具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

针对FXYD2γa的核酸适配体是本文的开发对象，最终也是本文的保护对象，本文的范围涉及所得到的与FXYD2γa特异性结合的核酸适配体、以该核酸适配体为成分的物质(如：探针、检测试剂、试剂盒、传感器等)、应用(如诊断应用、制备应用等)，然而，本领域技术人员应该理解，本文的保护对象并不限于举例的这些内容。

本发明提供一个与人FXYD2γa特异性结合可用于检测胰岛β细胞的核酸适配体，该核酸适配体的核苷酸序列为：5’-AACGAAGGTATACAAAAATATAATATAAATATCTACTACG-3’(SEQID NO.1)。

可选地，上述核酸适配体的核苷酸序列上的任一位置碱基可以被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述核酸适配体的核苷酸序列上可以结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。可以理解的是，该核酸适配体的碱基被修饰之后不影响其空间结构。

在其它实施例中，上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架还可以衍生出可用于检测FXYD2γa的硫代磷酸酯骨架，上述核酸适配体还可以改造成的相应肽核酸。

上述与人FXYD2γa特异性结合的核酸适配体可以进行大量的合成，从而加以应用。核酸适配体可以用来制备检测FXYD2γa、胰岛β细胞的检测试剂、试剂盒或传感器，还可以用来制备辅助诊断糖尿病患者、预测糖尿病发病率以及预测胰岛移植效果的试剂盒或传感器。

优选地，所述核酸适配体的5’端或3’端标记荧光基团、生物素基团或放射性核素作为探针，所述探针可以以试剂的形式存在，也可以固定或偶联在载体上。所述固定或偶联核酸适配体或其衍生物的载体可以为纳米颗粒或微米颗粒或芯片。所述纳米颗粒为修饰物修饰的纳米/微米颗粒；所述修饰物为链霉亲和素、竣基、氨基或蔬基。

本实施例的上述可用于检测胰岛β细胞的核酸适配体主要采用以下筛选方法筛选得到，具体包括以下步骤：

(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物

随机单链DNA文库：5’-AGAGTCCTGAGTGCCGATGA-N(40)-TAGGCAGGTGGTCATCGTCA-3’(SEQ ID NO.4)；

引物F：5’-Biotin-AGAGTCCTGAGTGCCGATGA-3’(SEQ ID NO.2)；

引物R：5’-FITC-TGACGATGACCACCTGCCTA-3’(SEQ ID NO.3)。

同时通过公司合成生物素标记的FXYD2γa胞外段肽段(Bio-MTGLSMDGGGSPKGDVDPFYYDYETV)(SEQ ID NO.5)，FXYD2γb胞外段肽段(Bio-MDRWYLGGSPKGDVDPFYYDYETV)(SEQ ID NO.6)，FXYD2γc胞外段肽段(Bio-MTGLSMDGGGSPKGDVDPFYYGKPGP)(SEQ ID NO.7)，用于后续实验。

(2)筛选随机单链DNA文库

将随机单链DNA文库预处理之后与FXYD2γa孵育，洗去未与FXYD2γa结合的单链DNA，分离与FXYD2γa结合的单链DNA。

具体的，将单链DNA 10000rpm离心5min，加入1ml 1×Binding Buffer，混合均匀，95℃金属浴加热5min后，立即取出冰浴5min，再室温下维持5min，进行预处理。每轮筛选开始前文库都进行预处理。

具体的，在ep管中加入1ml随机单链DNA文库(5nmol)，再加入磁珠包被好的FXYD2γa，加入Binding Buffer，±FBS至总体积1.2ml室温避光孵育30-90min。

孵育完成后，将ep管置于磁性分离器上，静置1min，用移液器吸去上清液，去除未与FXYD2γa结合的单链DNA，用1ml Washing Buffer洗涤2-3遍后，从磁性分离器上取下ep管。

上述ep管中只剩与FXYD2γa结合的单链DNA，往结合FXYD2γa的磁珠里加入灭菌水1.3ml，100℃加热5min，置于冰上5min，磁性分离留上清，分离得到与FXYD2γa结合的单链DNA。

(3)PCR扩增

使用步骤(1)合成的引物F和引物R对步骤(2)中分离得到的与FXYD2γa结合的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物。

由于该PCR扩增反应的模板单一，丰度也很高，所以扩增轮数对PCR影响较大，扩增更多轮数反而会出现非特异性扩增，因此在每轮筛选出来的单链DNA富集扩增之前都要通过PCR扩增轮数优化方法找到最佳的循环数。

PCR扩增轮数优化的反应体系如表1所示，单链DNA PCR扩增富集的反应体系如表2所示，反应条件都为表3所示，其中反应条件中第2步的循环数通过PCR扩增轮数优化实验来确定。

表1.PCR扩增轮数优化反应体系

表2.单链DNA扩增富集反应体系

表3.PCR反应条件

如图1所示展示了其中一轮筛选的PCR扩增轮数优化实验结果，图1为本发明核酸适配体第12轮筛选后PCR扩增轮数优化实验结果图，其中，M为Marker，7-14、16分别为扩增7-14、16轮的产物，水为以水为模板扩增的空白对照。从图中可看出，第12轮筛选后的单链DNA的富集以PCR扩增14轮最佳。

(4)制备单链DNA

将步骤(3)得到的双链DNA产物解链制备得到新的单链DNA文库。

先将链霉素标记的琼脂糖微珠涡旋混匀，取100ul，5000rpm离心去保护液，加入DPBS 200ul清洗3遍后，加入到2ml上述双链DNA产物中，在25℃下振荡孵育30min(避光)，离心去上清，用灭菌水清洗3遍，直至上清清亮，去上清，得到琼脂糖微珠双链DNA复合物。往琼脂糖微珠双链DNA复合物里加入1100μl的200mM NaOH，在25℃避光振荡孵育12min进行单链化处理，之后离心收集上清，带有亲和素的单链DNA与琼脂糖微珠结合沉淀，上清为没有亲和素标记的单链DNA，得到单链DNA溶液。使用脱盐柱对得到的单链DNA溶液脱盐，脱盐柱用4ml双蒸水洗4遍，加入1ml上述收集的上清弃掉，再加入1.5ml灭菌水收集约1.5ml单链DNA。

优选地，筛选后得到的单链DNA文库还可以进行富集度检测。选取等量各轮筛选产物(带FITC荧光)与磁珠包被的FXY2Dγa孵育60min后流式检测各轮筛选产物与FXY2Dγa的识别结合情况，结果如图2所示，图2展示了一部分检测结果，可以看出从第11轮开始，筛选文库与FXY2Dγa孵育后的荧光强度随着筛选轮数的增加而增强。

(5)重复筛选

将步骤(4)得到的单链DNA替代步骤(2)中的随机单链DNA文库，并重复步骤(2)～步骤(4)的过程至少一次。

具体的，本实施例一共经过16轮筛选，各轮筛选条件如表4所示，其中多肽B和C分别是FXYD2γa的另外两个剪切异构体FXYD2γb和FXYD2γc，其中加空磁珠是为了通过反筛去掉与磁珠结合的核酸序列，加FXYD2γb和FXYD2γc是为了通过反筛去掉与和FXYD2γb和FXYD2γc结合的核酸序列。FBS是血清蛋白，在体内以及血清中高丰度存在。我们逐渐提高血清浓度以模拟以后的检测环境，并提高筛选到与FXYD2γa特异性结合核酸适配体的几率。一开始的筛选条件较温和，是为了富集靶标核酸适配体，防止一开始就把靶标核酸适配体洗掉了，后面筛选条件更剧烈，是为了提高特异性。

表4.各轮筛选条件汇总

(6)测序

重复筛选多次后将最后一次筛选得到的步骤(3)中的双链DNA产物进行测序。

具体的，测序前还可以包括验证单链DNA的大小步骤，在测序前选取第16轮筛选产物以及前几轮筛选产物进行凝胶电泳以及非变性PAGE电泳实验，实验结果分别如图3A和图3B所示，图中从左至右依次为marker，9，13，14，15，16轮筛选产物，从图中可看出测序样品的大小正确。

测序结果得到582235条结果，选取重复数排名前100的一部分结果合成相应的单链DNA，用于后续结合验证的筛选。

验证：

为了验证上述测序得到的单链DNA是否为FXYD2γa核酸适配体，还要将得到的单链DNA与FXYD2γa进行结合试验，能与FXYD2γa特异性结合的才是最终得到的FXYD2γa核酸适配体。

SYBR Green染料能特异性地结合双链DNA，而不能结合单链DNA。上述核酸适配体是单链DNA，与SYBR Green不能结合，但是如果核酸适配体与FXYD2γa肽段有结合，会导致构象变化，形成局部双链结构，进而导致SYBR Green插入到形成的双链DNA，产生放大的荧光信号，从而可以进一步验证上述得到的核酸适配体是否能与FXYD2γa特异性结合。

SYBR Green溶液：原液浓度为10000×，工作浓度3×。FXYD2γa溶液：原液浓度1000μM，工作浓度600nM。对照为公司合成的随机40个碱基序列。取600nM上述合成的核酸适配体分别与FXYD2γa、FXYD2γb、FXYD2γc溶液和SYBR Green溶液混合，还有对照随机40个碱基序列与FXYD2γa溶液和SYBR Green溶液混合，4℃冰箱孵育过夜，多功能酶标仪检测孔板荧光强度。

最后得到一条能够与FXYD2γa特异性结合的核酸适配体序列，其实验结果如图4所示，图中Control为对照随机40个碱基序列与FXYD2γa结合组，FXYD2γa为核酸适配体与FXYD2γa结合组，FXYD2γb为核酸适配体与FXYD2γb结合组，FXYD2γc为核酸适配体与FXYD2γc结合组。从图4中可看出该核酸适配体可以与FXYD2γa特异性结合。

图4所示的核酸适配体序列为G-27：5’-AACGAAGGTATACAAAAATATAATATAAATATCTACTACG-3’(SEQ ID NO.1)，该序列多次出现，重复数34次。

以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市人民医院

<120> 与人FXYD2γa特异性结合的核酸适配体及其衍生物、筛选方法及应用

<130> 2020-07-28

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacgaaggta tacaaaaata taatataaat atctactacg 40

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtcctga gtgccgatga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgacgatgac cacctgccta 20

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(60)

<223> n is a,g,c or t

<400> 4

agagtcctga gtgccgatga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

taggcaggtg gtcatcgtca 80

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Thr Gly Leu Ser Met Asp Gly Gly Gly Ser Pro Lys Gly Asp Val

1 5 10 15

Asp Pro Phe Tyr Tyr Asp Tyr Glu Thr Val

20 25

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Asp Arg Trp Tyr Leu Gly Gly Ser Pro Lys Gly Asp Val Asp Pro

1 5 10 15

Phe Tyr Tyr Asp Tyr Glu Thr Val

20

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Thr Gly Leu Ser Met Asp Gly Gly Gly Ser Pro Lys Gly Asp Val

1 5 10 15

Asp Pro Phe Tyr Tyr Gly Lys Pro Gly Pro

20 25