一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法
阅读说明：本技术 一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法 (Method for improving natamycin fermentation yield by using natamycin fermentation by-products ) 是由 宗工理 曹广祥 付加芳 张佩佩 陈曦 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法。将发酵结束后的纳他霉素发酵液通过离心收集上清液,得到纳他霉素发酵副产物；然后在纳他霉素发酵0～48h后,按照发酵培养基体积的2.5～7.5％,将纳他霉素发酵副产物添加至发酵培养基中,继续发酵,得纳他霉素。经本发明的方法得到的纳他霉素摇瓶发酵产量最高为2.40±0.17g/L。采取扩大生产后,在1L发酵体系中,发酵24h后添加5％的纳他霉素发酵副产物,其纳他霉素产量为8.83～8.86g/L,显著高于未添加纳他霉素发酵副产物的6.70～6.72g/L。(The invention relates to a method for improving natamycin fermentation yield by using natamycin fermentation by-products. Centrifuging the natamycin fermentation liquor after fermentation is finished, and collecting supernatant to obtain a natamycin fermentation by-product; and then after the natamycin is fermented for 0-48 h, adding the natamycin fermentation by-product into the fermentation medium according to 2.5-7.5% of the volume of the fermentation medium, and continuing to ferment to obtain the natamycin. The natamycin shake flask fermentation yield obtained by the method of the invention is 2.40 +/-0.17 g/L at most. After the expanded production is adopted, 5% of natamycin fermentation byproducts are added after fermentation is carried out for 24 hours in a 1L fermentation system, the natamycin yield is 8.83-8.86 g/L and is obviously higher than 6.70-6.72 g/L of natamycin fermentation byproducts which are not added.)
技术领域
本发明涉及一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，属于纳他霉素制备
技术领域
。背景技术
纳他霉素(Natamycin)(又称匹马霉素，Pimaricin)是一种天然、广谱、高效的多烯大环内酯类抗真菌剂，其分子式为C33H47NOl3，分子量为665.75，熔点为280℃。纳他霉素的分子结构中含有一个由26个碳原子组成的内酯环骨架结构，其中4个共扼双键形成了多烯发色团，在内酯环外还连接了一个海藻氨基糖。纳他霉素成品为白色或奶油色、无嗅、无味的结晶粉末，有三分子水以结晶水的形式结合于纳他霉素分子之上。纳他霉素分子中含有一个碱性基团与一个酸性基团，等电点为6.5。由于其性质稳定、低剂量、高效率、安全性的特点，不仅在食品原料保鲜、成品防腐方面具有较好的抗菌效果，而且在医药、青储饲料、粮储、家禽养殖等方面被广泛应用。
中国专利文献CN104946709A公开了一种发酵生产纳他霉素的方法，包括在发酵过程中同时流加还原糖和丙酸盐的步骤。由该发明方法合成纳他霉素的最高发酵单位可达8.13g/L。但是现有技术中纳他霉素的产量仍可进一步提升。
纳他霉素生物合成基因簇中存在一个胆固醇氧化酶基因(sgnE/pimE/scnE/slnE)，其编码的胆固醇氧化酶并不参与纳他霉素的母核、侧链的合成及缩合反应。但近年来国内外研究证实，胆固醇氧化酶在纳他霉素的生物合成中必不可少。胆固醇氧化酶可能作为信号蛋白参与纳他霉素的合成与积累【Mendes MV,Recio E,Anton N,Guerra SM,Santos-Aberturas J,Martin JF,Aparicio JF.Cholesterol oxidases act assignaling proteins for the biosynthesis of the polyene macrolidepimaricin.Chemistry and Biology,2007,14:279-290】。进一步的相关研究说明，发酵初期添加成品的胆固醇氧化酶能够提高纳他霉素的产量【Wang M,Wang SH,Zong GL,Hou ZW,Liu F,Liao DJ,Zhu XQ.Improvement of natamycin production by cholesteroloxidase overexpression in Streptomyces gilvosporeus,Journal of Microbiologyand Biotechnology,2016,26(2):241-247】。
在纳他霉素发酵过程中，胆固醇氧化酶能分泌到发酵培养基中，因此，在纳他霉素发酵副产物中存在大量能够提高纳他霉素产量的胆固醇氧化酶。然而，目前在纳他霉素生产、提取及纯化工艺中，胆固醇氧化酶随着其他发酵副产物被一同作为废液处理掉，造成了这种宝贵的副产物被浪费的现象。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法。本发明人首次发现纳他霉素发酵副产物可以促进提高纳他霉素的发酵产量，并且在提高纳他霉素的发酵产量的同时，合理化利用了纳他霉素发酵副产物，变废为宝。
本发明的技术方案如下：
一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，步骤如下：
将发酵结束后的纳他霉素发酵液通过离心收集上清液，得到纳他霉素发酵副产物；然后在纳他霉素发酵0～48h后，按照发酵培养基体积的2.5～7.5％，将纳他霉素发酵副产物添加至发酵培养基中继续发酵，得纳他霉素。
本发明中发酵结束后的纳他霉素发酵液为正常发酵108～120h后的发酵液，由于纳他霉素微溶，经离心后，得到的沉淀主要为纳他霉素产物，回收后并入待提取的发酵液中进行纳他霉素的提取，上清液为纳他霉素发酵副产物，在纳他霉素发酵过程中添加至发酵培养基，用于纳他霉素产量的提升。
根据本发明优选的，所述离心收集的条件为转速9000～11000rpm，时间12～18min。
根据本发明优选的，所述的纳他霉素发酵副产物中胆固醇氧化酶的酶活大于等于1U/mL；进一步优选为1.3～1.5U/mL。
根据本发明优选的，所述纳他霉素发酵生产所用菌株为褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
根据本发明优选的，在纳他霉素发酵生产12～36h后添加纳他霉素发酵副产物；进一步优选为24h后。
根据本发明优选的，所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h；进一步优选为120h。
根据本发明优选的，所述纳他霉素发酵副产物的添加量为发酵培养基体积的5％。
一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)将发酵结束后的纳他霉素发酵液通过离心收集上清液，得到纳他霉素发酵副产物；
(2)无菌条件下，取纳他霉素生产菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中进行摇床培养，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液按5～10％的接种量接入发酵培养基中发酵培养，在发酵0～48h后，将步骤(1)收集的纳他霉素发酵副产物按照发酵培养基体积的2.5～7.5％添加至发酵培养基中，继续发酵，发酵总时间为100～150h，得纳他霉素。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述琼脂斜面培养基的配方为：葡萄糖5.0～15.0g/L，麦芽浸粉1.0～5.0g/L，酵母浸膏1.0～5.0g/L，蛋白胨3.0～10.0g/L，琼脂粉10.0～20.0g/L，pH7.0～7.2；
所述种子培养基的配方为：葡萄糖10.0～30.0g/L，酵母浸膏3.0～10.0g/L，黄豆饼粉30.0～50.0g/L，pH 7.0～7.2。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述摇床培养的条件为转速150～200rpm，温度26～30℃，培养时间36～48h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨20g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖60g/L，pH 7.5。
本发明中未详细说明的实验步骤，尤其是纳他霉素发酵过程，均按照本领域现有技术记载的方法进行。
本发明包含以下有益效果：
1、由于纳他霉素在水中的溶解度极低(50～100mg/L)，因此通过充分离心能够达到将发酵结束后的纳他霉素发酵液、纳他霉素及菌体分离的效果，得到含有胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物。再向发酵培养基中添加该纳他霉素发酵副产物，可以有效利用胆固醇氧化酶能够提高纳他霉素的产量的特点，显著提高纳他霉素生产菌株纳他霉素产量。经本发明的方法得到的纳他霉素摇瓶发酵产量最高为2.40±0.17g/L。采取扩大生产后，在1L发酵体系中，发酵24h后添加5％的纳他霉素发酵副产物，其纳他霉素产量为8.83～8.86g/L，显著高于未添加纳他霉素发酵副产物的6.70～6.72g/L，纳他霉素产量提高了31.84％。并且与直接向发酵培养基中添加市售胆固醇氧化酶的纳他霉素产量7.15～7.69g/L相比，本发明的方法纳他霉素产量提高了23.49％。
2、本发明向发酵培养基中添加含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物，一方面可以为纳他霉素生产制备提供胆固醇氧化酶，从而提高纳他霉素产量；另一方面，纳他霉素发酵培养基采用葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和无机盐等商品化成分，并且在较长的发酵过程中不断补加的碳源，在生产结束后往往剩余一部分未被消耗，本发明避免了这部分营养被作为废液丢弃，克服了浪费问题，可以将部分未消耗的原料再次利用，产生了极大的经济效益。
具体实施方式
以下实施例和试验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中所涉及材料均为普通市售产品。
琼脂斜面培养基的配制：葡萄糖10g/L，麦芽浸粉3g/L，酵母浸膏3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.0，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
摇瓶种子培养基的配制：葡萄糖20g/L，酵母浸膏5g/L，黄豆饼粉40g/L，pH 7.2，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
发酵罐纳他霉素液体种子培养基的配制：葡萄糖10g/L，酵母提取物3g/L，大豆蛋白胨5g/L，麦芽浸粉3g/L；消泡剂，1.40g/L；pH7.0～7.2，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
发酵培养基的配制：大豆蛋白胨20g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖60g/L，pH7.5；121℃×20min灭菌，冷却后备用。
pH的测定：利用梅特勒pH计进行直接测定。
实施例1：纳他霉素发酵副产物的制备
取纳他链霉菌于琼脂斜面培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取一环纳他链霉菌孢子，接种至摇瓶种子培养基中；30℃下，以200rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；将种子液按照5％接种量转接至发酵培养基中，200rpm，28℃发酵120h，发酵结束，得纳他霉素发酵液。
将上述得到的纳他霉素发酵液10000rpm离心15min，收集上清液，得纳他霉素发酵副产物。测定纳他霉素发酵副产物的胆固醇氧化酶酶活，达到1U/mL以上为合格的发酵上清液。
其中，胆固醇氧化酶酶活的具体测定方法为：
配制溶液A：4-氨基安替比林，1mmol/L；苯酚，6mmol/L；过氧化物酶，7000U/L；磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，25mmol/L；
配制溶液B：胆固醇，8.26g/L；Triton X-100，4.26％；异丙醇为溶剂；
取3mL溶液A于试管中，37℃保温3min，加入不同量过氧化氢溶液使得终浓度在0.02～0.10mmol/L，反应5min，在500nm处测定吸光度，建立标准曲线。取3mL溶液A，150μL溶液B于5mL EP管中，于37℃保温3min，加入50μL发酵液上清，准确反应5min，沸水浴中煮3min，冰浴冷却，500nm处测吸光度。
酶活计算公式：
酶活(U/mL)＝C×(V1/V2)×N÷T，
其中C，根据标准曲线计算出过氧化氢的浓度；V1，反应液总体积；V2，酶液体积；N，稀释倍数；T，反应时间。
计算结果显示，上述纳他霉素发酵副产物的胆固醇氧化酶酶活为1.5±0.07U/mL。
实施例2
一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
1)无菌条件下，取纳他链霉菌于琼脂斜面培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取一环纳他链霉菌孢子，接种至摇瓶种子培养基中；30℃下，以200rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
2)将种子液按照5％接种量转接至发酵培养基中，发酵培养基盛装于500mL三角摇瓶中，每个500mL三角摇瓶装发酵培养基的体积为50mL，每个实验组6瓶，在接种种子液的同时添加实施例1的纳他霉素发酵副产物，200rpm，28℃发酵120h，发酵结束，得纳他霉素发酵液；其中纳他霉素发酵副产物的添加量分别为发酵培养基体积的0％(对照组)、2.5％(实验组1)、5％(实验组2)、7.5％(实验组3)和10％(实验组4)。
测定以上5组的纳他霉素含量，结果如表1所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表1不同纳他霉素发酵副产物添加量对纳他霉素产量的影响
组别
副产物添加量(体积比)
副产物中胆固醇氧化酶酶活(U/mL)
纳他霉素产量(g/L)
对照组
0
1.5±0.07
1.13±0.06
实验组1
2.5
1.5±0.07
1.32±0.14
实验组2
5
1.5±0.07
1.90±0.15
实验组3
7.5
1.5±0.07
1.748±0.17
实验组4
10
1.5±0.07
0.962±0.13
从表1的结果可以看出，向摇瓶发酵培养基中加入含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物能够有效地提高纳他霉素的产量。实验组1～3与对照组相比，纳他霉素产量提高了16.81～68.14％。实验组1与对照组相比，纳他霉素产量提高了16.81％。实验组2与对照组相比，纳他霉素产量提高了68.14％。实验组3对照组相比，纳他霉素产量提高了54.69％。实验组4对照组相比，纳他霉素产量稍微降低。根据以上的数据结果，在本发明此后的实施例中纳他霉素发酵副产物的添加量优选为5％。
实施例3
一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
1)无菌条件下，取纳他链霉菌于琼脂斜面培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取一环纳他链霉菌孢子，接种至摇瓶种子培养基中；30℃下，以200rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
2)将种子液按照5％接种量转接至发酵培养基中，发酵培养基盛装于500mL三角摇瓶中，每个500mL三角摇瓶装发酵培养基的体积为50mL，每个实验组6瓶，200rpm，28℃发酵培养，在发酵培养的过程中添加实施例1的纳他霉素发酵副产物，添加量为发酵培养基体积的5％，继续发酵，发酵总时间为120h，发酵结束，得纳他霉素发酵液；其中纳他霉素发酵副产物的添加时间分别为发酵培养0h后(对照组)、12h后(实验组1)、24h后(实验组2)、36h后(实验组3)、48h后(实验组4)和60h后(实验组5)。
测定以上6组的纳他霉素含量，结果如表2所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表2不同纳他霉素发酵副产物添加时间对纳他霉素产量的影响
从表2的结果可以直观地看出，实验组1～5与对照组相比，纳他霉素产量均有显著的提高，提高幅度达到了27.5～120.2％。但是，在菌株发酵的不同时间添加含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物对纳他霉素产量有影响，实验组2相较于对照组纳他霉素产量提高了94.9％，相较于实验组1提高了14.2％，实验组3相较于对照组纳他霉素产量提高了120.2％，相较于实验组1提高了29.1％，实验组4和实验组5相较于实验组1则出现纳他霉素的产量降低，但是相较于对照组纳他霉素产量依然提高了27.5％以上。根据以上的数据结果，在本发明此后的实施例中纳他霉素发酵副产物的添加时间优选为24h。
实施例4
一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
1)无菌条件下，取纳他链霉菌于琼脂斜面培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取一环纳他链霉菌孢子，接种至发酵罐液体种子培养基中，在29℃，300rpm的条件下，搅拌培养48h，得种子液；
2)将种子液按10％的接种量接入发酵培养基的中，发酵培养基未接种前体积为0.8L，装入1L全自动发酵罐中，在29℃的条件下进行发酵，发酵过程中溶氧DO值控制在30～40％之间，培养初期pH从初始pH值自然降落至6.00±0.10时开始流加20％浓度NaOH并将pH维持在6.00±0.20之间至发酵结束；发酵过程中流加40％质量百分比浓度的葡萄糖溶液，并始终将葡萄糖含量控制在15.00±5.00g/L，在发酵24h后，添加实施例1的纳他霉素发酵副产物，添加量为发酵培养基体积的5％，继续发酵96h后得纳他霉素；设置对照组，对照组不添加纳他霉素发酵副产物
测定以上2组的纳他霉素含量，结果如表3所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表3不同纳他霉素发酵副产物添加量在1L发酵体系中对纳他霉素产量的影响
从表3中可以看出，实验组由于在发酵24h后添加了5％体积的含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物，其纳他霉素产量为8.86g/L，显著高于未添加纳他霉素发酵副产物对照组的纳他霉素产量6.72g/L，产量提高达到了31.84％。1L发酵体系验证结果表明，添加5％体积的含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物可以显著提高纳他霉素的产量。
实施例5
一种利用纳他霉素发酵副产物提高纳他霉素发酵产量的方法，包括步骤如下：
1)无菌条件下，取链霉菌于琼脂斜面培养基上活化，活化后从琼脂斜面培养基上刮取一环纳他链霉菌孢子，接种至发酵罐液体种子培养基中，在29℃，300rpm的条件下，搅拌培养48h，得种子液；
2)将种子液按10％的接种量接入发酵培养基的中，发酵培养基未接种前体积为0.8L，装入1L全自动发酵罐中，在29℃的条件下进行发酵，发酵过程中溶氧DO值控制在30～40％之间，培养初期pH从初始pH值自然降落至6.00±0.10时开始流加20％浓度NaOH并将pH维持在6.00±0.20之间至发酵结束；发酵过程中流加40％质量百分比浓度的葡萄糖溶液，并始终将葡萄糖含量控制在15.00±5.00g/L，实验组在发酵24h后，添加实施例1的纳他霉素发酵副产物，添加量为发酵培养基体积的5％，继续发酵96h后得纳他霉素；设置对照组，对照组1不添加外源物质；对照组2添加与实验组等量的短杆菌属(Brevibacterium)来源纯化的市售胆固醇氧化酶；对照组3添加与实验组等量的链霉菌属(Streptomyces sp.)来源纯化的市售胆固醇氧化酶。
测定以上4组的纳他霉素含量，结果如表4所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表4不同胆固醇氧化酶在1L发酵体系中对纳他霉素产量的影响
从表4中可以看出，由于实验组在发酵24h后添加了5％体积的含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物以及对照组2、3在发酵24h后添加了短杆菌属和链霉菌属来源的胆固醇氧化酶纯品，其纳他霉素产量都高于未添加的对照组1的纳他霉素产量6.70g/L，分别为8.83g/L、7.15g/L、7.69g/L，产量提高达到了31.79％，6.7％，14.77％。由于胆固醇氧化酶来源不同，与添加短杆菌属和链霉菌属来源的胆固醇氧化酶纯品的对照组相比，实验组的纳他霉素发酵产量比对照组2提高了23.49％，比对照组3提高了14.82％，产量达到最高。因此，本实施例的1L发酵体系验证结果表明，添加5％体积的含胆固醇氧化酶的纳他霉素发酵副产物可以显著提高纳他霉素的产量。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种抗菌肽发酵工艺