发明内容

针对当前组织工程产品脱细胞皮肤支架的功能不足问题，本发明的目的是提出一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，制备一种可以用来激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，包括以下步骤：

1)利用脱细胞方法获得人和猪的皮肤支架；

2)将人和猪的皮肤支架进行蛋白裂解，获取能激活干细胞功能的活性蛋白成分；

3)利用串联质谱鉴定上述活性蛋白成分，获得人和猪的皮肤基质蛋白成份；

4)基于人和猪的皮肤基质蛋白成份，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白；

5)比较人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白的成分差异，找出人特有蛋白；

6)通过生物信息学工具对人特有蛋白进行功能分析，获得能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分；

7)利用上述能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分和猪的皮肤基质蛋白成分，制备可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。

进一步地，步骤1)中的脱细胞方法为：用电动皮肤采集器切割采集人和猪的皮肤组织，皮肤组织去除表皮，得到去细胞真皮样品；将去细胞真皮样品清洗，然后利用酶进行脱细胞。

进一步地，步骤1)中脱细胞后，通过定量胶原的数量来测试皮肤支架的完整性，并使用胶原检测试剂盒定量胶原蛋白含量，具体地通过测定胶原蛋白的吸光度来测量其浓度；然后用硫酸化糖胺聚糖法测定GAG含量，通过测定指示剂的吸光度来测量其浓度；当上述测量的浓度达到一预设标准时，则认定获得的皮肤支架具备完整性。

进一步地，步骤2)中的蛋白裂解的方法为：将去细胞化的人和猪的皮肤支架匀浆，用蛋白提取试剂(Sigma-Aldrich)提取活性蛋白成分。

进一步地，步骤2)中在提取活性蛋白成分以后，离心30分钟，将上清液转移到干净的试管中并在-80℃下储存。

进一步地，步骤2)中从裂解的蛋白中提取肽段，并将肽段混合物使用配备有简易nLC纳米流液相色谱系统(Thermo Fisher Scientific)的Orbitrap Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。

进一步地，步骤3)中利用Matrisome数据库对质谱鉴定的人和猪的活性蛋白成分进行比对，获得人和猪的皮肤基质蛋白成分。

进一步地，步骤4)中利用David工具对人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白进行功能富集，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白，该基质蛋白包括：对于人的皮肤基质，多为酶、酶抑制剂、生长因子、胰岛素因子、转化生长因子、抗微生物、抗血管生成等蛋白成分；对于猪的皮肤基质，多为金属结合、酶抑制剂和基底膜相关蛋白。

进一步地，步骤5)中人特有蛋白包括：COL4A6COL28A1、COL11A1、FMOD、LUM、OGN、OMD、PRG3、PRG2、ADIPOQ、FBLN2、VTN WISP2、SPARC、ELN、EFEMP2、CTHRC1、THBS3、COMP、HMCN1、CILP、MGP、LTBP4、THBS2、LTBP1、THBS4、SRPX2、IGFALS、VWA5A、FBLN7、PXDN、MFGE8、MXRA5、THSD4、VIT、MMRN2、ECM2、MATN4、MMRN1、SNED1、HMCN2、LAMB4、SERPINA1、CTSG、HTRA1、SERPINF1、SERPING1、SERPINA3、HRG、KNG1、SERPINB6、F2、SERPINF2、SLPI、MMP19、TIMP3、CST6、CSTB、AGT、MMP12、SERPINA6、ITIH3、ITIH5、SERPINA4、P4HA2、TGM2、CTSC、A2ML1、SERPINB3、CTSZ、CPN2、SERPINE2、SERPINA5、CTSK、SERPINB8、F12、F9、CTSV、MMP14、SERPINB4、F10、SERPINB9、SERPINB7、PAPPA、P4HA1、PLOD3、LPA、LGALS1、C1QB、C1QTNF3、ANXA8L1、CLEC11A、C1QTNF7、S100A6、S100A8、CXCL12、S100A13、CXCL14、S100B、S100A2、ANGPTL2、SFRP2、S100A7、MEGF6、CCL18、ANGPTL5、MST1L、TGFB1。

进一步地，步骤6)中的能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分包括：TGFBI、ANXA2、COL7A1、VTN、FBN1、HSPG2、COL5A1、LAMC1、TNC、LAMB2、SERPINF1、NID1、NID2、COL4A1、VWA1、COL18A1、EFEMP2、LAMA4、LAMA3、MATN2、HMCN1、LAMA5、TIMP3、LAMB1、THBS2、COL17A1、COL28A1、THBS4、LAMA2、COL2A1、MMRN2、HMCN2、LAMB4、LAMC3、FRAS1、LOXL1、FREM2。

进一步地，根据已有的评价脱细胞皮肤支架功能性数据中的蛋白分子列表对能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分进行比对，比较重合的蛋白成分多少，重合的越多证明支架产品功能性越强，当重合数量达到某一门槛值时，则判定为能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分合格。

本发明具有以下优点：

1.本发明提出了一种新的生物材料的制备方法，并利用系统生物学对本发明制备的生物材料进行生物活性和功能性鉴定，证明本发明材料活性成分全部保留，并能够促进皮肤再表皮化，毛囊干细胞活性，创面血管的生成，创面成纤维细胞的趋化，生长和增殖等各项功能性指标，更有利于创面的愈合和延缓皮肤衰老。

2.本发明制备的材料保留了皮肤干细胞重要的微环境，能够维持皮肤干细胞极性和命运决定能力。

3.本发明制备的材料的成分和空间组成为其它生物材料的功能和应用评价提供了新标准。另外，产品剂型还可以制成粉剂、液剂和凝胶等不同形状，均具有有效功能，让使用更灵活，甚到更简单、方便、无痛。