具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明提供了一种免疫细胞，免疫细胞的细胞膜上表达嵌合抗原受体并且在所述嵌合抗原受体的胞内域结构中加入了合成纤连蛋白(Fibronectin，FN)基因，可在细胞内合成纤连蛋白。

细胞外泌体，属于细胞外囊泡(ev)的一个亚群，由体内大多数细胞分泌而成。ev可根据其生物起源分为3个亚组，包括外泌体(30-150nm)、微囊泡(150-1000nm)和凋亡小体(50-2000nm)。外泌体是不同细胞间通讯的载体，可调节多种生理病理反应；比如，A细胞通过外泌体将自己的内容物，如，基因转运给B细胞，可对后者(即B细胞)产生相应作用：细胞增殖与分化、细胞转移与侵袭、细胞凋亡、血管生成、代谢调控、免疫调节、炎症反应、病毒感染等。已有研究表明，CAR-T细胞产生的外泌体表明具有CAR结构的表达，并且无PD-1表达，不受其通路抑制；且外泌体中包含有颗粒酶B及穿孔素等抗肿瘤成分。

纤连蛋白是一种分泌的糖蛋白，以可溶性形式在血浆中循环，以不可溶性纤维形式与几乎所有细胞类型的细胞外基质结合，在那里它是细胞粘附和迁移的主要底物。血浆纤连蛋白是由肝细胞产生的，无论在体内还是体外它可以被纳入细胞外基质中。纤连蛋白参与了许多生理过程，包括凝血、吞噬细胞(调节活性)摄取和随后清除血源性颗粒和细菌、伤口愈合和组织再生、新生血管、以及胚胎发育过程中复杂形态发生运动的编排。纤连蛋白缺失小鼠在胚胎发育过程中因严重的心血管缺陷而死亡，这一事实证明了其对器官发生和组织稳态的重要性。

免疫细胞可以为T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞、TCR-T细胞、MSC细胞或IPS细胞。

一个实施例中，嵌合抗原受体及合成纤连蛋白的基因构建于一个质粒表达框后转入免疫细胞中。

嵌合抗原受体及合成纤连蛋白的基因构建所述质粒表达框后通过递送系统转入所述免疫细胞。

嵌合抗原受体及合成纤连蛋白的基因构建质粒表达框后通过递送系统转入免疫细胞。较优地，递送系统包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导及转座子中的一种。

嵌合抗原受体的胞外结构域包括抗原结合结构域；所述嵌合抗原受体的跨膜结构域包括三种跨膜结构中的一种，该三种跨膜结构分别是CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域、CD8的铰链区和4-1-BB的跨膜结构域、CD8铰链区和ICOS的跨膜结构域；所述嵌合抗原受体的细胞内结构域包括共刺激信号传导区和CD3ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分，共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。

抗原结合结构域包括scFv，且scFv为uPAR；嵌合抗原受体的跨膜结构域包括CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域、CD8的铰链区和4-1-BB的跨膜结构域或4-1-BB或者ICOS的共刺激结构域。

scFv可以选自单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人抗体、纳米抗体和合成抗体中的一种或几种。

所述细胞内结构域包括共刺激信号传导区、CD3ζ链部分及纤连蛋白的基因；细胞内结构域为CD28、4-1-BB(也就是CD137(4-1-BB))、ICOS的共刺激结构域中的一个与胞内激活信号CD3ζ的组合。

合成的纤连蛋白与嵌合抗原受体结构之间通过分割蛋白切割，其中分割蛋白包括P2A、T2A、F2A、E2A。

外泌体是由表达嵌合抗原受体及合成纤连蛋白的免疫细胞生产获得，生产的外泌体的纯化方式包括超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、PS亲和法、色谱法。

本发明中，免疫细胞外泌体膜表面可以表达CAR(嵌合抗原受体)，具有特异性识别衰老细胞的能力。表达CAR结构的免疫细胞可以在接受抗原刺激的情况下大量分泌外泌体，同时分泌的外泌体中包含有对衰老细胞进行杀伤的颗粒酶B、穿孔素和IFN-r等细胞因子。且本发明中CAR-T外泌体表面无PD-1表达，不受衰老细胞表面PD-L1抑制。外泌体相对于CAR-T细胞无CRS风险，无需担心高剂量注射引发剂量相关毒性。

本发明免疫性细胞产生的外泌体，相对于CAR-T细胞可通过血脑屏障及血睾屏障，更有利于清除CAR-T细胞不易清除的衰老细胞。相对于抗体药来说，外泌体表面表达MHC I标记，不会被体内免疫细胞识别并清除，不仅不会引发体内免疫细胞对外泌体的免疫反应，更有效延长了外泌体存在的半衰期。

本发明免疫性细胞产生的外泌体中包含纤连蛋白(Fibronectin，FN)，可在清除衰老细胞的同时释放外泌体中纤连蛋白，填补被清除衰老细胞空位并同时激活附近细胞增殖、发育，达到衰老部位更新的治疗效果。配合MSC和IPSC等无限增殖干细胞可大大提升外泌体产量，降低生产成本。

下面以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的免疫细胞进行详细说明

本发明的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞、NKT细胞、TIL、gamma-delta T细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)。

嵌合抗原受体CARs的设计经历了以下过程：

第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。

第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1-BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在第二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为第三代CARs和第四代CARs，并且还有在同一个细胞上表达靶向2个靶点或者多个靶点的的双CAR或者多CAR等。

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域，胞外结构域包括抗原结合结构域，细胞内结构域包括共刺激信号传导区、CD3ζ链部分及纤连蛋白的基因；共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分，共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。

在一个较佳的实施方案中，本发明提供的CAR细胞的胞外结构域包括靶向uPAR的抗原结合结构域。本发明的CAR在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性或者蛋白受体结合进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，CAR-T细胞会产生大量外泌体，外泌体中包含颗粒酶B、穿孔素、纤连蛋白等物质。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链，分割蛋白P2A、T2A、F2A、E2A及纤连蛋白中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域分别与CD28、4-1-BB、ICOS信号传导结构域及CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

本发明的CAR中的胞内结构域包括所述细胞内结构域包括共刺激信号传导区、CD3ζ链部分及纤连蛋白的基因；共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分，共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。。

表达框的载体选自：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统中的一种或两种以上。优选地，载体为病毒载体。

载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入表达框的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体，其特点是长期、稳定的整合目的基因至细胞中；可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞；低免疫原性；安全性高。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列，另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体转染法。核酸可与脂质相关联，与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

CAR-T免疫细胞外泌体的生产方式使用抗原刺激CAR-T细胞，其中抗原包括抗原蛋白、构建过表达抗原细胞系或天然表达抗原细胞系等。CAR-T免疫细胞外泌体的收集纯化方式包括超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、PS亲和法、色谱法。优选地，所述收集方法使用超速离心法，配合免疫磁珠法进行纯化。

本发明提供了含有如上所述的外泌体以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方案中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述外泌体的浓度为0.5mg～500mg/ml，更优地，外泌体的浓度为5mg～100mg/ml。在一个实施方案中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

本发明包括用编码本发明核酸构建物的慢病毒载体转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞，且CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。且本发明的CAR-T细胞膜可以表达抗原嵌合受体，在抗原刺激情况下胞内域的细胞因子受体胞内区结构可持续产生刺激信号，这样可以提高CAR-T细胞的活力持久性，不易耗竭，长时间维持外泌体分泌活性。

在一个实施方案中，本发明的免疫细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，uPAR CAR-T细胞引起抗表达uPAR的细胞的特异性免疫应答。

可治疗的症状包括清除体内表达uPAR的衰老细胞。衰老细胞可能造成的症状包括但不限于皮肤老化、心脑血管老化、胃肠功能退化、肝功能衰减、肾功能减退、性功能退化等。

本发明的CAR免疫细胞外泌体，修饰T细胞的离体程序及外泌体收集，以下中的至少一项在将外泌体施用进入人体前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸和编码纤连蛋白的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞及外泌体。离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，人外周血中分离的细胞用于表达本文公开的CAR和纤连蛋白。修饰的T细胞产生的外泌体可被施用给接受者，以提供治疗益处。其次免疫细胞可相对于接受者为自体的，所以由免疫细胞产生的外泌体也可认为是自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

本发明免疫细胞CAR修饰T细胞产生的外泌体可被单独施用或与其他药物、药物组合物、稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

采用本发明免疫细胞制成的外泌体药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，并由临床方案确定。当指出“免疫学上有效量”、“抗衰有效量”、“衰老-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、衰老部位大小、感染或衰老程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的外泌体的药物组合物可以以0.5～500mg/kg体重的剂量，优选5～100mg/kg体重的剂量施用。外泌体组合物也可以以这些剂量多次施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员确定。

本发明的制剂的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、组织器官内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的外泌体组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的外泌体组合物优选通过i.v.注射施用。外泌体的组合物可被直接注入治疗部位位置。

本发明免疫细胞的主要优点包括：

1、外泌体膜表面可以表达CAR(嵌合抗原受体)，具有特异性识别衰老细胞的能力；

2、表达CAR结构的免疫细胞可以在接受抗原刺激的情况下大量分泌外泌体，同时分泌的外泌体中包含有对衰老细胞进行杀伤的颗粒酶B、穿孔素和IFN-r等细胞因子；

3、本发明中CAR-T外泌体表面无PD-1表达，不受衰老细胞表面PD-L1抑制；

4、外泌体相对于CAR-T细胞无CRS风险，无需担心高剂量注射引发剂量相关毒性；

5、本发明产生的外泌体相对于CAR-T细胞可通过血脑屏障及血睾屏障，更有利于清除CAR-T细胞不易清除的衰老细胞；

6、相对于抗体药来说，外泌体表面表达MHC I标记，不会被体内免疫细胞识别并清除，不仅不会引发体内免疫细胞对外泌体的免疫反应，更有效延长了外泌体存在的半衰期；

7、本发明产生的外泌体中包含纤连蛋白(Fibronectin，FN)，可在清除衰老细胞的同时释放外泌体中纤连蛋白，填补被清除衰老细胞空位并同时激活附近细胞增殖、发育，达到衰老部位更新的治疗效果；

8、配合MSC和IPSC等无限增殖干细胞可大大提升外泌体产量，降低生产成本。

以下为Car-T细胞具体实施例说明。在其他实施例中，也可以是Car-NK细胞、Car-NKT细胞、Car-TIK细胞、TCR-T细胞等，也就是说，免疫细胞可以为T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞、TCR-T细胞、MSC细胞或IPS细胞中的任一种。

实施例

本实施例的免疫细胞的制备方法及功能验证包括以下步骤：

S100：外周血PBMC的分离和T细胞的培养。

从供体外周血中分离单核细胞，使用ficol进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞(CD3 MicroBeads,human-lyophilized，130-097-043)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；培养基使用TexMACS GMP Medium(MiltenyiBiotec，170-076-309)，含10％FBS，2mM L-glutamine，100IU/ml rhIL2，所有细胞均置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养，获得T细胞。

S200：细胞系培养。

不表达uPAR的细胞系：293T(人胚肾细胞系)，购自ATCC。

表达uPAR的细胞系：靶细胞293T-uPAR，自产慢病毒侵染构建。

包装用细胞：293T(人胚肾细胞系)，购自ATCC。

过表达uPAR的细胞系的建立：将表达uPAR的碱基序列克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下,形成PHBLV-EF1α-uPAR，将PHBLV-EF1α-uPAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染293T，最终得到过表达uPAR的293T细胞系，命名为293T-uPAR。

图1为293T、293T-uPAR细胞表达uPAR的检测图其中，293T、293T-uPAR使用DMEM培养基培养，且所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。在构建过程中uPAR抗原表面构建有Biotin标记位点，可用streptavidin-APC流式抗体检测其表达情况。如图1所示，293T-uPAR对应右侧曲线，表示构建293T-uPAR细胞表面的uPAR细胞相对于对照样293T对应的左侧曲线为阳性；表明在293T细胞表面成功表达uPAR抗原，也就293T-uPAR构建成为靶细胞。

S300：CAR结构设计与慢病毒包装。

uPAR-CAR结构，即靶向uPAR的CAR结构：

本发明方法将免疫细胞膜上表达第二代CAR构建在一个表达框上。CAR的核心结构包括分泌信号肽序列；CD8跨膜区；胞内段刺激信号4-1-BB-CD3ζ，CAR结构后添加P2A并合成纤连蛋白FN，命名为uPAR-FN CAR，以只有CAR的表达框作为对照，命名为uPAR CAR，如图2所示。

在图2中，1#和2#图列中，CD8SP/uPAR scFv/CD8Hinge/CD8TM/4-1-BB/CD3ζ(其中，ζ是Zeta的阿拉伯字符表示形式，下同)表示免疫细胞的细胞膜上表达的嵌合抗原受体，即uPAR-CAR；而CD8SP/uPARscFv/CD8Hinge/CD8TM/4-1-BB/CD3ζ/P2A/FN/Streptavdin Tag表示免疫细胞的细胞膜上表达抗原嵌合受体并同时在免疫细胞内合成纤连蛋白FN，即uPAR-FN-CAR。

在其他实施例中，纤连蛋白与嵌合抗原受体结构之间，也可以通过T2A、F2A或E2A分割；跨膜结构域也可以是CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域CD8铰链区和ICOS的跨膜结构域组。如，此时免疫细胞结构为：

CD28SP/uPAR scFv/CD28Hinge/CD28TM/CD28/CD3ζ/T2A/FN/Streptavdin Tag；

CD8SP/uPAR scFv/CD8Hinge/CD8TM/4-1-BB/CD3ζ/F2A/FN/Streptavdin Tag；或

CD8SP/uPAR scFv/CD8Hinge/CD8TM/ICOS/CD3ζ/E2A/FN/Streptavdin Tag。

将表达框克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-uPAR-CAR和PHBLV-EF1α-uPAR-FN-CAR，将PHBLV-EF1αuPAR-CAR或者PHBLV-EF1α-uPAR-FN-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在细胞培养到48h和72h后，转入离心管中离心处理，离心停止后收集病毒上清液，对上清液进行超速离心浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。

S400：CAR-T细胞制备。

4.1慢病毒感染

将步骤S100分离纯化的原代T细胞再激活1天后，利用步骤S300包装的两种慢病毒(uPAR-CAR，uPAR-FN-CAR)，按MOI(1-10)进行慢病毒载体感染，并将感染病毒的T细胞转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

在其他实施例中，递送系统，即细胞质粒表达框的构建，可以选用逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子、其他基因转移系统中的一种或两种以上。

4.2细胞增殖及CAR阳性率检测

T细胞感染后第6、9、11、13天，每天取样检测细胞数量，第6天分别检测T细胞的CAR阳性率，每隔1-2天传代补加培养基。

利用步骤S300的两种慢病毒载体，成功构建了2种CAR-T细胞，分别命名为uPAR-CAR-T和uPAR-FN-CAR-T，以不感染慢病毒的T细胞为对照(NT)。

如图3所示，三种细胞，即NT、uPAR-CAR-T和uPAR-FN-CAR-T细胞的增殖速率。由图3可知，在相同培养条件的情况下三种细胞(NT、uPAR CAR-T和uPAR-FN-CAR-T细胞)的增殖速率无明显差异。

如图4a、4b、4c分别表示NT、uPAR-CAR-T和uPAR-FN-CAR-T细胞在第6天测试阳性的表达情况，可见在CAR结构胞内域部分加入合成纤连蛋白基因(FN)对CAR阳性率无显著影响。

S500：CAR-T外泌体的生产。

对步骤S400获得的三种CAR-T细胞(即NT、uPAR CAR T和uPAR-FN CAR T细胞)进行体外靶细胞刺激，对共培养上清进行收集低速离心去除细胞及细胞碎片后，超速离心收集外泌体，并通过包被uPAR蛋白磁珠进行分选纯化，最终收获表面表达uPAR-CAR结构的(uPAR-CAR-EXO/uPAR-FN-CAR-EXO)外泌体；其中，EXO表示外泌体，CAR表示免疫细胞。

ELISA方法检测CAR-T细胞分泌情况，如图5a所示，经靶细胞刺激的CAR-T(如，uPAR-Car-T+293T-uPAR，uPAR-FN-Car-T+293T-uPAR)外泌体中CAR表达含量高达40％以上；如图5b所示，经靶细胞刺激的CAR-T(如，uPAR-Car-T，uPAR-FN-CarT)相较无靶细胞刺激的CAR-T外泌体分泌量大幅上升，两者相差达到0.16。该结果说明，CD3CD28磁珠的激活并不会明显提升外泌体的产量，而免疫细胞外泌体是细胞因子分泌及信号传导的介质，所以在靶细胞刺激的情况下会导致细胞因子及传导信号的大量增加，从而增加外泌体的分泌量。

在其他实施例中，外泌体的的纯化方式可以是超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、PS亲和法、色谱法中的一种或多种；都是常用的制备方法，再次不再赘述。

S600：外泌体中表面标志物、细胞因子及纤连蛋白检测。

将步骤S500获得的CAR-T细胞外泌体稀释至相同浓度，检测外泌体中CAR结构表达、PD-1表达、MHC I表达、IFN-γ、Perforin、Granzyme B及纤连蛋白(FN)的含量。

图6a、6b、6c为实施例三种CAR-T细胞的外泌体中颗粒酶B(Granzyme B)、穿孔素(Perforin)、纤连蛋白FN(Fibronectin)表达量的流式抗体染色结果图组。

如图6a所示，左图中显示左侧峰为NT细胞对照，右侧两峰为uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞，结果显示uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞表面具有CAR结构表达；而右图中显示左峰为空白Beads对照，右侧重合两峰为uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体，结果显示uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体表面具有CAR结构表达。

如图6b所示，左图中显示左侧重合两峰为uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞未染色对照，右侧两峰为uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞anti-hPD-1流式抗体染色结果，结果显示uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞表面具有PD-1表达；而右图中显示左峰为4个重合峰型，分别为uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体未染色对照和uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体anti-hPD-1流式抗体染色结果，结果显示uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体表面无PD-1表达。

如图6c所示，左侧重合两峰为uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞未染色对照，右侧两峰为uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞anti-hMHC I流式抗体染色结果，结果显示uPAR-CAR-T细胞及uPAR-FN-CAR-T细胞表面具有MHC I表达；而右图中左侧重合两峰为uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体未染色对照，右侧两峰为uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体anti-hMHC I流式抗体染色结果，结果显示uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO外泌体表面具有MHC I表达。

图7a、7b、7c、7d为实施例中uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO两种细胞外泌体，分别表示CAR-T外泌体中的IFN-γ含量、穿孔素(Perforin)含量、颗粒酶B(Granzyme B)含量、纤连蛋白FN(Fibronectin)含量的柱状图。

如图7a所示，uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO两种外泌体细胞中含有IFN-γ。

如图7b所示，uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO两种外泌体细胞中含有Perforin。

如图7c所示，uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO两种外泌体细胞中含有GranzymeB。

如图7d所示，uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO两种外泌体细胞中，只在uPAR-FN-CAR-EXO外泌体中含有纤连蛋白FN。

这一结果说明，免疫细胞外泌体是细胞因子分泌及信号传导的介质的论点，CAR外泌体的膜结构中包含有IFN-γ、穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)等物质，且CAR细胞中合成的纤连蛋白FN(Fibronectin)作为一种具有信号传导功能的蛋白也被包裹于CAR外泌体的膜结构中。

S700：外泌体体外杀伤实验。

将不同剂量的的CAR-T细胞外泌体和靶细胞共培养6h，使用RTCA杀伤设备检测其对阳性靶细胞293T-uPAR杀伤效率。

如图8所示，uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO，对阳性靶细胞293T-uPAR均具有很高的杀伤效率。而对阴性靶细胞293T无任何影响。

S800：uPAR-FN-CAR-EXO对成纤维细胞Fb的促进增殖作用。

将1mg/ml的uPAR-CAR-EXO及uPAR-FN-CAR-EXO与混合细胞(50％Fb+50％293T-uPAR)共培养，最终检测成纤维细胞Fb的增殖情况。如图9所示，共培养过后，uPAR-CAR-EXO组中Fb无明显增殖，uPAR-FN-CAR-EXO组中Fb具有明显增殖效果，证明纤连蛋白FN对成纤维细胞Fb的增殖具有促进作用。

所以，本发明提供的免疫细胞外泌体，可特异性识别表达uPAR的衰老细胞，并依靠外泌体中包含的IFN-γ、Perforin、Granzyme B将其清除，此外外泌体中包含的纤连蛋白FN可填补所清除的衰老细胞空位并激活周围组织细胞增殖，完成衰老部位更新，达到抗衰效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。