一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用
阅读说明：本技术 一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用 (Beauveria bassiana and application thereof in preventing and treating scarab beetles ) 是由 吴娱 刘春琴 王庆雷 时荣荣 冯晓洁 刘福顺 张悦 束长龙 张�杰 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用。所述布氏白僵菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23049。(The invention relates to beauveria bassiana and application thereof in preventing and treating scarab beetles. The Beauveria bassiana is preserved in the China general microbiological culture Collection center of the China Committee for culture Collection of microorganisms, and the preservation number is CGMCC No. 23049.)
技术领域
本发明涉及一种白僵菌，特别是其可以用于防治金龟子。
背景技术
地下害虫是重要的农田害虫，其中尤以蛴螬、地老虎、金针虫、根蛆、蝼蛄等类群发生普遍，危害严重。近年来,随着气候变暖、水利设施完善、耕作制度变化及种植农业结构调整，尤其是地面覆盖保温技术的推广，给地下害虫创造了一个十分有利的生存环境，导致了农作物地下害虫发生为害日益严重。
由于地下害虫隐蔽于地下，其防治也是历年来防治的难点，长期以来主要依赖化学农药控制。化学农药的长期大量使用，造成水土环境污染，作物农药残留超标，直接影响农业的经济效益，农残超标的食物还严重威胁人畜安全和社会安定，已引起政府及社会各界广泛关注，因此生物防治越来越受到重视。
发明内容
本发明之一提供了一种布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23049。
本发明之二提供了一种工程菌，其通过对如本发明之一所述的布氏白僵菌进行遗传改良后得到。其中，由于该工程菌是以本发明的布氏白僵菌CGMCC No.23049为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或DNA片段等，因此，该工程菌仍然为布氏白僵菌。另外，该工程菌可以为提高了对金龟子害虫活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性和/或被赋予了其他有益特性的工程菌株。
在一个
具体实施方式
中，所述工程菌通过向所述布氏白僵菌转化携带抗病基和/或抗虫基因的质粒得到。
本发明之三提供了一种组合物，其包括如发明之一所述的布氏白僵菌或如发明之二所述的工程菌，和可接受的载体。
本发明之四提供了根据本发明之一所述的布氏白僵菌、本发明之二所述的工程菌或本发明之三所述的组合物在用于防治金龟子(Scarabaeidae)中的应用。
在一个具体实施方式中，所述金龟子为鳃金龟(Holotrichia)和/或丽金龟(Anomala)。
在一个具体实施方式中，所述鳃金龟(Holotrichia)为暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)和/或大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)；所述丽金龟(Anomala)为铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)。
在一个具体实施方式中，所述金龟子(Scarabaeidae)为卵和/或幼虫期金龟子。
在一个具体实施方式中，所述鳃金龟(Holotrichia)为卵和/或幼虫期鳃金龟(Holotrichia)；所述丽金龟(Anomala)为卵和/或幼虫期丽金龟(Anomala)。
在一个具体实施方式中，所述暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)为卵和/或幼虫期暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)；所述大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)为卵和/或幼虫期大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)；所述铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)为卵和/或幼虫期铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)。
本发明的有益效果：
本发明发现布氏白僵菌中存在对金龟子，特别是对金龟子的卵和幼虫有高杀虫活性的菌株。这不但拓宽了布氏白僵菌的用途，也拓宽了防治金龟子的手段。
附图说明
图1显示了编号为CZBJ-1的分离菌株的系统发育树。
菌种保藏
本发明筛选的布氏白僵菌被定名为CZBJ-1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23049，保藏日期为2021年7月15日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
实施例1
菌株的分离与分类鉴定
挑取暗黑鳃金龟成虫病虫体表菌丝，接种于PDA培养基上，在26℃下经多次分离培养纯化，得到纯化的分离菌株。对分离菌株进行编号。
1.分离菌株的形态学鉴定
编号为CZBJ-1的分离菌株在在PDA平板上菌落初期呈白色棉絮状菌丝，培养7至10天左右可产生分生孢子，白色粉状，后期变为淡黄色，背面呈红色或紫红色。显微镜下可见分生孢子梗和分生孢子，分生孢子椭圆形，大小为2.0-3.0×3.0-6.0μm。基于以上形态学观察，初步鉴定为白僵菌属(Beauveria)。
2.分离菌株的分子鉴定
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成真菌通用引物ITS1(SEQ ID No.1)和ITS4(SEQ ID No.2)。以提取的编号为CZBJ-1的分离菌株的基因组DNA为模板，ITS1和 ITS4为引物进行PCR扩增得到PCR产物。将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序，所测序列的结果如SEQ ID No.3所示。将测序结果经Genbank数据库中进行同源性 BLASTE比对，比对结果显示菌株CZBJ-1的PCR扩增序列与布氏白僵菌的序列同源性达 98％以上。用MEGA7软件建立系统发育树，见图1。根据图1的系统发育树可知，菌株 CZBJ-1与布氏白僵菌聚合在一起。
综上，编号为CZBJ-1的分离菌株的系统分类为布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)。
将CZBJ-1菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.23049，保藏日期为2021年7月15日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)。
实施例2
生物活性分析
(1)暗黑鳃金龟1龄幼虫的生物活性测定
利用PDA培养基对纯化的分离菌株进行扩繁，即在PDA培养基上在26℃下培养7至10天，刮取分生孢子粉，然后用0.1％Tween-80无菌水配制成1.4×108、2.8×107、5.6×106、1.12×105和0.22×104孢子/ml的孢子悬浮液。
制备得到土豆丝，将土豆丝用清水冲洗，晾至表面无水分。将土豆丝分别浸泡于孢子悬浮液中，约20min后取出，均匀放于6孔生测板中，每孔约4-5条，剩余的孢子悬浮液拌于100g灭菌的干燥土中，并混匀，使土的湿度为18％，最终生测浓度为2.52×107， 5.05×106，1.01×106，2.02×104，0.4×103孢子/g土。将拌好的土均匀分装至相应浓度下的6孔生测板中，每个孔内接入1头1龄(孵化6日龄幼虫)暗黑鳃金龟的幼虫，放置于温度为 26℃，光照为L:D＝16:8的培养箱中饲养。每个重复30头，3个重复。以0.1％Tween-80无菌水作为阴性对照，将其加入到灭菌的干燥土中，以使土的湿度为18％。15天后调查死、活虫数，用Excel2007计算平均死亡率和校正死亡率，用SPSS 17.0进行方差分析。
结果见表1。
(2)暗黑鳃金龟2龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为暗黑鳃金龟2龄幼虫(孵化15日龄幼虫)，其他同实施例2中的(1)小节。
结果见表1。
(3)暗黑鳃金龟3龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为暗黑鳃金龟3龄幼虫(孵化45日龄幼虫)，其他同实施例2中的(1)小节。
(4)暗黑鳃金龟卵的生物活性测定
向100g灭菌的干燥土中加入孢子悬浮液，混匀，得到待测土样，将待测土样装入16.5cm×17cm×12cm(长×宽×高)的食品塑料盒中，挑取暗黑鳃金龟新产5天的卵均匀放置入待测土样中，每盒50粒，3个重复。孢子悬浮液的制备和浓度梯度同实施例2中的(1) 小节。以0.1％Tween-80无菌水作为阴性对照，将其加入到灭菌的干燥土中，以使土的湿度为18％。15天后调查卵的侵染情况。
结果见表1。
表1
注：P<0.05
(5)大黑鳃金龟1龄幼虫的生物活性测定
制备的孢子悬浮液浓度梯度为3.0×108，6.0×107，1.2×107，2.4×106，4.8×105孢子/ml。将孢子悬浮液拌于灭菌的干燥土中，得到的待测土样中孢子的浓度为5.4×107，1.08×107， 2.16×106，4.32×105，8.64×104孢子/g土。
采用的试虫为大黑鳃金龟1龄幼虫(孵化6日龄幼虫)。
其他同实施例2中的(1)小节。
结果见表2。
(6)大黑鳃金龟2龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为大黑鳃金龟2龄幼虫(孵化15日龄幼虫)，其他同实施例2中的(5)小节。
结果见表2。
(7)大黑鳃金龟3龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为大黑鳃金龟3龄幼虫(孵化45日龄幼虫)，其他同实施例2中的(5)小节。
(8)大黑鳃金龟卵的生物活性测定
向100g灭菌的干燥土中加入孢子悬浮液，混匀，得到待测土样，将待测土样装入16.5cm×17cm×12cm(长×宽×高)的食品塑料盒中，挑取大黑鳃金龟新产5天的卵均匀放置入待测土样中，每盒50粒，3个重复。孢子悬浮液的制备和浓度梯度同实施例2中的(5) 小节。以0.1％Tween-80无菌水作为阴性对照，将其加入到灭菌的干燥土中，以使土的湿度为18％。15天后调查卵的侵染情况。
结果见表2。
表2
注：P<0.05
(9)铜绿丽金龟1龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为铜绿丽金龟1龄幼虫(孵化6日龄幼虫)，其他同实施例2中的(5)小节。
结果见表3。
(10)铜绿丽金龟2龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为铜绿丽金龟2龄幼虫(孵化15日龄幼虫)，其他同实施例2中的(5)小节。
结果见表3。
(11)铜绿丽金龟3龄幼虫的生物活性测定
采用的试虫为铜绿丽金龟3龄幼虫(孵化45日龄幼虫)，其他同实施例2中的(5)小节。
(12)铜绿丽金龟卵的生物活性测定
采用的测试对象为铜绿丽金龟新产5天的卵，其他同实施例2中的(8)小节。结果见表3。
表3
注：P<0.05 。
序列表
<110> 沧州市农林科学院
<120> 一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用
<130> LHA2160430
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 545
<212> DNA
<213> 布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)
<400> 3
ggacttcgag ttttactccc taacccttat gtgaacctac ctattgttgc ttcggcggac 60
tcgccccagc cggacgcgga ctggaccagc ggccgccggg gaccctcaaa ctcttgtatt 120
atcagcatct tctgaatacg ccgcaaggca aaacaaataa atcaaaactt tcaacaacgg 180
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agaatccagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagca ttctggcggg 300
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aacgttgacc tcgaatcagg taggactacc cgctgaactt aagcatatca ataaggccgg 540
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