具体实施方式

就以下定义的术语而言，应采用这些定义，除非在权利要求中或者本说明书中的别处给出不同的定义。

本文中的所有数值假设应被术语“大约”所修饰，无论是否明确地指出。术语“约”通常是指本领域技术人员将会认为相当于所列举值(即，具有相同的功能或结果)的一系列数字。在许多情况下，术语“大约”可包括被四舍五入为最接近的有效数字的数字。

利用端点对数值范围的陈述包括在该范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、和5)。

在本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”、和“该”包括复数所指对象，除非上下文中另有明确规定。在本说明书和所附权利要求中所使用的术语“或者”通常是以包括“和/或”的其含义而使用，除非上下文中另有明确规定。

应注意的是，在本说明书中对“一个实施方式”、“一些实施方式”、“其他实施方式”等的引述表示所描述的实施方式可包括一个或多个特定的特征、结构、和/或特性。然而，这种陈述未必表示所有实施方式均包括该特定的特征、结构、和/或特性。此外，当结合一个实施方式来描述特定的特征、结构、和/或特性时，应当理解的是无论是否明确地描述，这种特征、结构、和/或特性也可结合其他实施方式而使用，除非明确地陈述相反的情况。

以下的详细说明应参考附图而阅读，在附图中给在不同附图中的相似元件标注相同的附图标记。未必按比例绘制的附图描述了说明性实施方式而并非意图限制本公开的范围。

本文中所使用的“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于：人类和非人灵长目动物，例如黑猩猩、及其他猿类和猴属；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠等)。该术语并不指代特定的年龄或性别。因此，成年人和婴儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性，均意图被包含在该术语的范围内。

本文中所使用的术语“冷冻保存”是指在非常低的温度下冷却并储存生物细胞、组织、或器官以维持它们的生存的工艺。作为一个非限制性例，冷冻保存可以是允许解冻时细胞有高存活率的、在低于冻结点(例如，196K)的温度下冷却并储存细胞的技术。

本文中所使用的术语“冷冻保护剂”是指用于防护生物细胞或组织不受到冷冻的影响的物质。

本文中所使用的术语“微生物群”可以指代人微生物菌群、人微生物群或人肠微生物群。人微生物菌群(或微生物群)是存在于人类的皮肤表面上和皮肤深层中、唾液和口腔黏膜中、结膜中、及胃肠道、泌尿生殖道、或阴道中的微生物的聚集体。人微生物菌群是由细菌、真菌、和古菌所组成。部分的这些生物执行对于人寄主为有用的任务，但大部分的构成人微生物菌群的生物的功能是未知的。在正常情况下，这些微生物并不导致人寄主的疾病，而是参与维持健康。因此，该生物的群体经常被称为“正常菌群”。

生活在人胃肠道中的微生物群体通常被称为“肠道菌群”或“肠道微生物群”。人肠道的微生物群包括有助于消化、维生素合成、和生成人体不能产生的酶类的种类广泛的微生物。

本文中所使用的词组“微生物群恢复治疗”是指一种组合物，该组合物可包含但不限于：含有来源于患者或供体的活肠道菌群的人粪便物、稀释剂、和冷冻保护剂。其他组合物包含等效的经冷冻干燥和再生的粪便或者“合成的”粪便组合物。在将其使用于微生物群恢复治疗之前，对人粪便物进行筛检以确定是否有病原微生物的存在。对人粪便物进行筛检以确定梭菌属(包括艰难梭菌)、诺如病毒、腺病毒、肠道病原体、贾第虫属的抗原、隐孢子虫属和其他病原体(包括抗酸菌、肠球菌，包括但不限于万古霉素耐药肠球菌(VRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSRA))、以及任何卵清蛋白或寄生体、或产芽胞寄生虫(包括但不限于等孢球虫、环孢菌素、和隐孢子虫)的存在。

粪菌治疗的过程可以包括：将健康供体或者具有一个或多个期望特性的供体的粪便样本引入患者的胃肠道中，以使健康的或所希望的肠微生物群重新入住。在某些实例中，在将粪便样本引入之前，可以利用抗生素破坏患者的肠道菌群，使得健康的或所希望的肠微生物群一旦被引入患者中便可以容易地入住于肠道中。

任选地，在将其使用于微生物群恢复治疗之前，将人粪便物过滤。

本公开涉及艰难梭菌感染(CDI)治疗的组合物、制造方法和利用微生物群恢复疗法(MRT)的治疗方法。CDI是常见的医院感染并且经常与严重的发病率和死亡率有关，特别是在老年患者中。虽然CDI治疗是用于本文中所公开MRT组合物的一个例子，但这并非意图是限制性的。其他疾病和/或病况也是可想到的。由使用MRT组合物的治疗理想地产生影响的部分的病况可包括：心血管和/或外周血管疾病、过敏症、肥胖症、低血糖、便秘、口炎性腹泻(例如，乳糜泻)、胃肠癌(例如，胃肠癌是胃癌、食道癌、结肠癌、胆囊癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肛门癌、和胃肠道间质瘤中的至少一种)、黑色素瘤、非鳞状细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、食道癌。乳腺癌、胶质母细胞瘤、纵隔B细胞淋巴瘤、其他血液系统恶性肿瘤、睾丸癌、胰腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、基底细胞癌、神经母细胞瘤、白血病、肉瘤、其他癌症、肌阵挛-肌张力障碍、骶髂关节炎、脊柱关节病、脊柱关节炎、近端肌强直性肌病；自身免疫性疾病肾炎综合征、自闭症、旅行者腹泻、小肠细菌过度生长、慢性胰腺炎、胰功能不全、慢性疲劳综合征、良性肌痛性脑脊髓炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧束硬化症(ALS)、多发性硬化症(MS)、神经系统变性疾病、癫痫大发作或癫痫小发作、营养不良性肌强直、慢性传染性单核细胞增多症、流行性肌痛性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、急性或慢性变态反应肥胖症、厌食症、肠易激综合征(IBS或结肠痉挛)、克罗恩病、肠易激疾病(IBD)、结肠炎、溃疡性结肠炎或局限性结肠炎、慢性传染性单核细胞增多症、流行性肌痛性脑脊髓炎、急性或慢性荨麻疹、狼疮、类风湿关节炎(RA)或幼年特发性关节炎(JIA)、糖尿病前期综合征、纤维肌痛(FM)、I型或II型糖尿病、急性或慢性失眠、偏头痛、和注意缺陷/多动障碍(ADHD)。

在人类的情况下，本公开包括治疗与异常肠道微生物群的存在相关的慢性病症的方法。这种病症包括但不限于属于以下类型的病况：胃肠病(包括肠易激综合征或结肠痉挛)、功能性肠病(FBD)(包括便秘型FBD、以疼痛为主要表现的FBD、上腹部FBD)、非溃疡性消化不良(NUD)、胃食管反流、炎症性肠病(包括克罗恩病)、溃疡性结肠炎、未确定型结肠炎、胶原性结肠炎、显微镜下结肠炎、慢性艰难梭菌感染、伪膜性结肠炎、粘液性结肠炎、抗生素相关性结肠炎、特发性或单纯性便秘、憩室病、艾滋病肠病、小肠细菌过度生长、乳糜泄、结肠息肉病、结肠息肉、慢性特发性假性梗阻综合征；特异性病原体(包括细菌、病毒、真菌和原生动物)的慢性肠感染；病毒性胃肠道病症，包括病毒性胃肠炎、诺瓦克病毒性胃肠炎、轮状病毒性胃肠炎、艾滋病相关胃肠炎；肝病，例如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、脂肪肝或隐源性肝硬化；风湿病，例如类风湿关节炎、非风湿性关节炎、非类风湿因子阳性关节炎、强直性脊柱炎、莱姆病、和赖特综合征；免疫介导的疾病，例如肾小球肾炎、溶血性尿毒综合征、青少年糖尿病、混合型冷球蛋白血症、多动脉炎、家族性地中海热、淀粉样变性、硬皮病、系统性红斑狼疮、和白塞氏综合征；自身免疫性疾病，包括系统性狼疮、牛皮癣、特发性血小板减少性紫癜、干燥综合征、溶血尿毒综合征或硬皮病；神经综合征，例如慢性疲劳综合征、偏头痛、多发性硬化症、肌萎缩性侧束硬化症、重症肌无力症、巴-格二氏综合征、帕金森氏病、阿尔茨海默病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、和其他退行性疾病；精神疾病，包括慢性抑郁症、精神分裂症、精神病、躁狂抑郁症；退化病症，包括阿斯伯格综合征、雷特综合征、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、和注意力缺损症(ADD)；退行性病症、自闭症；婴儿猝死综合征(SIDS)、神经性厌食症；皮肤病，例如慢性荨麻疹、痤疮、疱疹样皮炎和血管炎；及心血管和/或血管病症和疾病。

在全世界，耐药生物体传播的增加已给临床医生带来了会引起公共健康风险的许多挑战。被耐药生物体(例如，耐万古霉素肠球菌(VRE))和艰难梭菌感染共有相似的风险因素。VRE是可以导致移植和免疫缺陷患者中的并发症的医院内病原体。VRE载体也可由于VRE而处于增加的感染风险中，并且也是向其他人的VRE传播的潜在来源。VRE在粪便中的脱落由于抗菌剂接触而增加，并且由于在抗菌剂被中断使用后肠道微生物群的正常化而减少。因此，肠道微生物群的正常化可以不仅可用于治疗艰难梭菌感染(包括慢性感染)，这些治疗也可用于治疗由耐药微生物(例如，VRE和/或其他耐药生物体，包括本文中所公开的)所引起的感染。

在一些情况下，本文中所公开的微生物群恢复治疗组合物(和/或粪菌治疗组合物)可用于治疗被耐药微生物和/或多重耐药微生物(MDRO)所感染的患者。耐药生物体会对抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫药、其他药物、其组合、等)产生耐药性，并且可包括耐药微生物，如细菌、病毒、真菌、寄生虫等。可以利用本文中所公开微生物群恢复治疗组合物进行治疗的感染可以是沿着消化道或者沿着患者的其他系统。

微生物群恢复治疗组合物可用于治疗由多种耐药生物体所引起的感染，例如耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、超广谱产β-内酰胺酶革兰氏阴性细菌、肺炎克雷伯菌、产碳青霉烯酶革兰氏阴性菌、多重耐药革兰氏阴性杆菌(例如，肠杆菌属、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、和绿脓杆菌)、耐药肠杆菌属、多重耐药结核杆杆菌(例如，结核分枝杆菌)、耐药葡萄球菌、耐药肠球菌、耐药淋球菌、耐药链球菌(例如，包括肺炎链球菌)、耐药沙门氏菌、耐药革兰氏阴性菌、耐药念珠菌、耐药HIV、耐药流感病毒、耐药巨细胞病毒、耐药单纯疱疹病毒、耐药性疟疾、耐药间日疟原虫、耐药恶性疟原虫、耐药弓形虫等、和/或其他耐药生物体。这些只是例子。

微生物群恢复疗法组合物可用于治疗其它感染，包括尿路感染。

利用本文中所公开微生物群恢复治疗组合物对耐药生物体的感染的治疗可包括：用耐药生物体对没有先前感染史的患者进行治疗：对具有一次先前感染耐药生物体的患者进行治疗；对具有2次以上(例如，2、3、4、5、6、或更多次)先前感染耐药生物体的患者进行治疗，等。在一些情况下，微生物群恢复治疗组合物可用于对具有3次先前感染耐药生物体的患者进行治疗。在其他情况下，如果先前感染导致住院治疗、如果先前或目前的感染要求用毒性药物进行治疗、或者如果先前感染都是来源于相同的生物体，则微生物群恢复治疗组合物可用于对具有2次先前感染利用耐药生物体的患者进行治疗。

在一些情况下，可以利用灌肠法或其他合适的技术将MRT组合物向患者给药。然而，理想的是将MRT组合物进行口服给药。为了以适合于口服给药的剂型而制备MRT组合物，可执行若干步骤。通常，这些步骤可包括：采集粪便样本；处理粪便样本；使经处理粪便样本冻干或“冷冻干燥”(或者将经处理粪便样本从液体转变成固体)；加入一种或多种添加剂和/或辅料；和由冻干材料和添加剂形成MRT组合物的口服制剂(例如，片剂、胶囊、液体制剂，等)。本文中公开了关于至少部分的这些步骤的一些其他细节。

图1是描述示例性MRT生产工艺的一部分的流程图。这只是一个例子。对供体进行筛检、获得人粪便样本和将粪便样本处理成MRT产品的其他例子公开于共同受让美国专利公布2014/0363398中，该专利公布的内容以参考的方式并入本文中。更具体地，图1示意性地描述了用于采集和检查供体粪便样本的过程。作为采集/检查过程中的第一步骤，对潜在的粪便供体进行筛检。本文中更详细地描述了筛检/预筛检。一旦供体通过筛检，步骤2可包括利用本文中所定义的人粪便采集套件来采集供体的粪便，无论是在家里还是在采集设施处。该套件可以包括但不限于：清洁的带盖人粪便采集容器、大的可闭合/可密封袋、捐赠表格和人粪便采集指示图表。可对采集的时间和数据、以及供体身份和运输方法进行记录，以便追踪从采集到处理的时间、和运输的状况。作为一个非限制性例，采集容器可以包括样本暴露的最低温度和最高温度的指示器。作为另一个非限制性例，可以将在低于大约4℃的温度下和在高于大约室温的温度(大约22-29℃)下改变颜色的一个以上的温敏贴纸粘附到该容器。

步骤3可包括将样本运输到处理设施。可以理解的是，如果在处理设施处采集样本，那么样本的运输不是必要的。在一些情况下，理想的是在处理设备处采集样本从而更明确地确立样本的保管链。当接收任何个体的第一次粪便捐赠时，将为各供体建立一个档案。随后的粪便样本可以经历人粪便检查，该检查被用于匹配并确认提供捐赠的供体的身份。基于先前采集的样本，而生成用于供体的人粪便档案并且可以在重复的捐赠中得以维持或加强。任何新的样本将与此档案进行比较，以确认它属于相同的供体。可以基于在人粪便中拟杆菌属的表征而完成鉴别以确认供体身份。在一个非限制性例中，在处理设备处采集用于建立档案的粪便样本的基本集，以确认存档样本中的供体身份。在另一个非限制性例中，用于建立档案的粪便样本的基本集可以在不同于处理设备的场所进行采集，配有适合于该情况或场所的供体身份确保方案。

所述方法的步骤4可包括：捐赠物贴上“检疫”标签，并且在检疫中在处理前保持捐赠物在室温下或者在低于室温的温度下不超过在24小时至5天范围内的时间。在其中温度指示器已被激活或者在捐赠与接收之间的时间超过24小时的情况下，可拒收捐赠。另外，在适用的情况下，人粪便检查结果必须与供体档案匹配。如果人粪便检查不与供体档案匹配，那么这天所采集的捐赠物将被放弃并且供体将被取消资格。

在本公开的一个方法中，在采集的大约24小时内对人粪便样本进行处理。在本申请的另一个方法中，在粪便样本到达处理设备时，记录为采集的时间。步骤6可包括对粪便捐赠物进行检查。当粪便样本到达处理设备时，可以完成目视检查。在人粪便样本是松散的、未成形的、不具有足够的重量(例如，小于大约50g)的情况下，或者由于任何其他原因(包括但不限于表明样本质量或关于供体健康的因素为较差的证据)，可拒收样本，标记为“检查-拒收”并将该捐赠物放弃。此外，对在人粪便采集表格上问题的回答可以由经培训人员进行复查。采集表格中的某些回答会要求充分的排斥。如果样本被接收，可将它标记为“检查-接收”并且可转移到制造过程。

图2是描述用于制备作为口服剂型的用于MRT的粪便样本的一般说明性方法的一部分的流程图。可想到的是，在用于制备作为口服剂型的用于MRT的粪便样本的方法中的中间体产品可适合于经由灌肠或鼻胃管的MRT。可首先对粪便样本进行采集和筛检100，例如在参照图1所描述的方法中。一旦样本已被接收，可对样本进行提纯和浓缩102。可利用离心、膜过滤、或者其组合对样本进行提纯以去除超过某个粒径的粪便物。可想到的是，因为大部分的感兴趣的细菌是在0.3微米(μm)至30μm的范围内，所以可对样本进行处理以除去大于50-70μm的颗粒。可对样本进行处理以获得75％至90％浓度的细菌。这可提高制剂辅料与细菌比率的灵活性，以便于进一步处理。

可以以若干不同的方式对样本进行膜过滤，包括但不限于过滤袋、压力过滤器、和/或真空过滤器的使用。在一些情况下，可对样本进行多次过滤，用较小的过滤膜进行每次后续过滤。在一些情况下，可以以1:3的比率(粪便与盐水)加入盐水作为稀释剂，尽管这不是必须的。在其他情况下，可将盐水与冷冻保护剂(例如，聚乙二醇(PEG)3350)的混合物用作稀释剂。稀释剂的PEG浓度可以是大约30-90克/升(或大约10-90克/升)。稀释剂的PEG浓度也可以是在大约25-75克/升之间。在一个实例中，盐水/PEG混合物与粪便样本的比率为2:1、或者2mL盐水/PEG混合物与1克人粪便。作为一个非限制性例，可以将大约100mL的盐水/PEG混合物用于50g的人粪便。在另一个例子中，盐水/PEG混合物与粪便样本的比率为3:1，或者3mL盐水/PEG混合物与1克人粪便。作为一个非限制性例，可以将大约150mL盐水/PEG混合物用于50g的人粪便。虽然盐水/PEG可适于用作稀释剂(和/或冷冻保护剂)，但这并非意图是限制性的。也可使用其他的冷冻保护剂。例如，可将右旋葡萄糖、甜菜碱、甘氨酸、蔗糖、聚乙烯醇、普朗尼克F-127、甘露醇、吐温80、乙二醇、1,3-丙二醇、羟丙基纤维素、丙三醇、PEG/丙三醇混合物、丙二醇、或者其组合用作冷冻保护剂。这些物质可单独使用或者结合溶剂(例如盐水)而使用。

在一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约2分钟，以获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可将此滤出液置于具有小于500μm、例如280μm的孔径的过滤袋中。可在有或没有稀释剂的情况下将样本再次利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约4分钟，以获得具有大约280μm以下粒径的滤出液。可将该滤出液置于具有小于例如280μm、例如但不限于60μm的孔径的另一个过滤袋中。可在有或没有稀释剂的情况下将样本再次利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约4分钟，以形成具有大约50-70μm或以下粒径的滤出液。

在另一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，并利用例如Stomacher搅拌器进行搅拌，获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可利用具有大约160μm孔径的压力过滤器对该滤出液进行处理，并且利用具有大约60μm孔径的压力过滤器对所形成的滤出液进行处理。在一些情况下，在使用压力过滤器之前，会需要利用具有在160μm和500μm之间孔径的袋滤器对样本进行二次处理。

在另一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，并且利用例如Stomacher搅拌器进行搅拌，获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可利用具有大约160μm孔径的真空过滤器对该滤出液进行处理，并且利用具有大约60μm孔径的真空过滤器对所形成的滤出液进行处理。在一些情况下，在使用压力过滤器之前，会需要利用具有在160μm和500μm之间孔径的袋滤器对样本进行第二次处理。

一旦样本已被处理而具有大约60μm以下的粒径，然后可将样本清洗并利用离心进一步浓缩。在一些情况下，离心管可具有在50至500mL范围内或更多的容积。填充经过滤悬浮液到大约20至80％的离心管容积。在一个实例中，可将样本以1100至3600每分钟转数(rpm)离心达10至15分钟的周期。在另一个实例中，可将样本以使得离心力在约8-12,000g范围内(例如，约10,000g)的转数离心达15-45分钟或20-30分钟。可将离心增速或逐渐地加速到产生在大约8-12,000g范围内(例如，约10,000g)离心力所需的速度。还可以想到的是，当离心过程完成时，也可将离心缓慢地降速或减速。在一些情况下，理想的是尽可能缓慢地将离心减速，使得返回到大气压的过程缓慢从而防止细菌细胞可能发生破裂。去除上清液而管中的剩余物质是经纯化的中间体MRT组合物。这会形成已被浓缩达大约60％的产品。在一些情况下，离心过程可以是2阶段过程。例如，产品可首先经历“预旋转”(例如，约300-2000xg或约1,400xg，持续1-5分钟或持续约2分钟)以除去粪便纤维物质，然后可经历较长时间的离心以便将产品浓缩。例如，在“预旋转”之后，可将上清液转移到新的离心管/瓶中，然后以更高的速度旋转(例如，约5,000-12,000xg或约10,000xg持续30-60分钟或持续约45分钟)。高速旋转后，可丢弃上清液，并可进一步处理回收的微生物群。还可想到的是，可对多达300mL的体积进行离心，并且不形成所述浓缩量的下降。所形成的MRT组合物是具有70μm以下粒径和大约1×10¹⁰CFU/g细菌浓度的细菌悬浮液。所形成的MRT组合物也可在冷藏条件下为稳定达3周。

在一些实施方式中，可以单独利用多次离心进行纯化和浓缩。然而，细菌悬浮液的粒径仍然会在堵塞移液吸头的范围(例如大于60μm)内。然而，在一些情况下，可使用宽的移液吸头。这是否成功取决于输入的粪便物，粪便物是可变的。还可想到的是，如果批量大小是在数十升的范围内或更多，则可以使用分离器和倾析器的系统。然而，如果起始产物以前已经过处理，那么这会是不必要的。

在其他实施方式中，密度梯度离心可用于粪便样本的纯化和浓缩。密度梯度离心可结合上述的过滤技术而使用，或者单独地使用。密度梯度离心可严格地利用密度而进行分离，而差速离心可利用粒径和密度而进行分离。为了执行密度梯度离心，可将密度梯度介质加入到样本(例如稀释的原样本或稀释的经过滤样本)中。密度梯度介质可以是具有变化浓度的溶液(例如具有变化浓度的蔗糖)。例如，可通过在离心管中将较低溶液浓度叠加在较高溶液浓度上而形成密度梯度介质。可将样本置于密度梯度介质的顶部上并随后进行离心。样本中的颗粒可行进经过密度梯度介质，直到它们达到梯度中它们的密度与周围溶液的密度匹配的点。例如，由于细菌和密度梯度介质的密度，目的物(例如细菌)可沉降在离心管的中部。种类广泛的密度梯度介质可用于离心，包括但不限于：多元(糖)醇、多糖类、无机盐、碘化合物、硅胶，等。其他的密度梯度材料可包括碘海醇(例如(由Axis-Shield制造))、碘克沙醇溶液(例如OptiPrep^TM(由Axis Shield制造))、和/或各种分子量的PEG类。可想到的是，可使用浓度在40％至80％重量/体积(w/v)范围内的该介质可以是医药级、生物惰性、和/或等渗的。在一些情况下，密度梯度离心可以比差速离心更加高效地从粪便中提纯细菌。

在一些实施方式中，切向流过滤(或错流过滤)可结合密度梯度离心使用，以进一步除去任何不合需要的可溶性物质。在切向流过滤中，大部分的给料流可切向地流动经过过滤器的表面而非进入过滤器内部。目的物(例如细菌)的切向流过滤可进一步从目的物中除去可溶性杂质。在切向流过滤期间，当使细菌悬浮液(由传统的离心和/或密度梯度离心获得)通过过滤器的表面时，可将其他的纤维材料推出。在一些情况下，在细菌悬浮液每次通过切向流过滤系统之后，接着的是缓冲剂。可想到的是，可经过切向流过滤系统一次地对较大体积(例如多达约10L)的细菌悬浮液进行处理。在一些情况下，可将来自切向流过滤过程的滤出液用作纯化的中间体粪便样本。可想到的是，可用盐水和/或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)将经过滤悬浮液(例如滤出液)加以稀释。在其他情况下，可利用例如但不限于差速离心和/或死端过滤，对来自切向流过滤过程的滤出液做进一步处理。

在一些实施方式中，理想的是在冷藏条件下使经处理样本在悬浮液中稳定化达在1至2周范围内的时间段104。在一些情况下，去除粪便物并用可溶于水溶液的载体或辅料进行替换可允许使细菌悬浮于液体中并且在没有稳定性问题的情况下做进一步处理。这些辅料溶液的考虑因素可以是pH值、浓度、和等张性或等渗性。可基于蛋白质和单克隆抗体制剂和它们在使生物制品稳定化中的推荐作用来选择辅料。可用于提供样本的液体稳定化104的一些示例性辅料可包括但不限于：盐(NaCl)、蔗糖、海藻糖、L-精氨酸盐酸盐、和/或PEG3350，如在下面的表1中的总结。其他潜在辅料的列表可以参见表I和表III，Seong HoonJeong，Arch Pharm Res，第l35卷，11期，1871-1886页，2012年，以及Pramanick等人的Pharma Times，45卷，3期，2013年3月的表中。

表1：说明性辅料的总结

在一些情况下，辅料可包含2-20％的蔗糖、0.1-5％的L-精氨酸盐酸盐，0.5-20％的PEG3550、或者其组合。

辅料的组合可用于防止生物细胞或组织受到冷冻的影响，并且/或者在储存期间给产品提供稳定性(例如使细胞死亡最小化)。下面的表2中示出了可提供冷冻保护和在储存期间的稳定性的一些示例性辅料复配物。然而，表2中所列出的制剂并非意图是限制性的。也可采用辅料的其他组合和/或量。

表2：在加入到药物之前的辅料溶液组合物

在某些情况下，辅料(例如，冻干辅料)可以在纯化水中包括聚乙二醇(例如，约1-5％，或约2-3％，或约2.3％)、海藻糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)、蔗糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)和甘油(例如，约0.1-5％，或约0.5-2％，或约1％)。

可想到的是，以上辅料复配物，当被加入到药物(例如粪便样本或经处理粪便样本)中时可给液体和/或固体制剂中的生物细胞提供抗冻保护和储存期间的稳定性。在一些情况下，可将辅料复配物以1:1的比率加入到药物中。这只是一个例子。其他辅料与药物的比率也是可想到的，例如但不限于0.25:1、0.5:1、1.5:1、2:1，等。

在部分的这些情况下和在其他情况下，辅料复配物可包含：

(a)0.5-20％的PEG、(b)0.1-5％的甘油、(c)10-30％的PVP、(d)40-80％的海藻糖、(e)40-80％的蔗糖、(f)10-30％磷酸盐缓冲溶液、或(g)它们的组合。其他制剂也是可想到的。

可想到的是，类似的辅料也可用于在膜过滤期间保护细菌。例如，Farber和Sharpe在Applied and Environmental Microbiology，1984年8月，第441-443页中陈述在某些食物碎片(胡萝卜、奶酪、桃子、金枪鱼)的存在下细菌恢复得到改善，pH值会是重要的：pH5.88至6.40(胡萝卜)、pH4.75至5.02(奶酪)、pH5.9至6.2(金枪鱼)、pH3.3至4.05(桃子)。糖类、碳水化合物、或蛋白质类的存在会是重要的，在过滤期间覆盖细菌、支持细菌生长(促益生菌活性)或支持细菌细胞壁的这些食物的特性会是重要的。

合适的载体可随着组合物的期望剂型和给药方式而变化。例如，它们可包含稀释剂或辅料，例如填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、助流剂、润滑剂，等。通常，载体可以是固体(包括粉末)、液体、或者其组合。优选地，各载体从与组合物中的其他成分相容并且对受试者无害的意义上讲是“可接受的”。载体可以是生物学可接受的和惰性的(例如，它允许组合物维持生物材料的存活率直到被传输到适当的部位)。

口服组合物可包含惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗给药的目的，可以将活性化合物与辅料组合并且以片剂、锭剂、或胶囊(例如明胶胶囊)的剂型而使用。口服组合物也可以通过将本公开的组合物与食物混合而制备。在一个实施方式中，使用于给药的食物变冷(例如冰淇淋)。可以包含药学上相容的粘合剂、和/或佐剂作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何的以下成分、或者相似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；辅料，例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、淀粉甘醇酸钠、或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯、橙香精、或其他合适的香精。这些只是为了举例的目的，而并非意图是限制性的。

一旦纯化的样本已被提纯并且稳定化为可适于利用鼻胃管或灌肠法输送的水悬浮剂，那么可将样本进一步处理成适合于口服给药，例如采用片剂、锭剂、或胶囊的剂型。例如，可将水溶液转变成固体106。一系列的细菌处理技术可以参见Martin等人的InnovativeFood Science and Emerging Technologies，27(2015)15-25。

在一些情况下，可利用冻干或冷冻干燥将样本从液体转变为固体。样本可具有冷冻保护剂，例如但不限于PEG、脱脂奶、活性炭、抗坏血酸或者其组合，用以防止细菌不受冷冻的影响。样本也可具有冻干保护剂，例如但不限于蔗糖、肌醇、海藻糖、丙三醇、或其组合。在一些情况下，样本也可具有可提供酸缓冲的富集材料。可替代地或此外，该富集材料也可保持细菌更加有活性，这可便于分析性测试。一些示例性富集材料可包括但不限于：脱脂奶、活性炭、明胶、抗坏血酸、GI介质、或者其组合。可替代地或此外，可在冻干之前和/或之后将除氧剂加入到样本中。虽然不希望受到理论的约束，但一般认为除氧剂可提高样本的稳定性和/或存活率。可想到的是，冻干管可包括可以用于在冷冻干燥后将冻干小丸从冻干管中排出的插入物。冻干管的宽度可小于用于口服治疗的胶囊壳的宽度。这可允许一盘的小丸直接地转移入胶囊壳中。可想到的是，这可降低或排除对制剂的颗粒粒度测量或者将其进一步混合108以改善进入胶囊的流动特性的需要。剂量也可决定于小丸尺寸。在一些情况下，在冻干过程中所产生小丸的可包含大约4.5×10⁸CFU(CDC)。0号胶囊可容纳3个小丸。因此，胶囊可包含大约6.7×10⁹CFU(CDC)。会需要每天服用八粒胶囊两次，这相当于一个灌肠剂量。此外，无需对在胶囊填充前被混合到一起的一批小丸的均匀性进行检查。在一些情况下，压紧可允许在各胶囊内部有更大浓度或数量的小丸。例如，将小丸压紧于胶囊内部可允许各胶囊中有大约2-4倍(例如，大约2.5倍)数量的小丸(例如，在没有压紧的情况下各胶囊可容纳2-4或约3个小丸，而在压紧的情况下各胶囊可容纳大约7-10或大约8个小丸)。这可有助于减少患者需要服用以便达到期望剂量的胶囊的数量。在一些情况下，在将压紧入胶囊之前，可将小丸磨碎。如果小丸被磨碎，理想的是粉末具有在15至30范围内的卡尔指数值，以便于胶囊充填。可替代地，可将小丸磨碎并压制成片剂。然后可将肠溶散剂压制在该片剂上方，以形成可在胃的酸环境中稳定但在肠道中溶解的口服制剂。

在其他情况下，理想的是利用蒸发泡沫干燥来保存样本。可想到的是，传统的辅料和设备可用于该过程。在处理期间较高的辅料浓度和用于产生泡沫的优化工艺参数可形成低含水量的制剂。含水量越低，在室温下为稳定的可能性越大。一旦样本已被干燥106，可对样本做进一步处理以获得期望的粒径并且/或者进行混合108从而制备用于口服产品加工的样本。

在其他的实施方式中，可利用脂质体将液体样本微胶囊化，以便将液体样本与胆汁、藻酸盐、和/或聚合物隔开。一旦样本已被包埋，可对样本做进一步处理以获得期望的粒径并且/或者进行混合108从而制备用于口服产品加工的样本。

在样本已被处理成期望的粒径并且/或者被混合108以制备用于口服产品加工的样本之后，可将样本封装110。可想到的是，封装过程可提供低pH值保护112。例如，封装过程可防止或大体上防止胶囊壳、片剂、和/或锭剂在胃的酸性环境中崩解，使得MRT组合物在期望的肠道部分被释放。可想到的是，会需要肠溶包衣胶囊，用以提供在胃中的保护并且具有胶囊在小肠和大肠中的崩解。在一些情况下，可利用肠溶衣对胶囊进行锅包衣。肠溶包衣材料可包括脂肪酸类、蜡类、虫胶、塑料、和植物纤维。羟丙基甲基纤维素(HPMC)的锅包衣，或者也被称为羟丙基甲基纤维素胶囊，将在低pH值下起保护作用并且也有助于防止受到湿气的影响。一些合适的胶囊可包括从获得的DRcaps^TM和Vcaps^TM。同样地，具有60％HPMC和40％HPMCP(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)组成的AR胶囊可具有相同的性能。非明胶的胶囊类型可含有较少的水(明胶胶囊通常含有10至12％的水，而其他聚合物胶囊含有3-4％以下的水)。会需要用在低pH环境中为不溶的聚合物使胶囊封边，如将在下面更详细地论述。在其他情况下，可将胶囊叠加，以便将2粒以上的胶囊用于封装样本。例如，可将样本置于胶囊中然后将该胶囊置于另一个较大的胶囊中。叠加(例如2粒以上的胶囊)的和/或封边的胶囊可在酸性环境(例如胃)中存在达至少2小时以上，并且在更加中性的肠道中溶解。

在一些情况下，已利用耐低pH值聚合物而封边的胶囊会不完全地崩解并且/或者释放产品达5小时以上。这可允许胶囊完好无损地通过胃并且允许产品被释放进入对于细菌为理想的肠中。还可想到的是，与胃的酸性环境(在1.2的pH范围内)相反，将MRT组合物释放进入肠的更中性环境中可允许更多的细菌存活。使胶囊封边可包括将耐低pH值聚合物的带环置于第一胶囊部与第二胶囊部重叠区域的上方。在其他情况下，两个胶囊(例如，双重封装)，其中一个胶囊位于另一个胶囊内，可使胶囊完整地通过胃和/或使所需数量的活菌可到达目标区域。

在一些实施方式中，超级崩解剂可用于使剂型(例如胶囊或片剂)膨胀以提高细菌与肠壁接触的可能性。例如，交联纤维素在10秒内溶胀4至8倍，交联淀粉在小于30秒内溶胀7至12倍，交联海藻酸经历在水性介质中的快速溶胀或者毛细作用。

益生元的存在对于确保在肠中作用部位的细菌生长会是理想的。这些是可以被加入到胶囊制剂中或者在相同的给药时间单独地给药的物质。一些合适的添加剂包括：低聚半乳糖、菊糖衍生物(如低聚果糖)、纤维素、糊精类、甲壳素类、胶质、β-葡聚糖类、蜡类、木质素、植物化学物(存在于水果、蔬菜、谷物、和其他植物食物中的生物活性非营养植物化合物)、类胡萝卜素、酚类物质、生物碱类、含氮化合物和有机硫化合物。可想到的是，在某些浓度范围内，当传输药品时L-精氨酸和PEG辅料可产生水和电解质分泌物。这可增强细菌与肠附着并在肠中生长的能力。产生此效果的其他辅料也可改善治疗效果。

可将一个口服产品以若干不同的方式进行包装，包括但不限于：泡罩包装或瓶子。在一些情况下，可将除氧剂和/或干燥剂置于瓶和/或泡罩中。泡罩包装和/或瓶子可包括用于使包装不会被儿童开启的特征。例如，瓶子可具备防儿童开启瓶盖，并且泡罩包装可具备防儿童开启套。在一些情况下，泡罩包装可包括被设计用于指导患者如何使用包装的图解。例如，泡罩包装可提供关于在给定的一天服用多少丸剂和/或何时服用丸剂的指导。该包装可包括监测运输状态的监测装置。作为一个非限制性例，包装容器可以包括产品所暴露的最低和最高温度的指示器。作为另一个非限制性例，可以将在低于大约4℃的温度和大于约室温(大约22-29℃)的温度下改变颜色的一个或多个温度敏感贴纸粘贴到容器。

图3和图4是描述用于制备用于作为口服制剂的MRT的粪便样本的两个说明性方法201、300的流程图。在一些实施方式中，口服剂型可由新鲜粪便样本(图3)而制备，在其他实施方式中口服剂型可由已经过处理的物质(图4)而制备。本文中所使用的新鲜粪便样本将被称为药物A，以前已经过处理的样本将被称为药物B。其他药物是可想到的，包括从粪便微生物群的培养物获得的物质。首先参照图3，可首先对粪便样本进行采集和筛检，例如在参照图1所描述的方法中。一旦样本已被接收，可将样本称重并装入过滤袋中，如在步骤200所示。可想到的是，可使用(例如汇集在一起)在它们的到期日内的多个采集容器(例如，相同或不同的供体并且在各种时间采集)。可利用离心、膜过滤、或其组合对样本进行提纯，以除去超过某个粒径的粪便物。可想到的是，因为大部分的感兴趣的细菌是在0.3微米(μm)至30μm的范围内，所以可对样本进行处理以去除大于在50-70μm范围内的颗粒。可对样本进行处理以获得大约60％浓度的细菌。这可允许提高制剂辅料与细菌比率的灵活性，以便进一步处理。

可将过滤溶液或稀释剂加入到过滤袋中，如在步骤202所示。在一些情况下，可将盐水用作稀释剂。例如，可将0.9％氯化钠(NaCl)的溶液以大约3毫升(mL)每克药物A的比率加入到过滤袋中。在其他情况下，磷酸盐缓冲盐水可按1:1(重量)的比例加入到过滤袋中。可想到的是，视需要，可采用其他稀释剂、其他稀释剂浓度、和稀释率。例如，可将盐水与冷冻保护剂(例如，聚乙二醇(PEG)3350)的混合物用作稀释剂。稀释剂的PEG浓度可以是大约30-90克/升(或大约10-90克/升)。稀释剂的PEG浓度也可以是在大约25-75克/升之间。在一个实例中，盐水/PEG混合物与粪便样本的比率为2:1，或者2mL盐水/PEG混合物对1克人粪便。然而，在一些情况下，例如当特定地对药物A进行处理以便于冻干时，稀释剂可以不包含冷冻保护剂。然后，可以以多种不同的方式对样本进行膜过滤，包括但不限于过滤袋、压力过滤器、和/或真空过滤器的使用，如在步骤204所示。在一些情况下，样本可过滤多次，用较小的滤膜进行每次后续过滤。在一个实例中，可将样本置于500μm过滤袋中并且利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约2分钟，以获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可将该滤出液置于具有小于500μm，例如280μm孔径的过滤袋中。可在有或没有稀释剂的情况下将样本再次利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约4分钟的时间，以获得具有大约280μm以下粒径的滤出液。可将该滤出液置于具有小于例如280μm，例如但不限于50-70μm孔径的另一个过滤袋中。可在有或没有稀释剂的情况下将样本再次利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约4分钟的时间，以形成具有大约50-70μm或以下粒径的滤出液。

在另一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，并且利用例如Stomacher搅拌器进行搅拌，获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可以利用具有大约160μm孔径的压力过滤器对该滤出液进行处理，再利用具有大约60μm孔径的压力过滤器对所形成的滤出液进行处理。在一些情况下，在使用压力过滤器之前，会需要利用具有在160μm和500μm之间孔径的袋滤器对样本进行第二次处理。

在另一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，并且利用例如Stomacher搅拌器进行搅拌，获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可利用具有大约160μm孔径的真空过滤器对该滤出液进行处理，再利用具有大约60μm孔径的真空过滤器对所形成的滤出液进行处理。在一些情况下，在使用压力过滤器之前，样本会需要利用具有在160μm和500μm之间孔径的袋滤器进行第二次处理。

一旦样本已经过处理而具有大约50-70μm或以下的粒径，可将样本置于中间体储存容器中，如在步骤206所示。可接受的中间体储存容器的一个例子是250mL带盖无菌塑料容器。在一些情况下，可将经过滤悬浮液在冰箱中在5±3℃温度下储存达5天，尽管这不是必须的。可将经过滤悬浮液合并并且混合入较大的容器中，如在步骤208所示。可接受的中间体储存容器的一个例子是带盖的多升无菌塑料容器。

然后可将混合的经过滤悬浮液的等分部分置于容积为50至500mL的离心管中，如在步骤210所示。将经过滤悬浮液填充到大约20至80％的离心管的容积。在一些情况下，可使用具有大于500mL容积的离心管。然后可将经过滤悬浮液清洗并利用离心进一步浓缩，如在步骤212所示。在一个实例中，可将样本以1100至3600每分钟转数(rpm)离心达10至15分钟的周期。在另一个实例中，可以以使得离心力在约8-12,000g范围内(例如，约10,000g)的转速将各样本离心达15-45分钟或20-30分钟。可使离心增速或逐渐地加速到产生在大约8-12,000g范围内(例如，大约10,000g)的离心力所需的速度。还可想到的是，当离心过程完成时，也可使离心缓慢地减慢或减速。在一些情况下，理想的是尽可能慢地使离心减速，使得恢复到大气压的速度较慢从而防止细菌细胞可能地发生破裂。去除上清液并且管中的剩余物质是经纯化的中间体MRT组合物。这可形成已被浓缩达大约60％的产品。

在一些情况下，离心过程可以是2阶段过程。例如，产品可首先经历“预旋转”(例如，约300-2000xg或约1,400xg，持续1-5分钟或持续约2分钟)以除去粪便纤维物质然后可经历较长时间的离心从而将产品浓缩。例如，在“预旋转”之后，可将上清液转移到新的离心管/瓶中，然后以更高的速度旋转(例如，约5,000-12,000xg或约10,000xg，持续30-60分钟或持续约45分钟)。高速旋转后，可丢弃上清液，并可进一步处理回收的微生物群。还可想到的是，可在不导致浓缩量下降的情况下，对多达300mL的体积进行离心。在一些情况下，可对大于300mL的体积进行离心。例如，如上所述，可以以容器容积的百分比(例如，在60％的范围内)的形式来选择离心体积。所形成的MRT组合物是具有70μm以下粒径和大约1×10¹⁰CFU/g细菌浓度的细菌悬浮液。可利用单叠氮溴化丙锭(PMA)定量聚合酶链反应(qPCR)法来测量经纯化的中间体细菌存活率。所形成的MRT组合物也可在冷藏条件下稳定达3周。

在一些实施方式中，可以将单用离心多次以纯化和浓缩。然而，细菌悬浮液的粒径可仍然在堵塞移液吸头的范围内(例如大于60μm)。这是否成功取决于是可变的输入粪便物。还可想到的是，如果批量大小是在数十升以上的范围内，则可以采用分离器和倾析器的系统。

可将中间体MRT组合物任选地转移至中间体管，并且如有必要，运送至冻干设备，如在步骤214所示。如有必要，可将纯化的中间体在用于5±3℃的冷藏条件的预审合格的运送器中运送至合同冻干机进行冻干。

可以将经纯化中间体以1:1的比率与冻干辅料溶液混合，如在步骤216所示。该冻干辅料溶液可由2.3％的PEG3350、1％的甘油、10％的海藻糖、和10％的蔗糖所组成。然而，可使用其他的冻干辅料。在将辅料溶液加入到经纯化中间体之前，经过0.2μm过滤器将冻干辅料溶液(无甘油)过滤。将甘油在121℃下高压灭菌达最短15分钟并且无菌地添加。一旦已将冻干辅料与经纯化中间体混合(冻干悬浮液)，将单份200微升(200μL)的冻干悬浮液等分置于96孔平板的各孔中，如在步骤218所示，并且冻干，如在步骤220所示。

下面将进一步参照示出说明性冻干工艺220的流程图的图5来描述冻干过程。为了执行冻干，96孔平板，一旦被填充，可遮蔽在无菌生物保护罩中，如在步骤402所示。其他平板尺寸也是可想到的。在所有平板被遮蔽之后，可将它们立即输送并加载入冻干机中，如在步骤404所示。可将冻干机密封并且开始冻干周期。通过使产品搁板温度降低至大约-40℃至-45℃的范围而将产品冷冻，如在步骤406所示。在产品被冷冻之后，通过抽真空并使搁板温度升高到高达0℃而进行一级干燥(升华)，如在步骤408所示。开始二级干燥步骤以进一步降低含水量并且使产品达到环境温度(大约25℃)，如在步骤410所示。在二级干燥步骤的结束时释放真空并且将产品从冻干机中取出，如在步骤412所示。可将产品置于厌氧室的内部，以便进行冻干的等分部分的采集。冻干的等分部分可呈小丸的形式并且被转移至含有干燥剂的包装中，如在步骤414所示。填充的包装可用氮气吹扫并且热封，如在步骤416所示。现在返回到图3，如果中间体MRT组合物已被运送离开现场进行冻干，那么可在用于冷藏条件的预审合格的运送器中将冻干小丸运送回到MRT组合物制造商，如在步骤222所示。

在一些情况下，理想的是冻干的材料或小丸具有高于30℃的玻璃化转变温度(T_g)。在一些实例中，玻璃化转变温度可在30-75℃的范围内。这会形成在室温下为稳定的最终产品。玻璃化转变温度也可用作对从冻干过程所接收的产品进行筛检和/或用于验证最终产品的稳定性的工具。例如，T_g可用于预测在储存期间产品的稳定性。在一些情况下，超过储存温度的50℃的T_g可允许冻干的中间体和/或最终口服药品储存达一段时间而没有细菌显著损失的情况。

当接收冻干中间体时，可将其从包装中取出并填充入胶囊中，如在步骤224所示。也可对冻干中间体采样并且利用PMA-qPCR法测量总存活率。可在氮气吹扫区中在环境温度下进行封装以使冻干中间体与氧的接触最小化。将冻干中间体封装在羟丙基甲基纤维素胶囊中。基于胶囊尺寸(例如，1、0、或00号)，可将多个冻干中间体加载入羟丙基甲基纤维素胶囊中。

然后可将胶囊封边，如在步骤226所示。在一些情况下，可利用羟丙基甲基纤维素将胶囊封边。在一些情况下，封边材料可以是基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子共聚物，例如但不限于L100。在其他情况下，封边材料可以是羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙甲纤维素醋酸琥珀酸酯。这些只是例子。封边材料可以是耐低pH值环境(例如胃)且在高pH值环境(例如肠道)中降解的任何材料。各胶囊赋予一致的封边厚度，因此崩解性能满足验收限度。另外，胶囊可以不是封边的和/或在其他方面没有封边材料。将胶囊在5±3℃的冷藏条件下储存在氮气吹扫的散装塑料容器或者含有干燥剂的包装中。可将封装并封边的药品装在含有干燥剂的包装中并且热封，如在步骤228所示。在一些情况下，可将封装且封边的药品以单独的用药剂量包装在金属化聚酯/聚乙烯粘接膜中。这可使药品与可导致产品降解的氧和/或湿气的接触最小化。金属化聚酯/聚乙烯粘接膜可具有0.02gr/100in²的湿蒸汽透过率和0.0402/mL/100in²的透氧率(在24小时内)。可在防儿童开启容器中将粘接膜小袋提供给患者，以满足对于防儿童开启的临床供给包装的需求。该防儿童开启容器可以是40克(2.5盎司)的带防儿童开启盖的绿色小药瓶。该小药瓶可由半透明的耐光聚丙烯制成。低密度聚乙烯(LDPE)防儿童开启盖有助于防止通过要求使用者按下盖并将盖旋转以开启容器的未经批准的进入。

现在参照图4，示出了用于制备作为口服剂型的用于MRT的以前经纯化的粪便样本(药物B)的说明性方法300。药物B可以是粪便微生物群冷冻制剂，以灌肠剂型而制备，包括按1g粪便与3mL溶液的比率进行灌肠的人粪便和2.3％聚乙二醇3350(或它冷冻保护剂)溶液和0.9％氯化钠溶液。例如，已以类似于上述步骤200至212的方式对药物B进行了处理，并且在步骤202加入冷冻保护剂。在步骤212中所概述的离心过程之后，可将纯化的中间体(例如现在是药物B)冷藏、冷冻，或者用于治疗。

在步骤302开始，如有必要，可将冷冻制剂解冻，并且置于过滤袋中。可想到的是，可使用在它们的使用期数据内的多个采集容器(例如相同或不同的供体并且在各种时间采集)。可利用离心、膜过滤、或者其组合将样本提纯，以除去超过某个粒径的粪便物。可想到的是，因为大部分的感兴趣细菌是在0.3微米(μm)至30μm的范围内，所以可对样本进行处理以除去大于在50-70μm范围内的颗粒。可对样本进行处理以获得大约60％浓度的细菌。这可允许提高制剂辅料与细菌的比率的灵活性，以便进一步处理。

可将过滤溶液或稀释剂加入到过滤袋中，如在步骤304所示。在一些情况下，可将盐水用作稀释剂。例如，可将0.9％氯化钠(NaCl)溶液以大约3毫升(mL)每克药物B的比率加入到过滤袋中。可想到的是，视需要，可采用其他稀释剂、其他稀释剂浓度、和稀释率。然后，可以以若干不同方式(包括但不限于过滤袋、压力过滤器、和/或真空过滤器的使用)对样本进行薄膜过滤，如在步骤306所示。在一些情况下，样本可利用较小的过滤膜过滤多次，各自进行随后的过滤。在一个实例中，可将样本置于500μm过滤袋中并且利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约2分钟以获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后，可将该滤出液置于具有小于500μm例如280μm孔径的过滤袋中。可在有或没有稀释剂的情况下将样本再次利用例如Stomacher搅拌器以230rpm搅拌达大约4分钟，以获得具有大约280μm以下粒径的滤出液。可将该滤出液置于具有小于例如280μm、例如但不限于50-70μm孔径的另一个过滤袋中。可在有或没有稀释剂的情况下再次利用例如Stomacher搅拌器将样本以230rpm搅拌达大约4分钟，以形成具有大约50-70μm以下粒径的滤出液。

在另一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，并且利用例如Stomacher搅拌器进行搅拌，获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后利用具有大约160μm孔径的压力过滤器对该滤出液进行处理，然后利用具有大约60μm孔径的压力过滤器对所形成的滤出液进行处理。在一些情况下，在使用压力过滤器之前，会需要利用具有在160μm和500μm之间孔径的袋滤器对样本进行第二次处理。

在另一个实例中，可将样本置于有或没有稀释剂的500μm过滤袋中，并且利用例如Stomacher搅拌器进行搅拌，获得具有大约500μm以下粒径的滤出液。然后可利用具有大约160μm孔径的真空过滤器对该滤出液进行处理，并且利用具有大约60μm孔径的真空过滤器对所形成的滤出液进行处理。在一些情况下，在使用压力过滤器之前，会需要利用具有在160μm和500μm之间孔径的袋滤器对样本进行第二次处理。

一旦样本已被处理而具有大约50-70μm或以下的粒径，可以将样本置于中间体储存容器中，如在步骤308所示。可接受的中间体储存容器的一个例子是250mL的带盖无菌塑料容器。在一些情况下，可将经过滤悬浮液在冰箱中在5±3℃温度下储存达高达5天，尽管这不是必须的。可将经过滤悬浮液合并并且混合入较大的容器中，如在步骤310所示。可接受的中间体储存容器的一个例子是带盖的多升无菌塑料容器。

然后，可将混合的经过滤悬浮液的等分部分置于容积为50至500mL的离心管中，如在步骤312所示。将经过滤悬浮液填充到大约20至80％的离心管的容积。在一些情况下，可使用具有大于500mL容积的离心管。然后可将经过滤悬浮液清洗并且利用离心进一步浓缩，如在步骤314所示。在一个实例中，可将样本以1100至3600每分钟转数(rpm)离心达10至15分钟的周期。在另一个实例中，可以用使得离心力为约8-12,000g(例如，约10,000g)范围内的转速将样本离心达15-45分钟或20-30分钟。可使离心增速或逐渐地加速到建立在约8-12,000g范围内(例如，约10,000g)的离心力所需的速度。还可想到的是，当离心过程完成时，也可使离心缓慢地减慢或减速。在一些情况下，理想的是尽可能慢地使离心减速，使得恢复到大气压的过程较慢，从而防止细菌细胞可能地发生破裂。去除上清液并且管中的剩余物质是经纯化的中间体MRT组合物。这可形成已被浓缩达大约60％的产物。

在一些情况下，离心过程可以是2阶段过程。例如，产品可首先经历“预旋转”(例如，约300-2000xg或约1,400xg，持续1-5分钟或持续性2分钟)以除去粪便纤维物质，然后可经历较长的离心以使产品浓缩。例如，在“预旋转”之后，可将上清液转移到新的离心管/瓶中，然后以更高的速度旋转(例如，约5,000-12,000xg或约10,000xg，持续30-60分钟或持续约45分钟)。高速旋转后，可丢弃上清液，并可进一步处理回收的微生物群。还可想到的是，可在不导致浓缩量下降的情况下，对多达300mL的体积进行离心。在一些情况下，可对大于300mL的体积进行离心。例如，如上所述，可以以(例如，在60％的范围内)容器容积的百分比的形式来选择离心体积。所形成的MRT组合物是具有70μm以下粒径和大约1×10¹⁰CFU/g数量级细菌浓度的细菌悬浮液。可利用单叠氮溴化丙锭(PMA)定量聚合酶链式反应(qPCR)法来测量经纯化中间体的细菌存活率。在冷冻状态下，所形成的MRT组合物也可稳定达3周。

在一些实施方式中，可以单独进行多次离心用于纯化和浓缩。然而，细菌悬浮液的粒径可能仍然在堵塞移液吸头的范围内(例如大于60μm)。这是否成功取决于可变的输入粪便物。还可想到的是，如果批量大小是在数十升以上的范围内，则可以采用分离器和倾析器的系统。

可将中间体MRT组合物任选地转移至中间体管，并且如有必要，运送至冻干设备，如在步骤316所示。如有必要，可将经纯化中间体在用于5±3℃冷藏条件的预审合格的运送器中运送至合同冻干机，进行冻干。

可将经纯化中间体以1:1的比率与冻干辅料溶液混合，如在步骤318所示。冻干辅料溶液可包括2.3％的PEG3350、1％的甘油、10％的海藻糖和10％的蔗糖。然而，也可使用其他的冻干辅料。在将辅料溶液加入到经纯化中间体之前，经过0.2μm过滤器对冻干辅料溶液(不含甘油)进行过滤。将甘油在121℃下高压灭菌达最短15分钟并且无菌地添加。一旦冻干辅料和经纯化中间体已被混合(冻干悬浮液)，将冻干悬浮液的单个200微升(200μL)等分置于96孔平板的各孔中，如在步骤320所示，并且冻干，如在步骤322所示。

可将经纯化的中间体以合适的比率(例如1:1的比率)与冻干辅料溶液混合，如在步骤318所示。在一些情况下，冻干辅料可以在纯化水中包括聚乙二醇(例如，约1-5％，或约2-3％，或约2.3％)、海藻糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)、蔗糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)和甘油(例如，约0.1-5％，或约0.5-2％，或约1％)。例如，冻干辅料溶液可包括2.3％的PEG3350、1％的甘油、10％的海藻糖和10％的蔗糖。然而，可以使用其它冻干辅料。在将辅料溶液加入到经纯化的中间体之前，经过0.2μm过滤器对冻干辅料溶液(不含甘油)进行过滤。将甘油在121℃下高压灭菌最短15分钟并且无菌地添加。一旦冻干辅料和经纯化中间体已被混合(冻干悬浮液)，将冻干悬浮液的单个200微升(200μL)等分置于96孔平板的各孔中，如在步骤320所示，并且冻干，如在步骤322所示。

另一个示例方法可以包括制造MRT组合物，该MRT组合物适合用作通过灌肠给药的药物和/或适合用作制造用于口服给药的药物的原材料。该过程可以包括从预先筛选的供体采集新鲜的人粪便样本。这样的过程可以类似于本文公开的那些过程和/或类似于美国专利号9,675,648和9,629,881中公开的那些过程，在此通过引用并入于此。在一些情况下，会采集并汇集来自相同的供体的多个样本。汇集的样本(也可以称为药物)可以在5℃±3℃的无菌微生物容器中存储。一种或多种其他样本和/或部分汇集的样本可以作为储备样本存储在-80℃冷冻室中的无菌微生物容器中。

可从汇集的样本中取出汇集样本/药物(例如，50±10g)的一部分并置于过滤袋组件中。过滤袋组件可包括外封闭袋内的过滤袋。辅料溶液(例如，也可理解为稀释剂、冷冻保护剂或其它溶液)可被添加到药物中。辅料溶液可包括在0.9％氯化钠中的10-90g/L，或约20-50g/L或约30g/L聚乙二醇(例如聚乙二醇3350粉末)。辅料溶液可以以合适的比率如每1g药物1-5mL(例如，每1g药物3mL辅料溶液)加入。将汇集样本/药物的一部分/样本放入过滤袋组件中，然后加入辅料溶液的过程可以重复进行，直到汇集样本/药物被充分用完。例如，如果剩余的汇集样本/药物的重量为50±10g或更多，则可将另一个汇集样本/药物的样本添加到另一个过滤袋组件中。一旦汇集样本的剩余部分的重量小于50±10g，则可以丢弃汇集样本/药物的剩余部分，并且可以关闭过滤袋组件。

可一次一个地混合含有药物和辅料溶液的封闭过滤袋组件。例如，可将过滤袋组件放入桨式混合器中并进行处理(例如，以约230RPM的速度持续约2分钟)。桨式混合器的运行时间和速度可以电子控制，并且可以在制造每批产品之前对设置进行验证。

可以打开在桨式混合器中处理的第一滤袋组件，并且可以将滤液取出并填充到冷冻管中。该冷冻管可进行质量控制(QC)并储存在-80℃的冷冻室中。质量控制药品释放的样本可在QC实验室进行检测。储备样本可储存在-80℃的冷冻室中。

可将乙烯醋酸乙烯酯(EVA)灌肠袋的填充管盖移除，从过滤袋组件中抽取150±30g的微生物悬浮液(例如，过滤后的药物和辅料)，并通过填充口填充到EVA袋中。填充完成后，更换填充管盖，在从生物安全柜中取出EVA袋之前将其密封。EVA袋上的填充管可以使用封管器将袋体和填充盖之间密封，以防止不慎打开容器密封。每个EVA灌肠袋上可贴上标有药品批号的标签，以及“检疫”批次状态贴纸。

在处理中的药品在-80℃的冷冻室中冷冻之前可在5℃±3℃下冷藏。药品在-80℃的冷冻室中冷冻之前可在5℃±3℃下保持长达24小时。药品(例如，装在密封灌肠袋内的药品)可从冷藏储存中转移到指定的-80℃的药品检疫冷冻室。检疫药品在QC处理之前，一直留在这个位置。如果所有供体和QC测试结果均可接受，则该批次将作为释放处理。如果结果不可接受，则该批次将被视为拒绝和丢弃。被处置为接受的药品将从-80℃的检疫冷冻室中取出，贴上“接受”标签，并转移到指定的释放药品的-80℃的冷冻库中。被接受的、被释放的药品，可能与药物B相似，可被解冻并给病人服用(例如，通过灌肠)。释放的药品也可理解为悬浮的中间体，适合用于制造如下所述的口服MRT组合物。

口服MRT组合物的批量制造从选择多袋释放药品开始(例如，其中每袋释放药品包含如上所述制造的冷冻悬浮中间体)。每袋释放药品可以来自同一供体。所选的袋可在合适的温度(例如室温)下解冻合适的时间(例如约2小时)，并可将一定量(例如500克)的悬浮中间体转移到一个或多个1升离心瓶中。稀释剂可加入到悬浮中间体中。稀释剂可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它合适的稀释剂。稀释剂可以以适当的比例(例如1∶1的重量比)加入到悬浮中间体中，通过间歇性的轻轻摇动进行混合，并在4℃下保持30分钟。此时，样本可称为稀释后的中间体。

稀释后的中间体可以进行差速离心。例如，稀释的中间体可以以相对低速离心。例如，稀释的中间体可在约500-2,000xg，或约1,000-1,500xg，或约1,400xg下离心约1-5分钟(例如，2分钟)。该低速离心可在4℃±3℃下进行。来自该低速旋转的上清液可以转移到一个或多个新的1L离心瓶(例如，含有瓶衬)中进行进一步处理，并且可以丢弃丸状材料。然后，可将含有采集的上清液的瓶子以相对较高的速度离心。例如，采集的上清液可在约5,000-20,000，或约8,000-12,000xg，或约10,000xg下离心约15-60分钟(例如约45分钟)。高速离心可以在4℃±3℃下进行。在高速旋转之后，可丢弃上清液，并保留剩余的小丸(例如，如果多瓶离心，则可为小丸)用于进一步处理。小丸可称为回收的微生物群。

冻干辅料/冷冻保护剂可以以适当的比例加入到回收的微生物群中。例如，冻干辅料可以以1:1的比例(w/w)加入到回收的微生物菌群中。在一些情况下，冻干辅料可包括在纯化水中的聚乙二醇(例如，约1-5％，或约2-3％，或约2.3％)、海藻糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)、蔗糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)和甘油(例如，约0.1-5％，或约0.5-2％，或约1％)。例如，冻干辅料溶液可包含2.3％PEG3350、1％甘油、10％海藻糖和10％蔗糖。可使用桨式混合器将瓶衬中装载的混合物混合，以形成均匀的悬浮液。重悬的微生物菌群溶液可等分置于96孔平板中(例如，每孔200微升)，并进行冻干处理。可以利用其它板型和/或单孔皿。

下面将进一步参照示出示例性冻干工艺220/322的流程图的图5来描述冻干过程。为了执行冻干，一旦被填充，可将96孔平板遮蔽在无菌生物保护罩中，如在步骤402所示。其他的平板尺寸也是可想到的。在一些实施方式中，也可使用具有零个孔的托盘。这可使可用于接纳冻干悬浮液的容积最大化，这可提高冻干过程的效率。在将所有平板遮蔽之后，可将它们立即运输并加载入冻干机中，如在步骤404所示。可将冻干机密封并且开始冻干周期。通过使产品搁板温度降低至大约-40℃至-45℃的范围而将产品冷冻，如在步骤406所示。在产品被冷冻之后，通过抽真空并且使搁板温度提高至高达0℃而行进一级干燥(升华)，如在步骤408所示。开始二级干燥步骤，以进一步降低含水量并且使产品达到环境温度(大约25℃)，如在步骤410所示。在二级干燥步骤的结束时释放真空并且将产品从冻干机中取出，如在步骤412所示。可将产品置于厌氧室的内部，以便冻干的等分部分的采集。冻干的等分部分可采用小丸的形式，并且转移至含有干燥剂的包装中，如在步骤414所示。填充的包装可用氮气吹扫并且热封，如在步骤416所示。如果中间体MRT组合物已被运送离开现场进行冻干，那么然后可将冻干的小丸在用于冷藏条件的预审合格的运送器中运送回到MRT组合物制造商，如在步骤324所示。在一些情况下，冻干小丸可以被称为冻干中间体。

在一些情况下，冻干中间体的组合物(％w/w)可包括处理后的微生物群(例如，约10-75％，或约40-60％，或约45-50％，或约47.9％)、聚乙二醇(例如。约1-10％，或约3-8％，或约5.2％)、甘油(例如，约0.5-5％，或约1-4％，或约2.2％)、海藻糖(例如，约10-40％，或约20-30％，或约22.4％)和蔗糖(例如，约10-40％，或约20-30％，或约22.4％)。经处理的微生物群可包括约1×10⁵至1×10¹²个活细菌，或约1×10⁶至1×10¹¹个活菌，或约1×10⁷至1×10¹⁰个活菌。可以理解的是，冻干中间体的组合物可以在放入胶囊之前进行机械加工，代表口服MRT组合物的活性成分的组成。当制造过程利用冻干辅料，，该冻干辅料包括在纯化水中的聚乙二醇(例如，约1-5％，或约2-3％，或约2.3％)、海藻糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)、蔗糖(例如，约1-25％，或约5-15％，或约10％)和甘油(例如，约0.1-5％，或约0.5-2％，或约1％)时，得到所公开的组合物。

在一些情况下，理想的是冻干小丸具有大于30℃的玻璃化转变温度(T_g)。在一些例子中，玻璃化转变温度可在30-75℃的范围内。这可形成在室温下为稳定的最终产品。玻璃化转变温度也可用作用于对从冻干工艺所接收产品进行筛检和/或用于验证最终产品的稳定性的工具。例如，T_g可用于预测产品在储存期间的稳定性。在一些情况下，超过储存温度的50℃的T_g可允许在没有细菌显著损失的情况下将冻干的中间体和/或最终口服药品储存达一段时间。

当接收冻干中间体时，可将其从包装中取出，碾磨或以其他方式破碎成更小的颗粒和/或粉末状的稠度，并且碾磨后的材料可以填充入胶囊中，如在步骤326所示。也可对冻干的中间体进行取样并且利用PMA-qPCR法(例如，美国专利申请公布号US2017/0327862中公开了示例性方法，其通过引用并入本文)测量总存活率。在氮气吹扫区中在环境温度下进行封装，以使冻干中间体与氧气的接触最小化。将冻干中间体封装在一粒或多粒羟丙基甲基纤维素胶囊中。可以基于胶囊尺寸(例如，1、0、或00号)将多个冻干的中间体(例如多个小丸)加载入羟丙基甲基纤维素胶囊中。例如，可在NF级氮气净化手套箱内使用手动胶囊填充设备将研磨后的药品封装在0号胶囊中。可对已填充的胶囊进行胶囊间含量均匀性测试。然后可将这些胶囊填充成00号胶囊。换句话说，该药品可以是双重封装的。

可选地，可使胶囊封边，如在步骤328所示。在一些情况下，利用羟丙基甲基纤维素使胶囊封边。在一些情况下，封边材料可以是Eudragit L100、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、或羟丙基甲基纤维素醋酸酯/琥珀酸酯。这些只是例子。封边材料可以是耐低pH值环境(例如胃)且在高pH值环境(例如肠道)中降解的任何材料。赋予各胶囊一致的封边厚度，因此崩解性能满足验收限度。将胶囊在5±3℃的冷藏条件下储存在氮气吹扫散装塑料容器或者含有干燥剂的包装中。可将胶囊储存在含有干燥剂的包装中并且热封，如在步骤330所示。在一些情况下，可将胶囊以单独的用药剂量包装在金属化聚酯/聚乙烯粘接膜中。这可使可导致产品降解的药品与氧气和/或水分的接触最小化。金属化聚酯/聚乙烯粘接膜可具有0.02gr/100in²的湿蒸汽透过率和0.0402/mL/100in²的透氧率(在24小时内)。可将粘接膜小袋在防儿童开启容器中提供给患者，以满足对防儿童开启临床供给包装的需求。该防儿童开启容器可以是带防儿童开启盖的40克(2.5盎司)绿色药用小瓶。该小瓶可由半透明的、耐光聚丙烯制成。该低密度聚乙烯(LDPE)防儿童开启盖有助于防止通过要求使用者按下盖并使盖旋转以打开容器的未经批准的进入。

在至少一些实例中，封装药品(例如，包括双重封装药品)的水分含量小于或等于约10％，或小于或等于约8％，或小于或等于约6％。在至少一些实例中，封装的药品被包装以限制/最小化任何进一步的水分更新。

在至少一些实例中，药品可包括约10％或更多来自拟杆菌纲的的细菌，或约15％或更多来自拟杆菌纲的细菌，或约20％或更多来自拟杆菌纲的细菌。

实施例

可通过参考以下实施例而进一步说明本公开，这些实施例的作用是举例说明一些实施方式而并非限制本发明。

实施例1：MRT样本制剂的坍塌温度的测定

确定了12个样本微生物群恢复治疗制剂的坍塌温度结果。坍塌温度可用于帮助开发优化的制剂和冻干周期参数，用以在合理量的时间内在不影响其物理或化学完整性的情况下将此类型的产品冷冻干燥。对这些制剂，及含有的厌氧微生物细胞悬浮液执行标准冻干周期。

实施例2：用于冷冻干燥显微技术的材料和方法

将12个制剂用于检查。各基质含脱脂奶10％、抗坏血酸1％、明胶1.4％和活性炭0.3％。各成分是食品级、USP(美国药典)或NF级的化学品。然后，用下列中的每个添加剂来补充基质：

·海藻糖10％和蔗糖10％

·蔗糖10％和肌醇5％

·海藻糖10％和丙三醇1％

·棉子糖10％和肌醇5％

·棉子糖10％和丙三醇1％

·葡萄糖5％和肌醇5％

·PEG 1％和蔗糖10％

·PEG 1％和丙三醇1％

·海藻糖10％、蔗糖10％和丙三醇1％

·蔗糖10％和乳糖8％

·海藻糖10％和肌醇5％

·PEG 1％和乳糖8％

制备各制剂。冷冻干燥显微观测仪器是由带Linkam FDCS196热台的Olympus BX53偏光显微镜、T95系统控制器、LNP液氮泵、和Edwards E2M1.5真空泵所组成。

将100毫升(ml)样本的20微升(μL)等分部分置于载玻片上，该载玻片在滴加一小滴的硅油之后已被置于热台上。将一个小盖玻片置于样本的上方并且将室密封。然后，以10℃/分钟使样本冷却至-45摄氏度(℃)。记录在冷却阶段期间材料变冷冻的温度。一旦温度下降至-45℃，开始抽真空。然后，以1℃/分钟使产品样本升温。在该周期期间对产品样本连续地进行监测，以观察干燥和升华前沿。一旦观察到坍塌的证据，则记录该温度。表3是对每个制剂的冷冻温度和坍塌温度的总结。

表3.记录的各制剂的冷冻温度和坍塌温度

冻干周期受到多种因素的影响，包括制剂中的固体百分比、小瓶尺寸和直径、坍塌温度、室压、搁板温度、产品阻力等。完成一级干燥工艺所必需的室压和搁板温度决定于制剂的热特性，主要是坍塌温度。一级干燥温度低于坍塌温度，以补偿由于生长中的干燥层的阻力增加所导致的产品升温。基于以上因素的组合而设计三个周期。所有周期时间均是在小于48小时的时间内完成。表4是对基于临界坍塌温度的冻干周期的干燥温度和室压的总结。

表4.基于临界坍塌温度的冻干周期的一级干燥温度和室压

基于在冷冻干燥显微观测研究期间所采集的数据而设计冻干周期。执行用于每个制剂的中试冻干周期，以检查细菌细胞混合物的饼状结构和存活率。基于由GibsonBioscience确立的方案完成细胞的采收和悬浮液的分散，以获得微生物范围为10e7至10e8菌落形成单位每100微升混合物等分。所使用的微生物种群是从研究的第一阶段中进行选择并且包括下列厌氧菌：单形拟杆菌Bacteroides uniformis ATCC 8492^TM、Alistipesputredinis ATCC 29800^TM、活泼瘤胃球菌Ruminococcus gnavusATCC 29149^TM、和卵形拟杆菌Bacteroides ovatus ATCC 8484^TM。

利用系列稀释法测定冻干前后的活细胞数(CFU)。各稀释液包括下列水平：10e3、10e5、10e7、和10e9。将小丸样本在1mL的磷酸盐缓冲盐水中再水合。将所有样本涂布至预还原CDC厌氧血琼脂平板和选择性拟杆菌胆汁七叶苷琼脂平板上，一式两份。将琼脂平板在厌氧环境中在35-37℃温度下保温达48小时。

就所有制剂而言，冻干周期形成良好质量的饼状结构。各小丸是固体并且具有均匀的外观。当在1.0mL磷酸盐缓冲盐水中再水合时，各冻干小丸在30秒内溶解。以冷冻干燥后细菌菌落形成单位的总数除以冷冻干燥前细落形成单位的总数的百分比的形式计算存活率。菌落形成单位是基于4种生物的混合物。将各制剂的全部菌落形成单位的生存量和存活百分率汇总于表5和表6。

表5.被直接地接种到CDC厌氧血琼脂上的各制剂的全部菌落形成单位的生存量和存活百分率

*基于对数转换数据

表6.被直接地接种到选择性拟杆菌胆汁七叶苷琼脂上的各制剂的总菌落形成单位的生存量和存活百分率

*基于对数转换数据

基于采集的数据，当把海藻糖与蔗糖或者蔗糖与肌醇的组合用于基础制剂时，所选择的厌氧菌显示最高的存活率。对于在CDC厌氧血琼脂和选择性拟杆菌胆汁七叶苷琼脂两者上的回收率都是如此。这些结果表明，在冻干期间海藻糖与蔗糖或者蔗糖与肌醇的组合为拟杆菌属提供最好的保护。

实施例3：在储存期间固体产品的细菌稳定性

进行了研究以确定在制造后和储存时包装的封装胶囊的稳定性。利用标准微生物平板计数法、分子非培养PMA-qPCR法、及PMA和非PMA处理样本两者的16s rRNA基因测序来表征存在于固体药品中的活性组分(细菌)。平板计数和总存活量稳定性数据表明：与在较高储存温度和相对湿度(25±2℃/60％±5％RH和30±2℃/65％±5％RH)下相比，冻干的包装封装产品(利用第一冻干工艺)在较冷的储存条件(5±3℃)下更加稳定。冻干的包装封装产品(利用第二冻干工艺)的平板计数和总存活量稳定性数据表明包装的封装产品在大约5±3℃和25±2℃的储存温度下均稳定。

实施例4：制造适合用作经灌肠给药的药物和/或适合用作制造口服给药的起始原 料的MRT组合物的示例性过程

注：步骤1-3可在II类B2生物安全柜内进行。所有用于操作药物、辅料溶液或药品配方的仪器(如压舌板、血清学移液器)均为由制造商提供预消毒的一次性使用的仪器。过滤袋、封口袋和EVA袋也由制造商提供预先消毒。

步骤1—采集供体汇集的药物测试样本和药物储备样本

新鲜的人粪便样本可以从预先筛选的供体那里采集。在一些情况下，可从同一供体采集多个样本并将其汇集起来。汇集的样本可在5℃±3℃下储存在无菌微生物容器中。一个以上额外的样本和/或汇集样本的一部分，可作为储备样本储存在-80℃的无菌微生物学容器中。

步骤2—分发药物

可以从汇集的样本中抽取50±10g的样本(例如，药物)，并将其置于过滤袋组件中。过滤袋组件可包括外封闭袋内的滤袋。

步骤3—分发辅料溶液

辅料溶液(例如，也可理解为稀释剂、冷冻保护剂或其它溶液)可被添加到药物物质中。辅料溶液可以包括30g/L聚乙二醇(例如，聚乙二醇3350粉末)在0.9％氯化钠中的溶液。可按每1g药物3mL辅料溶液的比例加入。如果汇集样本的剩余重量为50±10g或更多，可重复步骤2和3。如果汇集样本的剩余重量小于50±10g，则可丢弃汇集样本的剩余部分，并关闭过滤袋组件。

步骤4—混合和过滤

每次将装有药物和辅料溶液的封闭式过滤袋组件放入桨式混合器中，以230转/分的速度处理2分钟。桨式混合器的运行时间和速度由电子控制，在制造每批产品之前对设置进行验证。

注：步骤5-6在II类B2生物安全柜内进行。

步骤5—采集药品质量控制和储备样本

桨式混合器中处理的第一个滤袋是打开的，滤液可被抽出并填充到冷冻管中。冷冻瓶可提交给质量控制(QC)并储存在-80℃的冷冻室中。QC样本只从每批生产的第一个剂量采集。

步骤5A—药品质量控制释放测试

质量控制药品释放的样本在QC实验室中进行检测。储备样本可储存在-80℃的冷冻室中。

步骤6—填充

可将乙烯醋酸乙烯酯(EVA)灌肠袋的填充管盖移除，从过滤袋组件中抽取150±30g的微生物悬浮液(例如，过滤后的药物和辅料)，并通过填充口填充到EVA袋中。填充完成后，更换填充管盖，将EVA袋密封后再从生物安全柜中取出。

步骤7—密封EVA袋

EVA袋上的填充管可以使用封管器将袋体和填充盖之间密封，以防止不慎打开容器密封。

步骤8—贴上批次识别标签和检疫标签

每个EVA灌肠袋上贴有标有药品批号的标签，以及“检疫”批次状态贴纸。

步骤9—将药品在5℃±3℃下冷藏

在处理中的药品在-80℃冷冻器中冷冻之前，在5℃±3℃下冷藏。药品在-80℃冷冻室中冷冻前，可在5℃±3℃下保存24小时。

步骤10—将药品放入-80℃的冷冻室中冷冻

药品(例如装在密封灌肠袋中的药品)可从冷藏储存转移到指定的-80℃的药品检疫冷冻室。被检疫的药品在QC处理之前，一直留在这个位置。

步骤11—药品的处理

如果所有供体和QC测试结果均可接受，则该批次将作为释放处理。如果结果不可接受，则该批次将被视为拒绝和丢弃。

步骤12—释放药品

被处置为接受的药品将从-80℃的检疫冷冻室中取出，贴上“接受”标签，并转移到指定的释放药品的-80℃的冷冻库中。被接受的、被释放的药品，可被解冻并给病人服用(例如，通过灌肠)。

实施例5：从释放的药品制造口服MRT组合物的示例性过程

步骤1—解冻悬浮中间体

口服MRT组合物的批量制造从选择多袋释放药品开始(例如，其中每袋释放药品包含如实施例4描述制造的冷冻悬浮中间体)。每袋释放药品都来自同一供体。所选的袋子在室温下解冻至少2小时，并可将500g的悬浮中间体转移到1升的离心瓶中。

步骤2—添加稀释剂

磷酸盐缓冲盐水(PBS)可以以1∶1的重量比加入到悬浮中间体中，通过间歇性的轻轻摇动进行混合，并在4℃下保持30分钟。

步骤3-差速离心

稀释后的中间体在1,400xg和4℃±3℃下离心2分钟。该低速旋转的上清液可以转移到新的1L含有瓶衬的离心瓶中进行进一步处理，并且可以丢弃丸状材料。然后，可将含有采集上清液的瓶子在10,000xg和4℃±3℃下离心45分钟。在高速旋转之后，可丢弃上清液，并保留回收的微生物群用于进一步处理。

步骤4—用冻干辅料溶液重悬回收的微生物群

冻干辅料/冷冻保护剂可以以1:1的比例(w/w)加入到回收的微生物菌群中。冻干辅料可在纯化水中包含2.3％的聚乙二醇(例如，PEG3350)、10％海藻糖、10％蔗糖和1％甘油。可使用桨式混合器将混合物混合，以形成均匀的悬浮液。

步骤5—冻干

重悬的微生物菌群溶液被等分置于96孔平板中(例如，每孔200微升)并放入合格的冻干机中。冻干步骤见下表。

表7：冻干循环的详细信息

步骤6—碾磨操作

在NF级氮气净化手套箱工作站内，冻干的药物颗粒通过低能耗的碾磨机进行碾磨。

步骤7—双重封装

在NF级氮气净化手套箱内使用手动胶囊填充设备将研磨后的药品封装在0号胶囊中。可对已填充的胶囊进行胶囊间含量均匀性测试。然后可将这些胶囊填充成00号胶囊。

步骤7A—填充均匀性测试(克/粒)

称取一组有代表性的填充0号胶囊样本，以保证填充的均匀性。

步骤8—批量包装和标签

胶囊单独装在铝铝泡罩包装中，并配有儿童阻止型的盖箔。泡罩包装上贴有标签并装入剂量纸盒，然后在5℃±3℃下保存。

步骤9—采集最终药品QC、稳定性和储备样本

对填充的00号胶囊进行代表性的抽样检测，用于产品释放。

步骤9A：最终药品的释放测试

可对药品进行释放测试。

步骤10—检疫扣留

批量胶囊在包装前置于指定的检疫药品冷藏库中。

步骤11—最终产品处理

如果所有的QC测试结果和批次记录审查要求都是可以接受的，则该批次将作为接受处理。如果结果不可接受，则该批次将被处置为拒绝和丢弃。质量保证会将最终产品批次处置为接受或拒绝。

步骤12—最终的包装和标签

胶囊单独装在铝铝泡罩包装中，并配有儿童阻止型的盖箔。泡罩包装上贴有标签并装入剂量纸盒，然后在5℃±3℃下保存。

步骤13—释放

处置为接受的产品批次将从检疫药品库中取出，贴上“接受”标签，转入5℃±3℃的指定释放药品库。

处理保持时间：每个中间步骤的保持时间见表8。

表8.处理保持时间

实施例6—批量配方

表9.微生物菌群胶囊封装前的批量配方

NA—不适用

^a组分在处理过程中被去除；纯化后可能会残留微量的氯化钠和磷酸盐

^b冻干过程中去除的组分

如实施例4所述，每个批次的起始材料是60个释放剂量的释放药品，相当于大约9000克起始材料，并导致回收大约1700克重悬在冻干介质中的微生物群。该材料在96孔板中进行冻干，从而得到约7700个冻干小丸。冻干小丸研磨后，粉末产量约为300克，每粒胶囊的填充重量为235毫克，胶囊的理论产量约为1200粒/批。尽管起始材料的供体与供体之间存在差异，但迄今为止生产的供体和批次之间估计的每毫克细菌数是相似的。该产品由填充重量控制。

实施例6—药品的描述和组分

该药品是一种浓缩的、冻干的微生物粉末，封装在肠溶胶囊中。该药品由以下成分组成(见表10-12)。

表10.药品组分

NA—不适用

^a组分在处理过程中被去除；纯化后可能会残留微量的氯化钠和磷酸盐

^b在本文件中被称为海藻糖，但正式名称为海藻糖二水合物。

^c冻干过程中去除的组分

^d指的是胶囊3.2.P.4.1部分

将碾磨的冻干中间体粉末填充并夯进0号胶囊，不加任何辅料，用00号胶囊过度封装。预期配方百分浓度与预封装的材料相同。

表11.每个胶囊中的冻干中间体的组分

表12描述了药品的介绍。

表12.药品介绍

应当理解的是，本公开在许多方面仅仅是说明性的。在不超过本公开的范围内，可在细节中作出变更，尤其是在形状、尺寸、和步骤的安排方面。当然，本发明的范围是由其中表达所附权利要求的语言所限定。