具体实施方式

定义和缩写

引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，否则适用以下定义。

术语“包含”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。

除非另有定义，所用的所有技术和科学术语具有其在相关科学领域的普通含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wiley and Sons[约翰·威利父子出版公司],纽约(1994)，以及Hale和Markham,Harper Collins Dictionary of Biology[哈伯科林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)提供了描述本发明的许多术语的普通含义。

术语“葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)活性”在本文被定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶活性。大多数葡糖淀粉酶是由通过可变长度的O-糖基化的接头区连接至淀粉结合结构域的催化结构域组成的多结构域酶。已经确定并描述了多种葡糖淀粉酶的晶体结构(参见J.Lee和M.Paetzel2011.Acta Cryst[晶体学报].67:188-92，以及J.Sauer等人2000.Biochem.EtBiophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1542:275-93。

术语“淀粉结合结构域(SBD)或碳水化合物结合模块(CBM)”在本文中可互换使用。SBD可分为九个CBM家族。作为能量来源，淀粉被大量各种淀粉分解酶降解。然而，这些淀粉分解酶中仅约10％能够结合并降解生淀粉。这些酶通常具有称为淀粉结合结构域的独特序列结构模块，所述淀粉结合结构域介导与淀粉颗粒的附接。SBD是指优先结合淀粉(多糖)底物或麦芽糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精等的氨基酸序列。它们通常是在约10％的微生物淀粉分解酶中发现的大约100个氨基酸残基的基序。

术语“催化结构域(CD)”是指含有底物水解的活性位点的多肽的结构区。

术语“糖苷水解酶”可与“糖苷酶”和“糖基水解酶”互换使用。糖苷水解酶有助于复合糖(多糖)中糖苷键的水解。糖苷水解酶也可分为外切或内切作用，取决于它们分别作用于(通常非还原)寡糖/多糖链的末端还是中间。糖苷水解酶也可以通过基于序列或结构的方法进行分类。

术语“含α-1,6键的底物”是指含有至少一个α-1,6键并且可以被糖基水解酶水解的寡糖或多糖。含α-1,6键的底物的实例包括但不限于：异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和出芽短梗霉聚糖。

术语“颗粒状淀粉”是指生(即未烹调的)淀粉，例如，未经历糊化的颗粒状淀粉。

术语“颗粒状淀粉水解(GSH)酶”和“颗粒状淀粉水解(GSH)活性”在本文中可互换使用并且是指能够在与动物(特别是反刍动物)消化道中发现的条件相当的消化道相关条件下以颗粒状形式水解淀粉的酶。

术语“分离的”是指呈自然界中不存在的形式或在自然界中不存在的环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关联的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关联的其他组分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换使用并且是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。

术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，经纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或酶是指没有信号肽序列或前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羰基末端的前序列的蛋白质的形式。前体还可以具有有效地连接到前序列的氨基末端的“信号”序列。

术语“百分比同一性”是如通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约州(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析],第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；以及SequenceAnalysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报],90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用几个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-3402,1997和Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参考”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参考”序列称为“查询”序列。

如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,LipmanDJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database searchprograms.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]Nucleic Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用此信息，可以对蛋白质序列进行分组，还可以使用氨基酸序列构建系统发生树。也可以使用Megalign程序、AlignX程序、EMBOSS开放软件套件序列(EMBL-EBI；Rice等人,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))或类似程序进行序列比对和百分比同一性计算。也可以使用带有默认参数的CLUSTAL方法(例如CLUSTALW)来进行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以被化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码特定的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

术语“编码序列”意指直接指明蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由可读框决定，所述可读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

“合成”分子是通过体外化学或酶促合成而不是通过生物产生的。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调控序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。

术语“有效地连接”意指：指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并列)。例如，调控序列有效地连接到编码序列，使得所述编码序列的表达受所述调控序列的控制。

术语“调控序列”在本文被定义为包括表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这样的调控序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将调控序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，调控序列可以提供有多个接头。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。

术语“终产物”是指醇，例如乙醇，或选自由以下组成的组的生物化学品：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油和异戊二烯。

“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

关于酶的术语“热稳定”、“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。酶(如淀粉酶)的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t_1/2)来测量，在此期间酶活性的一半在限定条件下丧失。半衰期可以通过测量例如暴露于(即，受挑战于)升高的温度后的残余淀粉酶活性来计算。术语“热稳定”和“热稳定的”意指加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至指定温度之前添加剂中存在且有活性的酶的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品的生产过程，其中在同一工艺步骤中存在微生物，例如产乙醇微生物和至少一种酶，例如淀粉酶。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。

“浆料”是水中包含不溶性淀粉颗粒的水性混合物。

术语“总糖含量”是指包括单糖、寡糖和多糖的淀粉组合物中存在的总可溶性糖含量。

术语“干固体”(ds)是指溶解于水的干固体、分散于水中的干固体或二者的组合。因此干固体包括颗粒状淀粉及其水解产物，包括葡萄糖。

“干固体含量”是指相对于其中分散和/或溶解干固体的水的以重量百分比计溶解的和分散的干固体的百分比。淀粉的初始干固体含量为以含水量折算的颗粒状淀粉的重量除以颗粒状淀粉的重量加上水的重量。后续的干固体含量可由针对任何添加或损失的水和化学增益而调节的初始含量确定。后续的溶解干固体含量可由如下所示的折射率测量。8

术语“高DS”是指干固体含量为34％(wt/wt)或更高的水性淀粉浆料。

“干物质淀粉”是指底物例如淀粉浆料的干淀粉含量，并且可通过从底物质量中扣除任何非淀粉组分如蛋白质、纤维和水的贡献来确定。例如，如果颗粒状淀粉浆料具有20％(wt/wt)的水含量和1％(wt/wt)的蛋白质含量，则100kg的颗粒状淀粉具有79kg的干淀粉含量。干物质淀粉可用于确定要使用的酶单位数量。

“液化物”是指将淀粉或含淀粉的谷物浆料(醪液)蒸煮(加热)和液化(降低粘度)的产物。

“液化(liquefaction或liquefy)”是指将淀粉(或含淀粉的谷物)转化为较短链和较低粘度糊精的过程。

“聚合度(DP)”是指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖、异麦芽糖和蔗糖。DP3的实例是三糖，例如异麦芽三糖和潘糖。DP3+表示聚合度大于3的聚合物。

术语“可溶性淀粉底物”是指能够溶解在热水中的淀粉。

术语“葡萄糖糖浆”是指由淀粉水解制成的糖浆。

术语“接触”是指将参考组分(包括但不限于酶、底物和发酵生物)充分靠近放置以影响预期结果，例如所述酶作用于底物上或发酵生物发酵底物。本领域技术人员将认识到混合溶液可以引起“接触”。

“产乙醇微生物”是指具有将糖或其他糖类转化为乙醇的能力的微生物。

术语“生物化学品”是指微生物的代谢物，如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、异丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、其他有机酸、1,3-丙二醇、维生素、或异戊二烯、或者其他生物材料。

术语“约”是指参考值的±15％。

除非另有说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

EC 酶学委员会

CAZy 碳水化合物活性酶

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％ 重量百分比

℃ 摄氏度

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

mol 摩尔

mmol 毫摩尔

M 摩尔的

mM 毫摩尔的

μM 微摩尔

nm 纳米

U 单位

ppm 份/百万份

hr和h 小时

葡糖淀粉酶及其使用方法

在第一方面，本发明涉及用于糖化淀粉底物的方法，所述方法包括使所述底物与葡糖淀粉酶接触，所述葡糖淀粉酶在同等条件下，与来自黑曲霉的葡糖淀粉酶相比，在含α-1,6键的底物上具有至少两倍多的活性，其中在同等条件下，与用来自黑曲霉的葡糖淀粉酶糖化相同的淀粉底物相比，用所述葡糖淀粉酶进行糖化产生了具有更高水平的DP1的葡萄糖糖浆。

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶能够水解α-1,4-糖苷键(线性)以及α-1,6-糖苷键(分支)。含α-1,6-糖苷键的示例性底物是支链淀粉、异麦芽糖、出芽短梗霉聚糖和潘糖。

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶在同等条件下，与来自黑曲霉的葡糖淀粉酶相比，在含α-1,6键的底物上具有至少约两倍(例如，至少约三倍、至少约四倍、至少约五倍、至少约六倍、至少约七倍、至少约八倍、至少约九倍、至少约十倍、至少约十一倍、至少约十二倍、至少约十三倍、至少约十四倍、至少约十五倍或更高比率)多的活性。

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶在同等条件下，与来自黑曲霉的葡糖淀粉酶相比，在出芽短梗霉聚糖、潘糖或异麦芽糖底物上具有至少两倍(例如，至少约三倍、至少约四倍、至少约五倍、至少约六倍、至少约七倍、至少约八倍、至少约九倍、至少约十倍或更高比率)多的活性。

在一些实施例中，葡糖淀粉酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽优选具有至少80％、至少83％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％的氨基酸序列同一性，并且具有葡糖淀粉酶活性。

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶的多肽是包含如下氨基酸序列的同源多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽相差十个氨基酸、优选地相差九个氨基酸、优选地相差八个氨基酸、优选地相差七个氨基酸、优选地相差六个氨基酸、优选地相差五个氨基酸、更优选地相差四个氨基酸、甚至更优选地相差三个氨基酸、最优选地相差两个氨基酸、并且甚至最优选地相差一个氨基酸。

在一些实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽的变体、或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。

在一些实施例中，本发明的多肽是包含SEQ ID NO:2的氨基酸21-481、SEQ ID NO:4的氨基酸29-491或SEQ ID NO:6的氨基酸27-485的催化区，其是通过ClustalX https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17846036预测的。

在一些实施例中，本发明的多肽是包含SEQ ID NO:2的氨基酸21-503、SEQ ID NO:4的氨基酸29-513或SEQ ID NO:6的氨基酸27-506的催化区和接头区，其是通过ClustalXhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17846036预测的。

在一些实施例中，如通过本文所述的测定法确定的，在pH 5.0测量时，本发明的多肽在约70℃的温度具有最大活性、在约62℃的温度至约77℃的温度具有最大活性的70％以上。使用酶的示例性温度范围是50℃-85℃、55℃-80℃、55℃-75℃和60℃-75℃。

在一些实施例中，本发明的多肽是热稳定的并且在升高的温度保持葡糖淀粉酶活性。本发明的多肽在pH值范围为约4.0至约6.0(例如，约4.5至约6.0、约4.0至约5.5、约4.5至约5.5等)时显示出热稳定性。例如，在pH为约5.0下，本发明的多肽在高温(例如，至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃或更高的温度)下保持大部分葡糖淀粉酶活性持续延长的时间段。例如，在pH约4.0至约6.0，本发明的多肽在升高的温度保持至少约45％(例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或更高的百分比)的葡糖淀粉酶活性持续至少1小时、2小时、3小时或甚至更长。

在一些实施例中，如通过本文所述的测定法确定的，在50℃的温度测量时，本发明的多肽在pH约5具有最大活性、在pH约3.5至pH约6.0具有最大活性的90％以上、并且在pH约2.5至pH约7.0具有最大活性的70％以上。使用酶的示例性pH范围是pH 2.5-7.0、3.0-7.0、3.5-7.0、2.5-6.0、3.0-6.0和3.5-6.0。

在一些实施例中，本发明的多肽是低pH稳定的并且在低pH保持葡糖淀粉酶活性。本发明的多肽在pH值范围为约2.0至约7.0(例如，约2.0至约6.0、约2.0至约5.0、约2.0至约4.0等)时显示出低pH稳定性。例如，在pH 2.5至约6.0，本发明的多肽在高温(例如，至少40℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃或更高的温度)保持大部分葡糖淀粉酶活性持续延长的时间段，并且例如，持续至少4小时、至少17小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、或甚至更长的时间。

在一些实施例中，与(来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)AnGA相比，本发明的多肽在pH约4或pH约4.5或pH约5，在温度范围为约55℃至约75℃(例如，约55℃至约70℃、约60℃至约75℃、约60℃至约70℃等)，在孵育时间持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、或甚至更长的时间下具有更好的糖化性能。

在一些实施例中，与目前商业上可用的葡糖淀粉酶产品相比，本发明的多肽在pH约3或pH约4或pH约5，在温度范围为约30℃至约70℃(例如，约30℃至约60℃、约30℃至约50℃等)，在孵育时间持续至少17小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、或甚至更长的时间下可以用于同时糖化和发酵(SSF)工艺中。

在一些实施例中，具有葡糖淀粉酶活性的多肽可以从以下中的任一种获得：木霉属物种(Trichoderma sp.)、曲霉属物种(Aspergillus sp.)、腐质霉属物种(Humicolasp.)、青霉属物种(Penicillium sp.)、篮状菌属物种(Talaromyces sp.)、共生菌属物种(Symbiotaphrina sp.)或裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces sp.)。在一个实施例中，具有葡糖淀粉酶活性的多肽来自光孢青霉。在一个实施例中，具有葡糖淀粉酶活性的多肽来自烟草甲体内共生菌。在一个实施例中，具有葡糖淀粉酶活性的多肽来自巴西青霉。

在第二方面，本发明的葡糖淀粉酶包含相对于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQID NO:6的氨基酸序列的一个或几个氨基酸残基的保守取代。保守氨基酸取代在本领域中是熟知的。

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶包含相对于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其同源序列的一个或几个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加。在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶通过一个或几个氨基酸残基的保守取代而衍生自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶相对于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6的氨基酸序列通过缺失、取代、插入、或添加一个或几个氨基酸残基而衍生自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在所有情况下，表述“一个或几个氨基酸残基”是指10个或更少，即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6的氨基酸取代、缺失和/或插入可以是至多10个、优选地至多9个、更优选地至多8个、更优选地至多7个、更优选地至多6个、更优选地至多5个、更优选地至多4个、甚至更优选地至多3个、最优选地至多2个、以及甚至最优选地至多1个。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH等。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序是例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人,1991,Biochem.[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且可适用于未知结构的多肽。

葡糖淀粉酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括来自第一葡糖淀粉酶的至少一部分，和来自第二淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶或其他淀粉降解酶的至少一部分，或甚至其他糖基水解酶，例如但不限于纤维素酶、半纤维素酶等(包括最近被“重新发现”为结构域交换淀粉酶的嵌合淀粉酶)。本发明的葡糖淀粉酶可进一步包括异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。

本发明的葡糖淀粉酶可以在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达。在将葡糖淀粉酶分泌到细胞培养基中后，可以获得包含葡糖淀粉酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，葡糖淀粉酶可以从宿主细胞中分离，或甚至从细胞培养液中分离，这取决于最终葡糖淀粉酶所需的纯度。可以根据本领域熟知的方法克隆和表达编码葡糖淀粉酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉或嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophila)。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，以及链霉菌属(Streptomyces)。

另外，宿主可以表达一种或多种辅酶、蛋白质、肽。这些可以有益于液化、糖化、发酵、SSF和下游处理。此外，除了用于消化各种原料的酶之外，宿主细胞还可以产生乙醇和其他生物化学品或生物材料。此类宿主细胞可用于发酵或同时糖化和发酵工艺，以减少或消除添加酶的需要。

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。在一些实施例中，在所述酶组合物中还可以使用如下多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽优选具有至少80％、至少83％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有葡糖淀粉酶活性。优选地，配制组合物以提供所希望的特征，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。

组合物可包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，组合物可包含多重酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、支链淀粉酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或其组合，所述酶可以按本领域技术人员熟知的有效量添加。

可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且所述多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，包含本发明的葡糖淀粉酶的组合物可以是水性或非水性配制品、颗粒、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，所述组合物可进一步包含本文列出的另外的酶中的任何一种或多种，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。此类组合物可与内源酶或已存在于浆料、水浴、洗衣机、食品或饮料产品等中的其他成分(例如，内源植物(包括藻类或真菌)酶，来自先前加工步骤的残留酶等)组合起作用。包括在组合物中的多肽可以根据本领域已知的方法稳定化。

组合物可以是表达多肽的细胞，包括能够从发酵产生产物的细胞。此类细胞能以乳膏或干燥形式与合适的稳定剂一起提供。此类细胞可以进一步表达另外的多肽，例如上面提到的多肽。

以下给出了本发明的多肽或组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用所述组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

本发明还针对本发明的多肽或组合物在液化过程、糖化过程、和/或发酵过程中的用途。可以在单个过程中，例如在液化过程、糖化过程、或发酵过程中使用所述多肽或组合物。也可以在过程的组合中(例如在液化和糖化过程、在液化和发酵过程中、或者在糖化和发酵过程中(优选地与淀粉转化有关))使用所述多肽或组合物。

可以使用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(任选地在另外一种或多种酶的存在下)，将液化淀粉糖化成富含低DP(例如DP1+DP2)糖的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合、液化淀粉的组成、糖化的条件以及所加工的淀粉的类型。有利地，使用所提供的葡糖淀粉酶可获得的糖浆可含有糖化淀粉中总寡糖的DP3+的重量百分比低于20％，例如1％、5％、10％或20％。糖化淀粉中DP1的重量百分比可超过约80％，例如，75％-85％或80％-90％或80％-95％。

液化通常作为连续工艺进行，而糖化通常作为分批工艺进行。糖化条件取决于液化物的性质和可用的酶类型。在一些情况下，糖化过程可涉及约60℃-90℃的温度和约2.0-4.5的pH(例如，约2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2或4.4)。糖化可以在例如约40℃、约50℃、或约55℃至约60℃之间、或约65℃、或约70℃、或约75℃、或约80℃、或约85℃、或约90℃或更高的温度进行，在许多情况下有必要冷却液化物。通过在更高的温度进行糖化过程，可以在更短的时间段内进行所述过程，或可替代地可以使用更低的酶剂量来进行所述过程。此外，当在更高的温度进行液化和/或糖化过程时，微生物污染的风险减小。

糖化通常在搅拌槽中进行，这可能需要几个小时来填充或清空。酶通常以固定比率添加到干燥固体中(槽被填充时)，或者以单剂量添加(在填充阶段开始时)。制备糖浆的糖化反应通常进行约24-72小时，例如24-48小时。

然而，通常仅在30℃-65℃之间(通常约60℃)的温度进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵(SSF)中完全糖化。在一个实施例中，本发明的方法包括在同时糖化和发酵(SSF)方法之前将含淀粉的材料预糖化。在移入SSF之前，可以在高温(例如，50℃-85℃，优选是60℃-75℃)进行预糖化。

在本发明的优选的方面，所述液化和/或糖化包括顺序或同时进行的液化和糖化过程。

通常在约32℃的温度(例如从30℃至35℃)，可以通过使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵可溶性淀粉水解产物(特别是富含葡萄糖的糖浆)。“发酵生物”是指适用于发酵过程并且能够产生所需发酵产物的任何生物(包括细菌和真菌生物)。尤其合适的发酵生物能够直接地或间接地将糖(如葡萄糖或麦芽糖)发酵(即，转化)成所需的发酵产物。发酵生物的实例包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。产乙醇微生物可以表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，上述两种酶将木糖转化为木酮糖。例如，可以承受更高温度的改善的产乙醇微生物菌株是本领域已知的并且可以使用的。参见Liu等人(2011)ShengWu Gong Cheng Xue Bao[生物工程学报]27:1049-56。商业上可用的酵母包括例如RedStar^TM/乐斯福(Lesaffre)乙醇红(可从美国红星/乐斯福(Red Star/Lesaffre)公司获得)、FALI(可从美国伯恩斯菲利普食品有限公司(Burns Philp Food Inc.)的分公司弗莱施曼酵母(Fleischmann's Yeast)公司获得)、SUPERSTART(可从阿尔泰克公司(Alltech)获得)、GERT STRAND(可从瑞典的Gert Strand AB公司获得)、ADY(可从杜邦公司(DuPont)获得)、 THRIVE(可从杜邦公司获得)、FERMIOL(可从帝斯曼食品配料部(DSM Specialties)获得)。发酵的温度和pH将取决于发酵生物。通过发酵产生其他代谢物如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域已知的。参见，例如，Papagianni(2007)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]25:244-63；John等人(2009)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]27:145-52。

糖化和发酵过程可以作为SSF过程进行。可以用在整个SSF中连续表达和分泌葡糖淀粉酶的真菌细胞进行SSF过程。表达葡糖淀粉酶的真菌细胞也可以是发酵微生物，例如产乙醇微生物。因此，可以使用表达足够葡糖淀粉酶的真菌细胞进行乙醇生产，从而更少地需要或不需要外源地添加酶。真菌宿主细胞可以来自适当工程化的真菌菌株。除了葡糖淀粉酶之外，还可以使用表达和分泌其他酶的真菌宿主细胞。此类细胞可以表达淀粉酶和/或支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、或其他酶。发酵后可以回收乙醇。

根据本发明，发酵包括但不限于用于产生如下的发酵方法：醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、乙二醇、丙烯乙二醇、丁二醇、甘油、山梨醇、以及木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)以及激素。在优选的方面，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒精；或工业乙醇或消费醇类工业(例如啤酒和白酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。

在这样的优选实施例中，所述方法通常在28℃至36℃之间，例如29℃至35℃之间、例如30℃至34℃之间、例如约32℃的温度，在pH范围为3到7之间，优选地pH 3.5到6、或更优选地pH 4到5之间进行。

本发明提供了本发明的葡糖淀粉酶用于从生淀粉或颗粒状淀粉中产生葡萄糖等的用途。通常，本发明的葡糖淀粉酶单独或在α-淀粉酶存在下可用于生淀粉水解(RSH)或颗粒状淀粉水解(GSH)过程中用于产生所需的糖和发酵产物。所述颗粒状淀粉通过在糊化温度以下酶法水解来溶解。据报道，此类“低温”系统(也称为“无蒸煮”或“冷蒸煮”)能够处理比常规系统更高浓度的干固体(例如，高至45％)。

“生淀粉水解”过程(RSH)不同于常规淀粉处理过程，包括通常在至少葡糖淀粉酶和/或淀粉酶存在下，在淀粉底物的糊化温度或低于淀粉底物的糊化温度顺序或同时糖化和发酵颗粒状淀粉。在水中加热的淀粉在50℃与75℃之间开始糊化，糊化的确切温度取决于特定的淀粉。例如，糊化温度可根据植物物种、植物物种的特定变种以及生长条件而不同。在本发明的上下文中，给出的淀粉的糊化温度是使用Gorinstein.S.和Lii.C.,Starch/Starke[淀粉],第44卷(12)第461-466页(1992)描述的方法使得淀粉颗粒的双折射损失为5％时的温度。

本发明的葡糖淀粉酶还可以结合仅水解在包含至少四个葡糖残基的分子中的α-(1,6)-糖苷键的酶来使用。优选地，本发明的葡糖淀粉酶与支链淀粉酶或异淀粉酶组合使用。在G.M.A.van Beynum等人,Starch Conversion Technology[淀粉转换技术],MarcelDekker[马塞尔·德克尔],纽约,1985,101-142中描述了异淀粉酶和支链淀粉酶用于淀粉脱支的用途、酶的分子特性、以及酶与葡糖淀粉酶一起的潜在用途。

用于制造啤酒的过程在本领域中是熟知的。参见例如Wolfgang Kunze(2004)“Technology Brewing and Malting[技术酿造与制麦芽]”Research and TeachingInstitute of Brewing,Berlin[柏林酿酒研究与教学研究所](VLB),第3版。简而言之，所述过程涉及：(a)制备醪液，(b)过滤醪液以制备麦芽汁，和(c)发酵麦芽汁以获得发酵饮料(如啤酒)。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选使用的发酵过程包括本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵方法为厌氧发酵方法，所述方法是为本领域熟知的。

可以将包含与淀粉酶和任选的支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合的葡糖淀粉酶的酿造组合物添加到上述步骤(a)的醪液中，即在醪液的制备期间添加。可替代地或除此之外，可以将酿造组合物添加到上述步骤(b)的醪液中，即在醪液的过滤期间添加。可替代地或除此之外，可以将酿造组合物添加到上述步骤(c)的麦芽汁中，即在麦芽汁的发酵期间添加。

实例

除非在本文中另有定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wileyand Sons[约翰·威利父子出版公司],纽约(1994)，以及Hale和Marham,THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，所述实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。

实例1.葡糖淀粉酶的表达

在JGI数据库(scaffold_7:734096-736255，蛋白质ID：389044，https://genome.jgi.doe.gov/cgi-bin/dispGeneModel？db＝Pengl1&id＝389044)中找到了光孢青霉葡糖淀粉酶(PglGA1)基因的核酸序列和由PglGA1基因编码的假定蛋白的氨基酸序列。合成编码全长PglGA1的密码子修饰的合成DNA序列并插入到pTTT表达载体中(描述于公开的PCT申请WO 2011/063308)。

用于表达的PglGA1合成基因的核苷酸序列如下SEQ ID NO:1所示。

在JGI数据库(scaffold_6:771037-773008，蛋白质ID：779991，https://genome.jgi.doe.gov/cgi-bin/dispGeneModel？db＝Symko1&id＝779991)中找到了烟草甲体内共生菌CBS 250.77葡糖淀粉酶(SkoGA1)基因的核酸序列和由SkoGA1基因编码的假定蛋白的氨基酸序列。合成编码全长SkoGA1的密码子修饰的合成DNA序列并插入到pTTT表达载体中(描述于公开的PCT申请WO 2011/063308)。

用于表达的SkoGA1合成基因的核苷酸序列如下SEQ ID NO:3所示。

在NCBI数据库(NCBI登录号：CDHK01000002.1：从848163至850126(基因)和CEJ55559.1(蛋白质))中找到了巴西青霉葡糖淀粉酶(PbrGA5)基因的核酸序列和由PbrGA5基因编码的假定蛋白的氨基酸序列。合成编码全长PbrGA5的密码子修饰的合成DNA序列并插入到pTTT表达载体中(描述于公开的PCT申请WO 2011/063308)。

用于表达的PbrGA5合成基因的核苷酸序列如下SEQ ID NO:5所示。

使用原生质体转化将编码PglGA1、SkoGA1和PbrGA5酶的质粒转化到合适的里氏木霉菌株(Te’o等人,J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]51:393-99,2002)。通过WO2016/138315中描述的方法选择并发酵所述转化体。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析和酶活性测定来确认蛋白质表达。

通过β环糊精偶联的琼脂糖6亲和色谱纯化PglGA1、SkoGA1和PbrGA5。进行葡糖淀粉酶活性测定和SDS-PAGE以确定纯度和浓度。合并含有目标蛋白质的级分，并使用具有10KMWCO的Amicon Ultra-15装置进行浓缩。经纯化的样品纯度高于90％，并在-80℃下储存在40％的丙三醇中直至使用。使用质谱分析进行PglGA1、SkoGA1和PbrGA5葡糖淀粉酶的蛋白质序列确认。

PglGA1的成熟形式的氨基酸序列如下SEQ ID NO:2所示：

SkoGA1的成熟形式的氨基酸序列如下SEQ ID NO:4所示：

PbrGA5的成熟形式的氨基酸序列如下SEQ ID NO:6所示：

实例2.葡糖淀粉酶底物特异性

基于通过来自以下底物：可溶性淀粉、玉米淀粉、出芽短梗霉聚糖、潘糖和异麦芽糖的葡糖淀粉酶释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶PglGA1(SEQ ID NO:2)、SkoGA1(SEQ ID NO:4)、PbrGA5(SEQ ID NO:6)和AnGA(黑曲霉葡糖淀粉酶，野生型，SEQ ID NO:7)的底物特异性。如下所述使用偶联的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOX/HRP)和2,2'-联氮基-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)方法(Anal.Biochem.[分析生物化学]105(1980),389-397)。

通过将9mL每种上述底物(1％水溶液，w/v)和1mL 0.5M pH 4.5的乙酸钠缓冲液在15mL锥形管中混合来制备底物溶液。在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中制备具有ABTS的偶联酶(GOX/HRP)溶液，其中终浓度为2.74mg/mL ABTS、0.1U/mL HRP、和1U/mL GOX。在Milli Q水中制备葡糖淀粉酶样品(5ppm可溶性淀粉，50ppm其他底物)。将每份葡糖淀粉酶样品(10μL)转移至新的含有90μL底物溶液的微量滴定板(Corning 3641)中。分别在32℃持续60min和在60℃持续30min进行反应，同时在iEMS培养箱(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))中振荡(650rpm)。通过添加50μL的0.1N H₂SO₄来淬灭反应。将反应混合物(5μL)转移至384孔板(Greiner 781101)，随后添加45μL的ABTS/GOX/HRP溶液。在SoftMax Pro板读取器(分子装置公司(Molecular Device))上，在405nm处，以25秒的间隔持续5min测量含有反应混合物的微量滴定板。输出是反应速率Vo，其直接用于指示酶活性。

表1中总结了对PglGA1、SkoGA1、PbrGA5以及基准(benchmark)AnGA的不同底物的活性。在两种评估的条件下：在60℃30min和在32℃60min，PglGA1、SkoGA1和PbrGA5在所有底物上均显示出比AnGA更高的活性。特别地，当在60℃持续30min测试时，在具有α-1,6键的底物(如异麦芽糖、潘糖和出芽短梗霉聚糖底物)上测试的葡糖淀粉酶活性比AnGA的活性高几倍(对于PglGA1分别是8.9倍、4.1倍和7.9倍；对于SkoGA1分别是2.7倍、2.3倍和6.0倍；对于PbrGA5分别是3.6倍、2.5倍和6.4倍)。

实例3.pH对葡糖淀粉酶活性的影响

使用可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)作为底物监测pH(2.0至7.0)对葡糖淀粉酶活性的影响。缓冲工作溶液由甘氨酸/乙酸钠/HEPES(250mM)的组合组成，pH在2.0至7.0之间变化。通过将可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)与250mM缓冲溶液以9:1的比率混合来制备底物溶液。在水中以某个剂量制备酶工作溶液(显示根据剂量响应曲线在线性范围内的信号)。在50℃进行所有孵育，持续10min。通过按照与上述对于葡糖淀粉酶的底物特异性相同的程序来测量葡萄糖释放。将每种pH下的酶活性报告为与最佳pH下的酶活性相比的相对活性。葡糖淀粉酶的pH曲线在表2中示出。PglGA1在pH 4.0至5.0显示出最佳活性，并且其pH范围(在此范围内所述活性保持在>70％)为从2.4至6.9。SkoGA1在pH 5.0显示出最佳活性，并且其pH范围为从2.6至7.0。PbrGA5在pH 5.0显示出最佳活性，并且其pH范围为从3.1至6.7。PglGA1和SkoGA1在pH 2.0分别保留了它们活性的60％和50％，而AnGA在pH 2保留了少于50％的活性。

实例4.温度对葡糖淀粉酶活性的影响

使用可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)作为底物监测温度(从40℃至90℃评估)对葡糖淀粉酶活性的影响。通过将9mL可溶性淀粉(1％水溶液，w/w)和1mL 0.5M的缓冲液(pH 5.0乙酸钠)在15mL锥形管中混合来制备底物溶液。在水中以某个剂量制备酶工作溶液(显示根据剂量响应曲线在线性范围内的信号)。在温度为40℃至90℃分别进行孵育，持续10min。通过按照与上述对于葡糖淀粉酶的底物特异性相同的程序来测量葡萄糖释放。将每个温度下的活性报告为与最佳温度下的酶活性相比的相对活性。葡糖淀粉酶的温度曲线在表3中示出。PglGA1、SkoGA1和PbrGA5在70℃均显示出最佳活性。它们的温度范围(在此范围内所述活性保持在>70％)对于PglGA1为从62℃至77℃、对于SkoGA1为从60℃至77℃，以及对于PbrGA5为从61℃至74℃。当孵育温度为80℃时，PglGA1和SkoGA1保留了其最大活性的大于50％，而AnGA在相同条件下丧失了90％的活性。

实例5.在pH 4.5，在不同的温度针对糖化评估葡糖淀粉酶

在不同的孵育温度评估PglGA1、SkoGA1、PbrGA5和AnGA的糖化性能。将α-淀粉酶预处理的玉米淀粉液化物(在34％ds、pH 2.9制备)用作起始底物。葡糖淀粉酶的剂量为40μg/gds，将所述剂量确定为中位有效剂量(数据未显示)。在pH 4.5，在60℃、65℃和69℃进行孵育，并且在24小时和48小时收集样品以监测反应。通过在100℃加热15min来淬灭所有孵育。取出等分试样并在5mM H₂SO₄中稀释400倍，使用Agilent 1200系列系统(具有PhenomenexRezex-RFQ Fast Fruit柱(目录号00D-0223-K0))，在80℃下运行用于HPLC分析。将10μL样品加载到柱上，并用等梯度的5mM H₂SO₄作为流动相以1.0mL/min的流速分离。使用折光率检测器检测寡糖产物，并且运行标准溶液以确定每种目的糖(DP3+、DP3、DP2和DP1)的洗脱时间。表4中的数字反映了作为总DP1至DP3+的分数的每个DP(n)的峰面积百分比。DP1定量的结果表明即使孵育温度增至69℃时，PglGA1、SkoGA1和PbrGA5仍保留它们活性的很大一部分，而随着温度从60℃增至69℃，AnGA丧失更多的活性。这些数据表明PglGA1、SkoGA1和PbrGA5可用于更高温度的糖化过程中。