一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法
阅读说明：本技术 一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法 (Method for preparing large yellow croaker biological fermentation feed ) 是由 吴云通 黄贞胜 林鸿荣 于 2020-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法,采用二种益生菌—枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌作为发酵菌剂,豆粕作为发酵菌,并采用3立方固态发酵罐纯菌发酵取代传统的开放式发酵模式,便于控制发酵条件,缩短发酵周期；并有利于控制杂菌污染和有害产物生成,保证产品质量和安全,采用这种生产方式生产生物饲料有助于实现生产自动化,扩大生产规模,提高产品质量的稳定性。(The invention discloses a method for preparing a large yellow croaker biological fermentation feed, which adopts two probiotics, namely bacillus subtilis and lactobacillus plantarum, as fermentation inoculants, soybean meal as fermentation bacteria, and adopts a 3-cube solid-state fermentation tank pure-bacteria fermentation to replace the traditional open fermentation mode, thereby facilitating the control of fermentation conditions and shortening the fermentation period; the production method is favorable for realizing production automation, enlarging production scale and improving the stability of product quality.)
技术领域
本发明涉及生物饲料制备技术领域，具体为一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法。
背景技术
我国是世界上唯一水产养殖产量超过捕捞产量的国家，水产品产量居世界首位，福建省正在建设21世纪海上丝绸之路核心区，而海水养殖是其中一个重点。随着水产养殖业的发展，集约化程度不断提高，在养殖过程中人工配合饲料的大量使用，产生了亟待解决的一些问题，如：饲料的消化吸收率降低，饲料系数升高，养殖水体中过多的排泄物和残饵使水体环境中物理和化学指标及生物学因子发生改变，引起水体自净能力下降，导致水体富营养化或水质恶化，病原体大量滋生，新病原不断出现，造成水产养殖动物疾病发生频率増加和生长缓慢等问题。为了防治疾病，抗生素等化学药品被大量应用于水产养殖，而抗生素的使用又带来了细菌耐药性、残留，及水体污染等问题，制约了水产养殖业的健康可持续发展。因此，无污染、无残留、促生长、增强免疫的高效环保型生物发酵饲料的开发和应用对新时期下的水产养殖业具有重要的现实意义。基于此，本发明设计了一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法，以解决上述技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法，包括以下步骤：
S1、将植物乳杆菌依次进行斜面培养、活化培养、种子培养和发酵培养，得到植物乳杆菌活菌；
S2、将枯草芽孢杆菌依次进行活化培养、种子培养和发酵培养，得到枯草芽孢杆菌活菌，且活化培养的培养方法为平板划线法；
S3、豆粕发酵：将初始含水率50％的豆粕接种到固态发酵培养基内，并分别依次接种植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌进行发酵培养，得到发酵豆粕；
S4、将发酵豆粕添加到大黄鱼饲料中，得到发酵饲料。
优选的，所述步骤S1中植物乳杆菌的斜面培养、活化培养、种子培养和发酵培养的具体培养方法分别为：
植物乳杆菌斜面培养：将植物乳杆菌的接种斜面在37℃恒温培养箱中培养36h后，放置于4℃冰箱保藏，每两周传代一次，得到斜面培养菌体；
植物乳杆菌活化培养：取2～3环所述斜面培养菌体接种于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、50r/min培养24h，得到活化植物乳杆菌；
植物乳杆菌种子培养：将所述活化植物乳杆菌接种到250mL三角瓶中，并且在250mL三角瓶中装入种子培养基100mL，接种量2％，37℃、50r/min培养14h，得到种子植物乳杆菌；
植物乳杆菌发酵培养：将所述种子植物乳杆菌接种到250mL三角瓶中，并且在250mL三角瓶中装入发酵培养基100mL，接种量3％，37℃、50r/min培养14h，得到植物乳杆菌活菌。
优选的，所述植物乳杆菌活化培养的液体种子培养基、植物乳杆菌种子培养的种子培养基和植物乳杆菌发酵培养中的发酵培养基的成分均为：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，CH3COONa·3H2O 5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·H2O0.25g/L，吐温80 1mL，且各培养基的PH值均为6.4。
优选的，所述步骤S2中枯草芽孢杆菌的活化培养、种子培养和发酵培养的具体培养方法分别为：
枯草芽孢杆菌活化培养：采用平板划线法将枯草芽孢杆菌菌种接种在牛肉膏蛋白胨固体平板的营养琼脂培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24h后，放置于4℃冰箱保藏，每两周传代一次，得到活化枯草芽孢杆菌；
枯草芽孢杆菌种子培养：挑取活化后的单菌落于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培养20h，得到种子枯草芽孢杆菌；
枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子枯草芽孢杆菌接种到250mL三角瓶中，并在250mL三角瓶中装入发酵培养基100mL，调节初始pH为7.0，接种量为2％，37℃、200r/min培养20h，得到枯草芽孢杆菌活菌。
优选的，所述枯草芽孢杆菌活化培养中的营养琼脂培养基的成分为：牛肉浸膏3g/L，细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，且营养琼脂培养基的PH值为7.0；
所述枯草芽孢杆菌种子培养中的种子培养基成分为：大豆蛋白胨3g/L，细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，且种子培养基的PH值为7.0；
所述枯草芽孢杆菌发酵培养中的发酵培养基成分为：可溶性淀粉15g/L，酵母粉7.5g/L，MgSO4.7H2O 2g/L，KCl 1g/L，且发酵培养基的PH值为7.0。
优选的，所述步骤S3中固态发酵培养基的成分为：豆粕50g，蒸馏水50mL。
优选的，所述步骤S3中植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌的接种量分别为：枯草芽孢杆菌接种量为8％，且枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例为1:5。
优选的，所述步骤S3中植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌的接种顺序和发酵时间分别为：接种枯草芽孢杆菌2天后接种植物乳杆菌，共发酵5天。
优选的，所述步骤S3中豆粕发酵的发酵温度为37℃。
优选的，所述步骤S4中将蛋白含量为50％的发酵豆粕添加比例22％，替代30％鱼粉，替代后发酵饲料的各原料配比为：蛋白含量为67％的鱼粉0.1、蛋白含量为65％的鱼粉0.075、蛋白含量为67％的鸡肉粉0.08、蛋白含量为60％的玉米蛋白粉0.05、蛋白含量为43％的豆粕0.1、蛋白含量为50％的发酵豆粕0.22、豆油0.2、鱼油0.5、蛋白含量为13％的面粉0.15、木薯生粉0.025、预混料0.8。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用二种益生菌—枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌作为发酵菌剂，豆粕作为发酵菌，并采用3立方固态发酵罐纯菌发酵取代传统的开放式发酵模式，便于控制发酵条件，缩短发酵周期；并有利于控制杂菌污染和有害产物生成，保证产品质量和安全，采用这种生产方式生产生物饲料有助于实现生产自动化，扩大生产规模，提高产品质量的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的制作方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：具体为一种制备大黄鱼生物发酵饲料的方法，包括以下步骤：
S1、将植物乳杆菌依次进行斜面培养、活化培养、种子培养和发酵培养，得到植物乳杆菌活菌；
S2、将枯草芽孢杆菌依次进行活化培养、种子培养和发酵培养，得到枯草芽孢杆菌活菌，且活化培养的培养方法为平板划线法；
S3、豆粕发酵：将初始含水率50％的豆粕接种到固态发酵培养基内，并分别依次接种植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌进行发酵培养，得到发酵豆粕；
S4、将发酵豆粕添加到大黄鱼饲料中，得到发酵饲料。
具体的，所述步骤S1中植物乳杆菌的斜面培养、活化培养、种子培养和发酵培养的具体培养方法分别为：
植物乳杆菌斜面培养：将植物乳杆菌的接种斜面在37℃恒温培养箱中培养36h后，放置于4℃冰箱保藏，每两周传代一次，得到斜面培养菌体；
植物乳杆菌活化培养：取2～3环所述斜面培养菌体接种于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、50r/min培养24h，得到活化植物乳杆菌；
植物乳杆菌种子培养：将所述活化植物乳杆菌接种到250mL三角瓶中，并且在250mL三角瓶中装入种子培养基100mL，接种量2％，37℃、50r/min培养14h，得到种子植物乳杆菌；
植物乳杆菌发酵培养：将所述种子植物乳杆菌接种到250mL三角瓶中，并且在250mL三角瓶中装入发酵培养基100mL，接种量3％，37℃、50r/min培养14h，得到植物乳杆菌活菌。
具体的，所述植物乳杆菌活化培养的液体种子培养基、植物乳杆菌种子培养的种子培养基和植物乳杆菌发酵培养中的发酵培养基的成分均为：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，CH3COONa·3H2O 5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·H2O0.25g/L，吐温80 1mL，且各培养基的PH值均为6.4。
具体的，所述步骤S2中枯草芽孢杆菌的活化培养、种子培养和发酵培养的具体培养方法分别为：
枯草芽孢杆菌活化培养：采用平板划线法将枯草芽孢杆菌菌种接种在牛肉膏蛋白胨固体平板的营养琼脂培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24h后，放置于4℃冰箱保藏，每两周传代一次，得到活化枯草芽孢杆菌；
枯草芽孢杆菌种子培养：挑取活化后的单菌落于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培养20h，得到种子枯草芽孢杆菌；
枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子枯草芽孢杆菌接种到250mL三角瓶中，并在250mL三角瓶中装入发酵培养基100mL，调节初始pH为7.0，接种量为2％，37℃、200r/min培养20h，得到枯草芽孢杆菌活菌。
具体的，所述枯草芽孢杆菌活化培养中的营养琼脂培养基的成分为：牛肉浸膏3g/L，细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，且营养琼脂培养基的PH值为7.0；
所述枯草芽孢杆菌种子培养中的种子培养基成分为：大豆蛋白胨3g/L，细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，且种子培养基的PH值为7.0；
所述枯草芽孢杆菌发酵培养中的发酵培养基成分为：可溶性淀粉15g/L，酵母粉7.5g/L，MgSO4.7H2O 2g/L，KCl 1g/L，且发酵培养基的PH值为7.0。
具体的，所述步骤S3中固态发酵培养基的成分为：豆粕50g，蒸馏水50mL。
具体的，所述步骤S3中植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌的接种量分别为：枯草芽孢杆菌接种量为8％，且枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例为1:5。
具体的，所述步骤S3中植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌的接种顺序和发酵时间分别为：接种枯草芽孢杆菌2天后接种植物乳杆菌，共发酵5天。
具体的，所述步骤S3中豆粕发酵的发酵温度为37℃。
具体的，所述步骤S4中将蛋白含量为50％的发酵豆粕添加比例22％，替代30％鱼粉，替代后发酵饲料的各原料配比为：蛋白含量为67％的鱼粉0.1、蛋白含量为65％的鱼粉0.075、蛋白含量为67％的鸡肉粉0.08、蛋白含量为60％的玉米蛋白粉0.05、蛋白含量为43％的豆粕0.1、蛋白含量为50％的发酵豆粕0.22、豆油0.2、鱼油0.5、蛋白含量为13％的面粉0.15、木薯生粉0.025、预混料0.8。
实施例一：
S1、将植物乳杆菌依次进行斜面培养、活化培养、种子培养和发酵培养，得到植物乳杆菌活菌；
步骤S1中植物乳杆菌的斜面培养、活化培养、种子培养和发酵培养的具体培养方法分别为：
植物乳杆菌斜面培养：将植物乳杆菌的接种斜面在37℃恒温培养箱中培养36h后，放置于4℃冰箱保藏，每两周传代一次，得到斜面培养菌体，；
植物乳杆菌活化培养：取2～3环所述斜面培养菌体接种于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、50r/min培养24h，得到活化植物乳杆菌；
植物乳杆菌种子培养：将所述活化植物乳杆菌接种到250mL三角瓶中，并且在250mL三角瓶中装入种子培养基100mL，接种量2％，37℃、50r/min培养14h，得到种子植物乳杆菌；
植物乳杆菌发酵培养：将所述种子植物乳杆菌接种到250mL三角瓶中，并且在250mL三角瓶中装入发酵培养基100mL，接种量3％，37℃、50r/min培养14h，得到植物乳杆菌活菌；
植物乳杆菌活化培养的液体种子培养基、植物乳杆菌种子培养的种子培养基和植物乳杆菌发酵培养中的发酵培养基的成分均为：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，CH3COONa·3H2O 5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.58g/L，MnSO4·H2O 0.25g/L，吐温80 1mL，且各培养基的PH值均为6.4；
S2、将枯草芽孢杆菌依次进行活化培养、种子培养和发酵培养，得到枯草芽孢杆菌活菌，且活化培养的培养方法为平板划线法；
枯草芽孢杆菌活化培养：采用平板划线法将枯草芽孢杆菌菌种接种在牛肉膏蛋白胨固体平板的营养琼脂培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24h后，放置于4℃冰箱保藏，每两周传代一次，得到活化枯草芽孢杆菌，且枯草芽孢杆菌活化培养中的营养琼脂培养基的成分为：牛肉浸膏3g/L，细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，且营养琼脂培养基的PH值为7.0；
枯草芽孢杆菌种子培养：挑取活化后的单菌落于装有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培养20h，得到种子枯草芽孢杆菌，且枯草芽孢杆菌种子培养中的种子培养基成分为：大豆蛋白胨3g/L，细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，且种子培养基的PH值为7.0；
枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子枯草芽孢杆菌接种到250mL三角瓶中，并在250mL三角瓶中装入发酵培养基100mL，调节初始pH为7.0，接种量为2％，37℃、200r/min培养20h，得到枯草芽孢杆菌活菌，且枯草芽孢杆菌发酵培养中的发酵培养基成分为：可溶性淀粉15g/L，酵母粉7.5g/L，MgSO4.7H2O 2g/L，KCl 1g/L，且发酵培养基的PH值为7.0；
S3、豆粕发酵：将初始含水率50％的豆粕接种到固态发酵培养基内，并分别依次接种植物乳杆菌活菌和枯草芽孢杆菌活菌进行发酵培养，枯草芽孢杆菌接种量为8％，且枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例为1:5，然后先接种枯草芽孢杆菌2天后接种植物乳杆菌，共发酵5天，得到发酵豆粕，且固态发酵培养基的成分为：豆粕50g，蒸馏水50mL，发酵温度为37℃；
S4、步骤S4中将蛋白含量为50％的发酵豆粕添加比例22％，替代30％鱼粉，得到发酵饲料，替代后发酵饲料的各原料配比为：蛋白含量为67％的鱼粉0.1、蛋白含量为65％的鱼粉0.075、蛋白含量为67％的鸡肉粉0.08、蛋白含量为60％的玉米蛋白粉0.05、蛋白含量为43％的豆粕0.1、蛋白含量为50％的发酵豆粕0.22、豆油0.2、鱼油0.5、蛋白含量为13％的面粉0.15、木薯生粉0.025、预混料0.8；
实施例二：
与实施例一不同的是：S4、将蛋白含量为50％的发酵豆粕添加比例41.5％，替代50％鱼粉，得到发酵饲料，替代后发酵饲料的各原料配比为：蛋白含量为67％的鱼粉0.1、蛋白含量为65％的鱼粉0.025、蛋白含量为67％的鸡肉粉0.08、蛋白含量为60％的玉米蛋白粉0.05、蛋白含量为50％的发酵豆粕0.415、豆油0.25、鱼油0.5、蛋白含量为13％的面粉0.15、木薯生粉0.025、预混料0.8。
对比例一：
与实施例一不同的是：采用原大黄鱼饲料，且原大黄鱼饲料的各原料配比为：蛋白含量为67％的鱼粉0.1、蛋白含量为65％的鱼粉0.1、蛋白含量为60％的鱼粉0.05、蛋白含量为67％的鸡肉粉0.08、蛋白含量为60％的玉米蛋白粉0.05、蛋白含量为43％的豆粕0.3、豆油0.15、鱼油0.5、蛋白含量为13％的面粉0.15、木薯生粉0.025、预混料0.8。
将对比例(A组)、实施例一(B组)和实施例二(C组)中的大黄鱼饲料进行养殖效果的应用实验，实验在实验在有蒸汽加热设施的温室中的水泥池中进行，海水盐度为22；p H值为8.2；实验水温控制在(22±1)℃；水体连续充气，充气后水体p H值为7.9-8.0，实验期间溶解氧为5.17～7.13mg/L；氨氮<0.0 1mg/L。试验时每天换水1/5，吸去池底的粪便及残饵。实验鱼每天分别于晨曦和黄昏时分投喂两次，投喂量根据天气及鱼的摄食情况灵活掌握，一般在鱼群上浮摄食至下沉再少量投喂才算结束；应用实验地点在XX养殖场，并分别选用六个4米*4米的水泥池进行为期60天的实验，得到以下数据：
1、生长性能(如表1所示)
表1大黄鱼生物发酵饲料饲养实验结果
组别
A
B
C
平均尾始重/g
20.6
20.6
20.6
放养尾数
2500
2500
2500
放养鱼总量/kg
51.50
51.50
51.50
收获鱼总量/kg
62.951
85.137
71.33
收获尾数
1955
2405
2155
平均尾终重/g
32.2
35.4
33.1
鱼总增重/kg
11.451
33.637
19.83
投饲量/kg
12.138
32.291
20.028
成活率/％
78.2
90.6
86.2
平均尾增重/g
11.6
14.8
12.5
增重率/％
56.3
71.8
60.7
饵料系数
1.06
0.96
1.01
饲料效率/％
94.3
104.2
99
由表1可见，实验结果表明：B组比A组提高饲料效率10.5％，C组比A组提高饲料效率4.98％。B组比A组养殖成活率提高15.9/％，C组比A组养殖成活率提高10.2％。
2、非特异性免疫力(如表2所示)
表2大黄鱼生物发酵饲料对大黄鱼非特异性免疫力的影响
组别
A
B
C
酸性磷酸酶(μmol/min/mL)
0.24
0.43
0.36
碱性磷酸酶(μmol/min/mL)
0.28
0.53
0.35
过氧化氢酶(μmol/min/mL)
24.85
17.11
12.79
超氧化物歧化酶(U/mL)
3.66
11.48
7.12
溶菌酶(μg/mL)
634.26
953.59
755.78
由表2可见，实验组碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活力均高于对照组，且均为B组>C组>A组。实验组过氧化氢酶活力均高于对照组，说明通过海带多糖可中提高过氧化氢酶活力。过氧化氢酶活力各实验组均低于对照组，说明大黄鱼生物发酵饲料不能提高过氧化氢酶活力。超氧化物歧化酶(SOD)能够清除机体内过多的自由基，是反映机体抗氧化能力的重要指标，结果显示实验组的SOD活力均明显高于对照组，且B组>C组>A组。溶菌酶存在于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞内，是脊椎动物和非脊椎动物免疫防御系统的重要组成部分之一，能水解革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖而使之细胞裂解，从而杀灭病原微生物。在本实验中实验组的溶菌酶活力均高于对照组，且B组>C组>A组。
3、消化酶(如表3所示)
表3大黄鱼生物发酵饲料对大黄鱼消化酶的影响
组别
A
B
C
脂肪酶(U/mL)
0
6.48
4.15
蛋白酶(U/g)
48.65
92.84
75.12
淀粉酶(U/dl)
320.72
531.76
408.08
由表3可见，在脂肪酶酶活力测定中，对照A组无酶活，而实验组均有酶活，且B组>C组。实验组蛋白酶和淀粉酶均高于对照组，且均为B组>C组>A组。
结论：综上各实验结果，实验B组(发酵豆粕50％添加比例22％，替代30％鱼粉)的养殖效果最佳。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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