的方法来测量(参见表13A-13C)。

使用液/液提取将约0.5g的烟草提取到含有内标物的有机溶剂中，并且通过气相色谱法(GC)利用火焰离子化检测(FID)进行分析。结果可以按原样或干重的重量百分比(Wt％)报告。基于干重来报告数据需要测定烘箱挥发物(OV)。除非另有说明，否则本文所示的总生物碱水平或尼古丁水平或者单独的生物碱水平或尼古丁水平均基于干重(例如，总生物碱百分比或尼古丁百分比)。

还在田间种植、收获植物，并测试调制烟草中的生物碱和TSNA水平。还评估了PMT编辑的植物的叶产量和叶等级。

表13A：在开花后两周K326和TN90 PMT编辑的品系的尼古丁分析。

表13B：在打顶两周后K326和TN90 PMT编辑的品系的尼古丁分析。

表13C：在开花后两周后Katerini和Basma PMT编辑的品系的尼古丁分析。

实例9.雄性不育PMT编辑的品系的开发。

使用来自实例7的品系来开发PMT编辑的杂交品系。杂交品系在田间生长，并且用作雄性不育品系的祖细胞。参见表14。

表14：PMT编辑的极低尼古丁雄性不育品系

实例10.PMT编辑的品系在调制期间抵抗霉菌

对从几个低生物碱烟草品系收获的烟叶进行标准晾制实践。在调制完成后，检查烟叶的霉菌。

来自LA BU 21的烟草呈现出比TN90 LC、包含下调所有五个PMT基因的RNAi构建体的TN90品种、包含下调生物碱生物合成基因PR50的RNAi构建体的TN90品种，以及在TN90遗传背景下的四个PMT编辑的品系(CS47、CS59、CS63和CS64)更多的霉菌侵染。参见表15以及图6A至6E和7。

表15.烟草品系表现出的霉菌损伤。“G”指很少/没有霉菌；“s”指一些霉菌；而“B”指显著霉菌。霉菌百分比指的是呈现出每一类霉菌损坏的晾制烟草条的百分比。