一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗
阅读说明：本技术 一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗 (Fusion protein for porcine epidemic diarrhea virus and recombinant protein vaccine ) 是由 刘昕 赖强 王弋 吴培枫 陈怡林 郑飞 谢汝祝 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物基因工程的技术领域,具体涉及一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗。所述融合蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白中的单体蛋白RBD或二聚体蛋白2RBD与猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白融合得到；所述重组蛋白疫苗为将上述融合蛋白构建在表达载体上,经转化、诱导得到；采用毕赤酵母甲醇诱导表达系统,对毕赤酵母密码子优化修饰后的pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD进行高效表达,适度的糖基化修饰及二硫键的形成提高了其稳定性,表达的重组蛋白能够快速诱导机体产生高水平的抗体,二聚化2RBD克服了RBD单体免疫原性不足的缺点,显著提高了中和抗体水平。(The invention belongs to the technical field of biological genetic engineering, and particularly relates to a fusion protein for porcine epidemic diarrhea virus and a recombinant protein vaccine. The fusion protein is obtained by fusing a monomeric protein RBD or a dimeric protein 2RBD in the porcine epidemic diarrhea virus S protein with a swine escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protein; the recombinant protein vaccine is obtained by constructing the fusion protein on an expression vector, and carrying out transformation and induction; the pichia pastoris methanol induction expression system is adopted to efficiently express pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD after codon optimization modification of pichia pastoris, proper glycosylation modification and disulfide bond formation improve the stability of the pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD, expressed recombinant protein can quickly induce an organism to generate high-level antibody, and dimerized 2RBD overcomes the defect of insufficient immunogenicity of RBD monomers and obviously improves the level of neutralizing antibody.)
技术领域
本发明属于生物基因工程的
技术领域
，具体涉及一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗。背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是一种常见的、急性、高度流行性的猪肠道病毒传染病，病原为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。该病主要临床症状是腹泻，包括水样腹泻，以及其它包括呕吐、厌食、脱水和体重降低等症状，临床变化和症状与猪传染性胃肠炎(TGE)，猪流行性腹泻是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。
猪流行性腹泻病毒S蛋白由1383或1386个氨基酸组成，属于型糖蛋白，分子质量为180-220ku、位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，它在识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合中发挥重要地生物学作用。由于其含有PEDV主要的抗原决定簇，有很好的免疫原性，故在机体的抗病毒免疫中起重要作用。根据与其他冠状病毒S蛋白同源性也可被分为S1(1-789aa)和S2(790-1,383aa)结构域。S1区中的受体结合区域RBD具有重要的构象中和表位，且保守性强，是开发PEDV疫苗的理想抗原。
PEDV的免疫主要依靠黏膜免疫(sIgA)，而不是IgG的水平，研究表明，高水平的母源sIgA与保护仔猪抵抗PEDV感染有关，而血液中的中和抗体与对新生仔猪的保护性没有相关性。因此，如何刺激动物机体产生高效价的分泌型IgA抗体，是疫苗免疫以及PED防治的关键。
现有技术中猪流行性腹泻的相关研究中存在表达量不高、免疫原性低及蛋白不稳定、不能有效地刺激黏膜免疫等问题。猪流行性腹泻疫苗相关蛋白的外源表达主要在大肠杆菌、毕赤酵母、动物细胞三种表达系统中的表达，在大肠杆菌表达系统缺少将蛋白质有效的释放分泌机制，面临产量小、包涵体表达的问题，存在变复性、去除内毒素及热源等繁琐的蛋白纯化工艺；同时大肠杆菌表达系统无法有效形成二硫键，不利于目标蛋白的正确折叠，影响其天然构象及稳定性，进而影响其免疫原性。利用动物细胞表达则存在着工业复杂、成本较高、大规模产业化生产较为困难的情况。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗，利用高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达系统，采用pLTB与PEDV-S-RBD/2RBD的融合蛋白表达得到，充分发挥pLTB黏膜佐剂的功效及PEDV-S-2RBD的高免疫原性。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白为猪流行性腹泻病毒的S蛋白中的RBD区域蛋白(PEDV-S-RBD/PEDV-S-2RBD)与猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白(pLTB)融合得到；
所述猪流行性腹泻病毒的S蛋白中的RBD区域蛋白包括PEDV-S-RBD或PEDV-S-2RBD，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示；
所述PEDV-S-RBD和PEDV-S-2RBSD经毕赤酵母密码子优化后的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示；
所述融合蛋白用于制备猪流行性腹泻病毒的重组蛋白疫苗。
本发明还提供了一种用于猪流行性腹泻病毒的重组蛋白疫苗，
所述重组蛋白疫苗为将猪流行性腹泻病毒的S蛋白中的单体蛋白RBD(PEDV-S-RBD)或二聚体蛋白(PEDV-S-2RBD)，以及猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(pLTB)的蛋白构建在表达载体上，经转化、诱导得到；
相较于其他源LTB，pLTB对猪机体是一种理想的黏膜佐剂，以及抗原PEDV-S-RBD/PEDV-S-2RBD具有较强的免疫原性，快速诱导机体产生高水平的抗体；
所述PEDV-S-2RBD为PEDV-S-RBD串联得到，增加免疫原性；
所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示，或为具有同源性80-100％的氨基酸序列；所述重组蛋白疫苗的氨基酸经毕赤酵母密码子优化后的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示，或为具有同源性50-100％的核酸序列。
所述猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，其经毕赤酵母密码子优化后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；
所述表达载体包括毕赤酵母表达载体pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P、pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHIL-D2、pACO815、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pPink-hc的一种；
所述转化的宿主菌包括毕赤酵母宿主菌X33、GS115、KM71、SMD1168、SMD1165、SMD1163、Y-11430、M-G100-3、配套毕赤酵母Pichiapink的一种。
本发明还提供了一种上述重组蛋白疫苗用于制备猪流行性腹泻亚单位疫苗或制备口服疫苗。
本发明还提供了一种上述用于猪流行性腹泻病毒的重组蛋白疫苗的制备方法，包括如下步骤：
将猪流行性腹泻病毒的S蛋白中的单体RBD蛋白或二聚体RBD蛋白2RBD，与猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位连接，在目的基因C端引入标签和终止密码子，上下游引入酶切位点，合成于载体质粒上，双酶切后克隆至表达载体上，采用毕赤酵母甲醇诱导表达系统进行表达、诱导、纯化后，与佐剂配制后得到猪流行性腹泻病毒的重组蛋白疫苗，采用毕赤酵母甲醇诱导表达系统利于pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD二硫键的形成，同时适度的糖基化修饰，增加了蛋白的稳定性。
本发明的有益效果如下：
本发明的猪流行性腹泻的融合蛋白，采用猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基pLTB与抗原PEDV-S-RBD/PEDV-S-2RBD进行融合表达，高效地刺激机体的免疫应答，刺激黏膜免疫元件也可以选择其他具有刺激黏膜免疫的蛋白，用于接种猪只后可刺激猪自身机体产生强烈的系统免疫应答和黏膜免疫应答，所述融合蛋白不仅可用于制备猪流行性腹泻亚单位疫苗，还可经一定的包材处理及结合相关技术手段用于口服疫苗的开发制备；
本发明的猪流行性腹泻的重组蛋白疫苗，利用高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达系统，采用pLTB与PEDV-S-RBD/2RBD的融合蛋白表达得到，充分发挥pLTB黏膜佐剂的功效及PEDV-S-2RBD的高免疫原性；
本发明的疫苗制备方法中，采用毕赤酵母甲醇诱导表达系统，对毕赤酵母密码子优化修饰后的pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD进行高效表达，适度的糖基化修饰及二硫键的形成提高了pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD的稳定性，表达的重组蛋白能够快速诱导机体产生高水平的抗体，解决现有表达系统及相关生物技术制备的猪流行性腹泻疫苗相关重组蛋白含量低、免疫原性低、稳定性差、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题。
附图说明
图1为实施例中重组质粒的构建示意图；
图2为实施例中转化感受态DH5α重组菌的PCR鉴定结果图；
图3为实施例中重组酵母菌的PCR鉴定结果图；
图4为重组酵母菌诱导表达的上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳结果图；
图5为ELISA法测定抗体水平的结果图；
图6为中和抗体滴度的测定结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
一种猪流行性腹泻病毒的重组蛋白疫苗及其制备：
1)融合蛋白及重组质粒构建
根据PEDV的S蛋白中的RBD区域(GenBank上登陆号为AG C93002.1)、猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB，GenBank上登陆号为FJ156281)及表达载体pPICZαA图谱，在目的基因的C端引入组氨酸标签(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，其经毕赤酵母密码子优化后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示)及终止密码子TAA，上游引入EcoRI酶切位点，下游引入XbaI酶切位点，得到重组质粒，构建示意图如图1所示；
相关序列经毕赤酵母密码子优化后送广州金唯智生物科技有限公司进行全基因合成至pUC57质粒上。获得的质粒PEDV-S-RBD-pUC57、PEDV-S-2RBD-pUC57经EcoRI、XbaI双酶切后获得的目的片段克隆至经相同双酶切的毕赤酵母表达载体pPICZαA上，并进行T4连接酶连接及转化感受态DH5α；
所述毕赤酵母表达载体还可以为pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P、pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHIL-D2、pACO815、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pPink-hc的一种，在此不做重复赘述；
2)重组阳性转化子的PCR鉴定
鉴定引物α-factor和3’Aox1由广州金唯智生物科技有限公司合成，所述引物α-factor和3’Aox1的序列分别如序列表序列表SEQ ID NO.13和序列表SEQ ID NO.14所示；
PCR鉴定体系及程序如下表所示，PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。
表1 PCR鉴定体系
表2 PCR鉴定程序
挑取PCR鉴定为阳性菌进行质粒抽提并测序鉴定，如图2所示，PCR鉴定结果显示：各组质粒pLTB-PEDV-S-RBD-H-pPICZαA-DH5α、pLTB-PEDV-S-2RBD-H-pPICZαA-DH5α均为阳性，质粒测序结果显示各组测序正确，质粒构建成功。
3)重组质粒的酶切线性化及纯化回收
参考TAKARA公司酶切试验手册，用Sac I单酶切各重组质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检测线性化完全。对线性化产物进行纯化回收，纯化回收方法参考试剂盒使用说明书。
4)毕赤酵母X33感受态细胞的制备
4.1)接种毕赤酵母宿主菌单菌落X33于YPD平板，30℃培养2天；
所述毕赤酵母宿主菌还可以为GS115、KM71、SMD1168、SMD1165、SMD1163、Y-11430、M-G100-3、配套毕赤酵母Pichiapink的一种；
4.2)挑取平板上的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
4.3)过夜培养后按1％左右的接种量接种到100mL YPD培养基中震荡培养至OD值1.2～1.5；
4.4)4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
4.5)4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
4.6)再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
4.7)20ml，1mol/L山梨醇洗涤1次；
4.8)将菌体溶于1mL，1M预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化。
5)线性化表达质粒电转化毕赤酵母X33感受态细胞
5.1)准备好80L的酵母感受态与线性化的质粒1-5μg(冰上预冷15min)混合，迅速放入0.2cm的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌)，电击；电转参数为Voltage：1500V；Capacitance：25μF；Resistance：200Ω；Cuvette(mm)：2mm；
5.2)电击结束，迅速加入1mL山梨醇(1M)，冰上静置15min，随后30℃温箱中静置培养1h。再加入1mLYPD液体培养基，30℃，200r/min振荡培养1小时，常温4000r/min离心收集菌体，涂至含有100μg/μL的YPDS平板中30℃静置培养3d。
6)重组酵母菌的鉴定及高拷贝的筛选
用灭菌枪头细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，接种于2mL的YPD液体培养基中(含150μg/mL Zeocin)，30℃，200r/min振荡培养过夜。
采用菌液PCR分析P.pastoris转化子，PCR鉴定体系同表1，PCR鉴定程序表3，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定引物能扩增出目的条带的克隆定为阳性转化子。
表3重组酵母菌液PCR鉴定程序
高拷贝的筛选需结合PCR鉴定中的条带亮度及高抗性YPD平板(200μg/mLZeocin)试验结果。
重组菌液PCR鉴定结果显示：pLTB-PEDV-S-RBD-pPICZαA-X33、pLTB-PEDV-S-2RBD-pPICZαA-X33有阳性重组酵母菌株，电转化X33成功。
选取相应菌株进行YPD(含100μg/mLZeocin)平板划线，用于酵母诱导表达。
7)高拷贝重组酵母菌的诱导表达
7.1)用灭菌枪头细挑YPD平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于20mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD600＝2～6，此时细胞处于对数生长期；
7.2)3000r/min室温离心5min收集沉淀，重悬于1mL的BMMY中，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在250mL的三角锥瓶中振荡培养；
7.3)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养；
7.4)培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE或置于-80℃保存。
8)重组酵母菌诱导表达上清的Tricine-SDS-PAGE
重组酵母菌诱导表达的上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳，设置相应的空质粒pPICZαA-X33对照组，蛋白上样缓冲液为5×Loading Buffer，上样量为12L。
结果如图4所示，表明该酵母表达系统能够有效表达pLTB-PEDV-S-RBD-H及pLTB-PEDV-S-2RBD-H，并进行适度的糖基化修饰。
9)表达产物的纯化回收
诱导表达上清的纯化结合His Tag进行镍柱亲和层析方法进行蛋白的吸附、洗脱纯化，利用透析法进行咪唑的去除后测定浓度，各组样品纯化后浓度见下表4，将各组样品进行冻干保存备用。
表4各组样品纯化后的浓度
10)免疫小鼠及其抗体的测定
将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组(每组5只)：pLTB-PEDV-S-RBD-H组、pLTB-PEDV-S-2RBD-H组、商品灭活疫苗组、空白对照组。采用腹部皮下多点注射免疫，试验第1天进行初次免疫，试验第28天进行加强免疫，各试验组每次免疫剂量相同，均为60μg，体积为200μL，商品灭活疫苗组、空白注射组注射等体积的PBS(pH7.2，0.01M)。分别在二免14天后进行尾部采血，收集血清，用间接ELISA法测定抗体水平。
如图5所示，结果显示pLTB-PEDV-S-RBD-H组、pLTB-PEDV-S-2RBD-H组产生的抗体水平高于商品化的灭活疫苗。
11)血清中和试验中中和效价及抗体滴度的测定
对第42d的血清进行血清中和试验，结果显示实验组及商品化灭活疫苗组的中和抗体效价均显著高于PBS对照组。其中pLTB-PEDV-S-RBD-H、pLTB-PEDV-S-2RBD-H实验组中的中和抗体效价与灭活疫苗组相当(如表5)。
表5中和抗体效价
抗体滴度测定试验中pLTB-PEDV-S-RBD-H、pLTB-PEDV-S-2RBD-H实验组及商品化灭活疫苗组中和抗体滴度均高于24，可见本发明制备的猪流行性腹泻病毒的重组蛋白疫苗(亚单位疫苗)可以起到很好的保护作用，为PEDV的防控提供了有效的技术手段。
由上可见，本发明采用猪源大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基pLTB与抗原PEDV-S-RBD/PEDV-S-2RBD进行融合表达，用于接种猪只后可刺激猪自身机体产生强烈的系统免疫应答和黏膜免疫应答，利用高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达系统，采用pLTB与PEDV-S-RBD/2RBD的融合蛋白表达得到，该融合蛋白能够充分发挥pLTB黏膜佐剂的功效及PEDV-S-2RBD的高免疫原性，适度的糖基化修饰及二硫键的形成提高了pLTB-PEDV-S-RBD/2RBD的稳定性，表达的重组蛋白能够快速诱导机体产生高水平的抗体。
序列表
<110> 广州源博医药科技有限公司
<120> 一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗
<141> 2021-07-30
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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accaaaattg ataagttgtg tgtctggaat aataagaccc caaactccat cgccgcaatt 360
tctatgaaga acaatttgtt gtctcacgaa caaccaattt cttttgttac attgccatca 420
ttcaatgatc attctttcgt taatattact gtttctgctt cttttggtgg tcattctggt 480
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agacaattta ctatctcttt gttctataac gttactaact cttacggtta tgtttcaaaa 600
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cctgaatttg gttctggtgt caaatttact tctttgtatt ttcaatttac taaaggtgaa 780
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1 5 10 15
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aaattttgtg tttctacttc tttgttggct tctgcttgta ctattgattt gtttggttac 720
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tctatgaaga ac 372
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