基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物
阅读说明：本技术 基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物 (Gene transfer vector, gene transfer system containing the same, and pharmaceutical composition thereof ) 是由 田华雨 方华攀 陈杰 林琳 郭兆培 胡莹莹 陈学思 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医用材料技术领域,尤其涉及基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物。本发明提供的基因传递载体由内核和包裹在所述内核外的遮蔽层组成；内核为聚酰胺-胺、壳聚糖、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺中的任意一种接枝甲苯磺酰基精氨酸得到的阳离子聚合物；遮蔽层为聚乙二醇和聚谷氨酸的共聚物。实验表明,本发明所述载体能够在细胞水平以及体内获得显著的转染效率,同时具有显著的沉默效率。利用该基因载体介导的免疫检查点基因或免疫检查点配体基因的shRNA联合表观遗传学药物获得的药物组合物具有显著的抗肿瘤效果且能够有效抑制肿瘤的复发和转移。(The invention relates to the technical field of biomedical materials, in particular to a gene delivery vector, a gene delivery system containing the gene delivery vector and a pharmaceutical composition of the gene delivery system. The gene transfer vector provided by the invention consists of an inner core and a shielding layer wrapped outside the inner core; the inner core is a cationic polymer obtained by grafting tosyl arginine on any one of polyamide-amine, chitosan, polylysine or polyethyleneimine; the shielding layer is a copolymer of polyethylene glycol and polyglutamic acid. Experiments show that the vector can obtain remarkable transfection efficiency at a cellular level and in vivo and has remarkable silencing efficiency. The pharmaceutical composition obtained by combining the gene vector-mediated immune checkpoint gene or shRNA of the immune checkpoint ligand gene with epigenetic medicine has obvious anti-tumor effect and can effectively inhibit the recurrence and metastasis of tumor.)
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物。
背景技术
免疫治疗已经作为癌症治疗的强有力的工具。然而临床上只有少部分患者能够持久获益。这主要是因为肿瘤存在免疫逃避机制。其中一个原因是肿瘤相关抗原不足以及抗原提呈细胞呈递抗原给T细胞的能力不足，从而导致差的T淋巴细胞响应。另外一个原因是T细胞存在免疫检查点抑制依赖的免疫抑制，如在T细胞表面表达的程序性死亡(PD-1)受体与肿瘤细胞表面表达的程序性死亡配体1(PD-L1)和配体2(PD-L2)结合，导致T细胞不能发挥效应功能。
一般地，肿瘤细胞碎片能够作为肿瘤抗原，通常的手段包括光热治疗(PTT)，光动力治疗(PDT)以及化疗药物介导的免疫原性细胞死亡(ICD)。然而，光热和光动力治疗受限于光热试剂，光敏剂以及光源。此外，化疗药物通常对正常组织造成严重的毒副作用。因此急需一种高效安全的策略来促发抗原特异性的免疫响应。最近有文献报道表观遗传学调控比如DNA甲基化转移酶抑制剂(DNMTi)不仅能够上调肿瘤抗原的表达，而且也会诱导肿瘤细胞表面的I型主要组织相容性复合体(MHCI)的表达，提高抗原提呈细胞的呈递抗原效率，增强肿瘤细胞对免疫系统的可视性。
此外，免疫检查点是关键的免疫调节通路，能够使得T细胞介导的肿瘤杀伤失效。其中T细胞表面的PD-1往往会与肿瘤细胞表面的PD-L1或PD-L2结合，导致T细胞耗竭。许多靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体对于一些肿瘤具有效果，包括黑色素瘤，肝癌，非小细胞肺癌等。然而，仅仅只有小部分患者有效果且重复给药也会造成耐药性。此外，PD-1或PD-L1抗体也会造成严重的副作用比如免疫不良响应。因此，急需提供一种可替代的策略逆转T细胞耗竭同时也能避免抗体产生的副作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物。本发明基因传递载体能够在细胞水平以及体内获得显著的转染效率，利用基因传递载体介导的免疫检查点基因或免疫检查点配体基因的shRNA联合表观遗传学药物获得的药物组合物具有显著的抗肿瘤效果且能够有效抑制肿瘤的复发和转移。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供的基因传递载体，由内核和包裹在所述内核外的遮蔽层组成；所述
一些实施方案中，所述内核为聚乙烯亚胺接枝甲苯磺酰基精氨酸得到的阳离子聚合物。
本发明中，阳离子聚合物的作用在于担载基因物质。一些实施方案中，聚乙烯亚胺的分子量为600-25000，一些具体实施例中聚乙烯亚胺的分子量为1800。一些实施方案中，所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或超支化聚乙烯亚胺。
一些实施方案中，所述甲苯磺酰基精氨酸的接枝数目为1～500，即聚乙烯亚胺与甲苯磺酰基精氨酸的摩尔比为1:1～500。一些优选实施方案中，聚乙烯亚胺与甲苯磺酰基精氨酸的摩尔比为1:4～12。一些具体实施例中，聚乙烯亚胺与甲苯磺酰基精氨酸的摩尔比为1:4、1:6、1:8、1:10或1:12。
本发明中，所述遮蔽层为聚乙二醇和聚谷氨酸的共聚物。其中，聚乙二醇和聚谷氨酸按照摩尔比为1:10～200的比例发生共聚反应。一些具体实施例中，聚乙二醇和聚谷氨酸的摩尔比为1:10或1:200。
一些实施方案中，所述聚乙二醇的分子量为600-10000。一些实施方案中，所述聚谷氨酸的聚合度为10～200，聚谷氨酸的分子量为1000～30000。
本发明基因传递载体担载pDNA得到的基因传递系统在细胞水平以及体内均具有显著的转染效率。一个具体实施例中，在基因传递载体上担载绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶基因，考察了获得的基因传递系统的细胞转染能力。结果显示，本发明提供的基因传递系统具有显著的转染效率。适用于多种细胞系的转染，如MCF-7，293F，293S，CT26，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，HeLa，B16F10，293T，CV-1，MDCK，NIH-3T3，HEK-293，HT-1080，SKBR3，Vero等。
一个具体实施例中，将本发明基因传递载体担载荧光素酶基因的siRNA，对该基因传递体系的基因沉默效率进行了测定。结果显示，本发明基因传递体系具有显著的基因沉默率。本发明基因传递体系适用于多种细胞系，如COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，CHO-S，HT-1080，293T，293F，293S，BE(2)C，HuH-7,CT26，B16F10,MCF-7,HeLa，CHO，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等。
本发明还提供了所述基因传递载体的制备方法，包括：
在聚乙烯亚胺上通过酰胺缩合反应接枝对甲苯磺酰基精氨酸，获得内核；
将聚乙二醇和聚谷氨酸进行聚合反应，获得遮蔽层；
将所述遮蔽层包裹所述内核，获得所述基因传递载体。
本发明还提供一种基因传递系统，包括本发明所述的基因传递载体和基因物质。
其中，所述基因物质为DNA或RNA。
一些实施方案中，本发明基因传递系统的制备方法如下：
(1)mPEG-b-PLG的合成
以mPEG2000-b-PLG20为例,将mPEG2000-NH2、Glu(Bzl)-NCA溶解在干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在30℃下反应72h。将反应后的混合物透析、冻干。然后将冻干的固体粉末溶解在三氟乙酸中，加入33％HBr/CH3COOH溶液，室温下反应4h。无水乙醚沉降，过滤，真空抽干。将产物溶解在去离子水中，透析、冻干。
(2)PEI-RT的合成
LPEI1800-RT10为例，将LPEI1800溶解在干燥的DMF中，疏丁氧羰基和对甲苯磺酰基双保护的精氨酸溶解在干燥的DMF中。将EDCI和HOBT加入到上述精氨酸溶液中，室温下活化1h。接着将LPEI1800溶液加入其中，最后加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应72h，透析、冻干。将冻干后的固体溶解在三氟乙酸中，室温下反应4h。乙醚沉降，过滤，真空抽干，透析，冻干。其中，真空抽干运用旋转蒸发仪操作，仪器的量程为-0.1-0MPa。透析袋的截留分子量范围是300-10000Dalton。
(3)基因递送系统的制备：用去离子水将mPEG-b-PLG、PEI-RT、DNA分别配成2.5mg/mL、10mg/mL以及1mg/mL。先取相同体积的PEI-RT和DNA溶液，将两者均匀混合，室温下孵育20min，然后取等同于PEI-RT溶液体积的mPEG-b-PLG溶液加入上述复合物中，定容，室温孵育20min即为制备的基因递送系统。
本发明中，所述基因物质为shRNA或siRNA。一些实施方案中，所述基因物质为可使肿瘤细胞免疫检查点基因沉默的shRNA或siRNA，或可使免疫细胞免疫检查点基因沉默的shRNA或siRNA。一些具体实施例中，所述免疫检查点为PD-L1，所述基因物质为编码shPD-L1的质粒即pshPD-L1。
本发明还提供了本发明基因传递载体和担载基因物质的基因传递系统在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
其中，所述肿瘤包括实体肿瘤和血液瘤。
本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，本发明所述的基因传递系统和表观遗传学药物。
其中，所述表观遗传学药物包括DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂。一些具体实施例中，DNA甲基化转移酶抑制剂。在一个具体实施例中进一步优选为DNA甲基化转移酶抑制剂Zebularine。
本发明中提供的药物组合物中，DNA甲基化转移酶抑制剂作为表观遗传学调控药物用于增加肿瘤抗原的水平，同时促进抗原提呈细胞呈递抗原的能力，本发明担载高效的基因传递系统介导的免疫检查点抑制阻断逆转T细胞耗竭。该药物组合物的联合治疗策略能极大地抑制肿瘤生长且有效防止肿瘤的复发和转移，表观遗传学调控联合基因治疗介导的免疫检查点抑制阻断为肿瘤免疫治疗提供了一种理想化平台。
本发明提供的基因传递载体由内核和包裹在所述内核外的遮蔽层组成；内核为聚乙烯亚胺接枝甲苯磺酰基精氨酸得到的接枝聚合物；遮蔽层为聚乙二醇和聚谷氨酸的共聚物。实验表明，本发明所述载体能够在细胞水平以及体内获得显著的转染效率，同时具有显著的沉默效率。利用该基因载体介导的免疫检查点基因或免疫检查点配体基因的shRNA联合表观遗传学药物获得的药物组合物具有显著的抗肿瘤效果且能够有效抑制肿瘤的复发和转移。
具体实施方式
本发明提供了基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明基因传递系统的制备及体外转染效率和沉默效率的测定
1、PEI-RT的合成
以BPEI1.8k-RT10为例，将BPEI1.8k溶解在去离子水中。将Boc-Arg(Tos)-OH溶解在干燥的DMF中。EDCI和HOBT分别溶解在无水DMF中。将Boc-Arg(Tos)-OH、EDCI以及HOBT溶液混合，室温下反应1h。根据设定的BPEI1.8k与Boc-Arg(Tos)-OH投料比(见表1)，将PEI1.8k溶液加入到上述混合液中，室温下搅拌反应72h。将反应后混合物装入到透析袋中，透析、冻干。将冻干后的产物溶解在三氟乙酸中，室温下搅拌反应4h。然后用无水乙醚沉降，过滤，真空抽干。将产物溶解在去离子水中，透析，冻干。
表1 BPEI1.8k-RTs的组成
2、mPEG-b-PLG的合成。以mPEG2k-PLG20为例，将mPEG2k-NH2和Glu(Z)-NCA分别溶解在干燥的DMF中，然后室温下搅拌反应72h。将反应后混合物装入透析袋中透析，冻干。将冻干后的产物溶解在三氟乙酸中，然后往其中加入33％HBr/CH3COOH，在室温下反应4h。将反应后的混合物用无水乙醚沉降，过滤，真空抽干。将反应后产物溶解在去离子水中，透析、冻干。
3.将mPEG-b-PLG作为遮蔽层，PEI-RT作为内核，基因物质为质粒DNA，制备的基因传递系统命名为PPD，转染B16F10细胞，PEI-RT作为pGL3(荧光素酶质粒)和pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)载体的用法，具体步骤和条件如下：
(1)细胞培养
将细胞培养在体积分数10％的胎牛血清培养液中，且在37℃、体积分数为5％的CO2的恒温培养箱中培养。
(2)细胞转染
在转染之前24h，取对数期细胞，胰酶消化后用体积分数10％的胎牛血清中和，离心，将细胞悬浮起来。按照1×104细胞/孔的密度种于96孔板中，然后将其置于37℃、体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养。24h后，将载体/pDNA复合物涡旋10s，室温下孵育20min。然后0.2μgpDNA/孔加入到96孔细胞板中，培养48h。
(3)细胞转染效率的测定
a)荧光素酶活性检测
从培养箱中拿出细胞板，移除细胞培养液，用PBS洗涤3次，加入细胞裂解液，在-80℃条件下裂解20min。然后每孔加入适量的荧光素酶底物，通过酶标仪定量检测细胞转染能力。
b)绿色荧光蛋白(GFP)表达
用荧光显微镜观察GFP信号。转染的阳性细胞产生绿色荧光，没有转染的细胞则不能发出绿色荧光。运用细胞流式检测转染的阳性细胞的百分比(如表2)。
表2载体/pGFP复合物的体外最佳转染效率
(4)体外生物安全性评价
采用噻唑蓝比色法测定阳离子载体/pDNA复合物的体外生物安全性。取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，加入体积分数10％的胎牛血清的培养液稀释，以1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于37℃、含体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养。在24h后，将不同质量比的载体/pDNA复合物加入其中，培养24h，然后每孔加入20μL质量分数0.5％的噻唑蓝溶液，在37℃下继续培养4h，移出培养液，往其中每孔加入200μL DMSO。通过酶标仪检测培养板荧光吸收，检测波长为490nm。细胞的存活率按如下公式：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是样品孔的吸收，Acontrol是空白孔的吸收，每组实验重复三次，实验结果如表3所示。
表3载体/pshRNA复合物在B16F10细胞中的存活率
载体材料编号
存活率
载体与pshRNA质量比
BPEI1.8k
93％
10:1
BPEI25k
73％
10:1
BPEI1.8k-RT4
88％
10:1
BPEI1.8k-RT6
87％
10:1
BPEI1.8k-RT8
90％
10:1
BPEI1.8k-RT10
92％
10:1
BPEI1.8k-RT12
91％
10:1
PEG-b-PLG/BPEI1.8k-RT10
95％
2.5:10:1
4.将mPEG-b-PLG作为遮蔽层，PEI-RT作为内核，担载siRNA，转染细胞B16F10细胞，步骤和相关条件如下：
(1)siRNA序列为5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3’，用于沉默荧光素酶基因。
(2)细胞培养
将细胞置于含体积分数10％的胎牛血清培养液中，在37℃、体积分数为5％的CO2的恒温箱中连续培养。
(3)基因沉默
取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后用含体积分数10％的胎牛血清培养液中和，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、含体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养24h，将载体/siRNA复合物复合20min后，按照0.2μg siRNA/孔加入到细胞培养板中，培养48小时。
(4)沉默效率的测定
从培养箱中取出细胞培养板，移除细胞培养液，用PBS洗涤3次，加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min，每孔加入适量的荧光素酶底物，通过酶标仪测定细胞沉默效率(如表4)。
表4载体/siRNA复合物的体外沉默效率
载体材料编号
沉默效率
载体与siRNA质量比
BPEI1.8k
10％
10:1
BPEI25k
36％
10:1
BPEI1.8k-RT4
25％
10:1
BPEI1.8k-RT6
38％
10:1
BPEI1.8k-RT8
45％
10:1
BPEI1.8k-RT10
56％
10:1
BPEI1.8k-RT12
48％
10:1
PEG-b-PLG/BPEI1.8k-RT10
76％
2.5:10:1
实施例2本发明基因传递系统PPD体内转染效率的测试
(1)制备担载RFP报告基因的基因传递系统：按照实施例1的方法制备BPEI1.8k-RT10、mPEG-b-PLG，以mPEG-b-PLG作为遮蔽层，BPEI1.8k-RT10作为内核，基因物质为pRFP质粒，制备得到mPEG-b-PLG/BPEI-RT/pRFP复合物。
(2)4T1细胞的培养
将4T1细胞置于体积分数10％的胎牛血清培养液中孵育，在37℃下、体积分数为5％的CO2的恒温培养箱中培养。
(3)肿瘤接种
购买6-8周龄、体重20g左右的BALB/c小鼠，取对数生长期的4T1细胞，用胰蛋白酶消化，然后用细胞培养液中和胰蛋白酶，离心，PBS洗涤三次，加入PBS悬浮细胞。以3×106细胞数接种于每只小鼠腋下。10天后，肿瘤体积达到500mm3时开始进行体内转染实验。
(4)体内转染
按照每只小鼠的pRFP用量20ug，将步骤(1)制备的PEG-b-PLG/BPEI-RT/pRFP复合物的生理盐水溶液尾静脉注射小鼠体内，48h后通过离体荧光成像观察红色荧光蛋白在主要器官(心、肝、脾、肺、肾)以及肿瘤部位的表达，体内转染结果如表5所示。
表5体内转染效率的测定
实施例3本发明基因传递系统PPD的制备
按照实施例1的方法制备PEI-RT、mPEG-b-PLG，以mPEG-b-PLG作为遮蔽层，PEI-RT作为内核，基因物质为编码shPD-L1的质粒(pshPD-L1)，制备得到mPEG-b-PLG/PEI-RT/pshPD-L1(PPD)(简称为PPD)。
实施例4本发明运用DNA甲基化转移酶抑制剂(Zebularine)联合本发明担载shPD-L1质粒的基因传递系统(PPD)在体内抗肿瘤的研究
以4T1肿瘤为例，在BABL/c小鼠皮下接种4T1肿瘤模型。选择编码shPD-L1的质粒(pshPD-L1)作为治疗基因，按照实施例1的方法制备PEI-RT/pshPD-L1(PD)、mPEG-b-PLG/PEI-RT/pshPD-L1(简称为PPD)。将荷瘤小鼠分为PBS，pshPD-L1，PEI-RT/pshPD-L1(PD)，mPEG-b-PLG/PEI-RT/pshPD-L1(PPD)以及Zebularine+PPD，共5组。待小鼠肿瘤平均体积达到100mm3时，开始进行给药治疗，每隔一天给药一次，总共给药6次。从小鼠第一次给药开始，每天测量肿瘤体积以及小鼠体重的变化，观察时间为12天，然后对小鼠进行安乐死，收集肿瘤，称量肿瘤重量(如表6)。
表6体内抗肿瘤效果
载体材料编号
肿瘤平均重量(g)
pshPD-L1
2.24
BPEI1.8k/pshPD-L1
1.93
BPEI25k/pshPD-L1
1.26
BPEI1.8k-RT10/pshPD-L1(PD)
1.12
mPEG-b-PLG/BPEI1.8k-RT10/pshPD-L1(PPD)
0.73
Zebularine+mPEG-b-PLG/BPEI1.8k-RT10/pshPD-L1
0.32
由表6结果可知，本发明担载pshPD-L1的基因传递系统(PPD)对肿瘤具有明显抑制作用，PPD与Zebularine联用组对肿瘤具有更加显著的抑制效果，效果显著优于其他各组(p<0.01)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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