天蓝色链霉菌突变菌株，利用其的β-琼脂糖酶生产方法及利用其的新琼寡糖制备方法
阅读说明：本技术 天蓝色链霉菌突变菌株，利用其的β-琼脂糖酶生产方法及利用其的新琼寡糖制备方法 (Streptomyces coelicolor mutant strain, beta-agarase production method using same and new agaro-oligosaccharide preparation method using same ) 是由 李济贤 金恩妵 李娟嬉 于 2019-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种通过紫外线照射而使存在于野生型天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株的DagB基因的碱基序列发生点突变的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)-M22-2C43菌株。根据本发明的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)-M22-2C43菌株几乎不表达DagBβ-琼脂糖酶或着表达几乎没有β-琼脂糖酶活性的DagB突变酶,因此没有必要额外地从培养液中对DagA酶进行分离提纯,并且,通过利用天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)-M22-2C43菌株的培养液或其上层液,可以制备新琼四糖(neoagarotetraose)或新琼六糖(neoagarohexaose)的含量相对比新琼二糖(neoagarobiose)高的新琼寡糖。(The present invention provides a Streptomyces coelicolor A3(2) _ M22-2C43 strain in which the nucleotide sequence of the DagB gene present in a wild-type Streptomyces coelicolor A3(2) strain is point-mutated by ultraviolet irradiation. The Streptomyces coelicolor A3(2) _ M22-2C43 strain according to the present invention hardly expresses DagB β -agarase or a DagB mutant enzyme having almost no β -agarase activity, and therefore, it is not necessary to additionally isolate and purify DagA enzyme from the culture broth, and a neoagarotetraose (neoagarotetraose) or neoagarohexaose (neoagarohexaose) having a higher content than neoagarobiose (neoagarobiose) can be prepared by using the culture broth of Streptomyces coelicolor A3(2) _ M22-2C43 strain or a supernatant thereof.)
技术领域
本发明涉及一种天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)突变菌株，利用其的β-琼脂糖酶(Beta-agarase)生产方法及利用其的新琼寡糖(Neoagaro-oligosaccharides)制备方法，更具体地，涉及一种与亲本菌株相比主要表达DagA酶的天蓝色链霉菌突变菌株，利用其来大量生产β-琼脂糖酶中DagA酶的方法，以及利用其从琼脂或琼脂糖制备新琼四糖(neoagarotetraose)或新琼六糖(neoagarotetraose)的含量比新琼二糖(neoagarobiose)更高的新琼寡糖的方法。
背景技术
很久以来，琼脂作为被广泛应用于食品添加剂、医药品、化妆品、家畜饲料和工业原料等的代表性的多糖类(来源于海藻类)，在韩国国内，其为每年生产量大约达到2000～5000吨的比较丰富的水产资源中的一个。然而，在实际使用中，仅仅简单地加工处理全部产品的一部分而用作廉价的原材料，其余大部分则被弃置，因此与富集的资源量相比，其处于一种附加价值非常低的处境。因此，实际上，迫切需要关于丰富的国内琼脂的新用途和提高其附加价值的研究。
除少量的蛋白质、灰分及脂肪以外，琼脂大部分是由多糖组成，并且构成上述琼脂的多糖中含有作为中性多糖的琼脂糖(agarose)和作为酸性多糖的琼脂胶(agaropectin)。琼脂糖将D-半乳糖(D-galactose)和3,6-内醚-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)以β-1,4形式进行结合的琼脂二糖(agarobiose)作为单体，并且，由于琼脂二糖具有以α-1,3键的形式重复连接的直链结构，因此凝胶(gel)化能力强。相反，琼脂胶与琼脂糖一样，同样将琼脂二糖作为单体，但是由于琼脂胶含有如硫酸基等酸性基图案，因此凝胶化能力较弱。其中，琼脂糖通过作用于β-1,4键的β-琼脂糖酶(β-agarase)而经过新琼四糖(neoagarotetraose)被分解为新琼二糖(neoagarobiose)，进一步通过作用于α-1,3键的α-琼脂糖酶(α-agarase)而最终被分解为D-半乳糖(D-galactose)和3,6-内醚-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)。另外，琼脂糖能通过稀酸或α-琼脂糖酶(α-agarase)而被分解为琼脂二糖(agarobiose)。通常，新琼寡糖意味着通过β-琼脂糖酶(β-agarase)对琼脂或琼脂糖进行水解而获得的如新琼二糖(neoagarobiose)、新琼四糖(neoagarotetraose)、新琼六糖(neoagarohexaose)、新琼八糖(neoagarooctaose)等2～10个程度的单糖结合而成的寡糖。另外，琼脂寡糖意味着通过稀酸或α-琼脂糖酶(α-agarase)对琼脂或琼脂糖进行水解而获得的如琼脂二糖(Agarobiose)、琼脂四糖(Agarotetraose)、琼脂六糖(Agarohexaose)、琼脂八糖(Agarooctaose)等2～10个程度的单糖结合而成的寡糖。新琼寡糖将3,6-内醚-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)作为非还原性末端，相反，琼脂寡糖将D-半乳糖(D-galactose)作为非还原性末端，由于这样的结构性差异，因此在生理学活性方面也可以显示出相互不同的性质。
另一方面，已知作为放线菌的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)将分解琼脂或琼脂糖(agarose)的β-琼脂糖酶(β-agarase)以细胞外(分泌至细胞外的)蛋白质形态进行生产(Stanier等,1942,细菌学杂质；Hodgson and Chater,1981,J.Gen.Microbiol.)，该琼脂糖酶是通过DagA基因或DagB基因来进行编码的。天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)所生产的β-琼脂糖酶(β-agarase)中，DagA酶主要通过分解琼脂或琼脂糖(agarose)来生成DP4(新琼四糖)及DP6(新琼六糖)，DagB酶主要通过分解琼脂或琼脂糖(agarose)来生成DP2(新琼二糖)。另外，据报告，在琼脂或琼脂糖(agarose)的β-琼脂糖酶(β-agarase)反应产物中的DP4(新琼四糖)和DP6(新琼六糖)相比DP2(新琼二糖)具有更高的抗肥胖，抗糖尿，改善高血脂症等代谢疾病，抗癌，增强免疫的功效，因此，DagA基因在通过放线菌生产琼脂糖酶的研究中具有重要的地位。尤其，天蓝色链霉菌在分子生物学研究中作为最广泛使用的菌株，其染色体DNA的序列在2002年由英国的桑格中心(Sanger centre)进行了分析，目前已经发表(Bantley等，2002，自然)。
关于新琼寡糖的制备和用途，韩国授权专利第10-0794593号中公开了一种具有琼脂分解能力的海洋细菌属菌株SL-5(Thalassomonas sp.SL-5)KCCM 10790P和利用上述菌株所生产的β-琼脂糖酶(β-agarase)来制备新琼寡糖的方法，所述新琼寡糖为选自由新琼二糖、新琼四糖及新琼六糖所组成的组中的一种以上。另外，韩国授权专利公报第10-1072503号中公开了一种居水菌属菌株SL-12KCCM 10945P(Glaciecola sp.SL-12KCCM10945P)和利用上述菌株所生产的β-琼脂糖酶(β-agarase)来制备新琼寡糖的方法，其中新琼寡糖为选自由新琼二糖、新琼四糖及新琼六糖所组成的组中的一种以上。另外，韩国授权专利第10-1303839号中公开了一种从假交替单胞菌属(Psuedoalteromonas sp)菌株分离的β-琼脂糖酶和利用其来制备新琼寡糖的方法，其中新琼寡糖为选自由新琼四糖和新琼六糖所组成的组中的一种以上。另外，韩国授权专利第10-1295659号中公开了一种从噬糖菌属(Saccharophagus sp.)菌株中分离的β-琼脂糖酶及利用其生产新琼寡糖的方法，所述新琼寡糖为选自由新琼四糖和新琼六糖所组成的组中的一种以上的。另外，韩国授权专利公报第10-1212106号中公开了一种通过将从噬糖菌属(Saccharophagus sp.)菌株中分离的β-琼脂糖酶与一种以上的基质进行反应的方式生产新琼二糖的方法，其中上述基质为选自由琼脂、新琼四糖和新琼六糖所组成的组中的一种以上。并且，韩国授权专利公报第10-1206006号公开了一种具有琼脂分解活性的琼胶酶高产菌属mbrc-1菌株KCCM 11151P(Flammeovirga sp.Mbrc-1 KCCM 11151P)以及将上述菌株生产出的β-琼脂糖酶(β-agarase)与琼脂反应而生成新琼寡糖的方法，其中新琼寡糖为选自由新琼二糖、新琼四糖和新琼六糖所组成的组中的一种以上。另外，韩国授权专利公报第10-1302655号中公开了一种新琼四糖和新琼六糖的制备方法，其中上述制备方法特征在于，将来源于天蓝色链霉菌的琼脂糖酶与琼脂糖或琼脂进行反应。另外，韩国授权专利公报第10-1190078号中公开了一种能够对原核生物进行转化的β-琼脂糖酶重组表达载体和利用其来生产β-琼脂糖酶的方法，该方法中包含表示为SEQ ID NO.7的碱基序列的DNA片段(其包含来源于天蓝色链霉菌的胰蛋白酶基因(sprT)的启动子和信号肽编码区(coding region)而构成)；以及表示为SEQ ID NO.2的碱基序列的DNA片段(在来源于天蓝色链霉菌的β-琼脂糖酶基因(DagA)中去除信号肽(Signal peptide)编码区)。另外，韩国公开专利公报第10-2014-0060045号中公开了一种利用新型β-琼脂糖酶生产基因的新琼二糖或新琼四糖的酶促生产方法。另外，韩国公开专利公报第10-2009-0044987号中公开了一种包含新琼四糖(neoagarotetraose)为有效成分的皮肤美白组合物。另外，韩国公开专利公报第10-2013-0085017号中公开了包含3,6-内醚-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)的预防或治疗皮肤色素沉着疾病的药用组合物；包含3,6-内醚-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)的皮肤美白用或保湿用化妆品组合物；包含3,6-内醚-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)的预防或治疗炎症性疾病的药用组合物等。如上所述，在现有技术中，为了从琼脂或琼脂糖制备出新琼四糖(neoagarotetraose)和新琼六糖(neoagarohexaose)含量相对比新琼二糖(neoagarobiose)高的新琼寡糖，使用了利用基因重组来制备转化菌株或在从通过新型菌株或重组菌株进行表达的β-琼脂糖酶中仅对DagA进行分离提纯的方法。然而至今，几乎没有关于在商业可应用水平上的能够生产DagAβ-琼脂糖酶的菌株的报道。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明是在现有的技术背景下导出的，本发明的一个目的在于，提供一种与亲本菌株相比，主要表达相对高活性的DagAβ-琼脂糖酶，并且几乎对DagBβ-琼脂糖酶不进行表达的天蓝色链霉菌突变菌株。
另外，本发明的另一个目的在于，提供一种利用天蓝色链霉菌突变菌株来有效地大量生产DagAβ-琼脂糖酶的方法。
另外，本发明的再一个目的在于，提供一种利用天蓝色链霉菌突变菌株而从琼脂或琼脂糖中制备新琼四糖(neoagarotetraose)或新琼六糖(neoagarohexaose)的含量相对比新琼二糖(neoagarobiose)高的新琼寡糖的方法。
用于解决问题的方案
本发明的发明人通过对野生型天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株进行紫外线照射来诱导其突变，并在其中初次筛选出对β-琼脂糖酶过表达的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株，并申请了专利(韩国公开专利公报第10-2018-0019887号，2018.02.27)。关于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的筛选和技术性特征，本发明参照了韩国公开专利公报第10-2018-0019881号中所记载的全部内容。初次筛选的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株被确认为能对DagA和DagBβ-琼脂糖酶均进行表达。之后，通过再次向初次筛选的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株照射紫外线来诱导其突变，并最终通过筛选出天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株来完成了本发明。其中，上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株主要表达高活性的DagAβ-琼脂糖酶，并且几乎不表达DagBβ-琼脂糖酶或表达几乎没有β-琼脂糖酶活性的DagB突变酶。
为解决上述目的，本发明的一例提供一种天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株(保藏编号：KCCM 12577P)，该菌株的在相同条件下培养而获得的培养液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性或从上述培养液中回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性比野生型天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)菌株至少大1.2倍以上，优选地，至少大1.4倍以上，并且相比野生型天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)菌株或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株(保藏编号：KFCC11668P)，该菌株主要表达DagAβ-琼脂糖酶，且几乎不表达DagBβ-琼脂糖酶或着表达几乎没有β-琼脂糖酶活性的DagB突变酶。虽然，通过公知的多种突变方法可以获得根据本发明的一例的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株，但是，优选地，通过向野生型天蓝色链霉菌A3(2)亲本菌株照射紫外线来使其突变。具体地，可以通过用紫外线照射野生型天蓝色链霉菌A3(2)亲本菌株使其突变的方式获得天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株，且进一步地，通过用紫外线照射天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株使其突变的方式获得天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株。根据本发明的一例的上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株相比野生型天蓝色链霉菌A3(2)亲本菌株能够生产活性显著提升的β-琼脂糖酶或相比亲本菌株以显著提升的方式表达β-琼脂糖酶。另外，当根据本发明的一例的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株与野生型的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)菌株或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22(保藏编号：KFCC11668P)菌株进行比较时，获得通过点突变(point mutation)(作为正常的DagB基因(参照SEQ ID NO.1)的第1420个DNA碱基序列的鸟嘌呤(G)被替换为胞嘧啶(C))而修饰的DagB基因(参照SEQ ID NO.2)。另外，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株中含有的通过基因突变而修饰的DagB基因(参照SEQ ID NO.2)，在菌株培养时几乎不表达或表达几乎没有β-琼脂糖酶活性的DagB突变酶。具体地，野生型天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)菌株或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株(保藏编号：KFCC11668P)表达由SEQ IDNO.5的氨基酸序列组成的DagBβ-琼脂糖酶。相反，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株表达由与发生修饰的DagB基因对应(参照SEQ ID NO.2)的SEQ ID NO.6的氨基酸序列组成的DagB突变酶。与由SEQ ID NO.5的氨基酸序列组成的正常的DagBβ-琼脂糖酶进行比较，由SEQ ID NO.6的氨基酸序列组成的DagB突变酶第474个氨基酸鸟嘌呤(G)被替换为精氨酸(R)，其被确认为几乎没有β-琼脂糖酶活性，尤其是，几乎没有分解琼脂或琼脂糖(agarose)而转化成DP2(新琼二糖)的活性。
由于根据本发明的一例的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株具有通过基因突变而发生修饰的DagB基因，因此主要对DagAβ-琼脂糖酶进行表达，几乎不表达DagBβ-琼脂糖酶或者表达几乎没有β-琼脂糖酶活性的DagB突变酶。因此，当利用根据本发明一例的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液或上述培养液的上层液时，可以从琼脂或琼脂糖制备出新琼四糖(neoagarotetraose)或新琼六糖(neoagarohexaose)的含量相对比新琼二糖(neoagarobiose)高的新琼寡糖。
为了解决上述目的，本发明的一例提供β-琼脂糖酶生产方法，其包括：(a)将上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株接种于作为碳源含有半乳糖(Galactose)的液体培养基，并通过培养来获得培养液的步骤；及(b)通过离心上述培养基来获得上层液的步骤。考虑培养液或从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性，根据本发明的一例的β-琼脂糖酶生产方法中，上述液体培养基内的半乳糖的浓度优选为0.5％(w/v)至4％(w/v)，并且考虑培养液或从培养液回收的上层液的DagA酶活性时，更优选为1.0％(w/v)至2.5％(w/v)。另外，考虑培养液或从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，根据本发明一例的β-琼脂糖酶生产方法中，上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养温度优选为25℃～35℃，更优选为28℃～32℃。另外，考虑培养液或从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，根据本发明一例的β-琼脂糖酶的生产方法中，上述天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养搅拌速度优选为200～300rpm，更优选为210～270rpm。另外，考虑从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养时间优选为40～150小时，更优选为48～120小时。
另外，本发明的其他例提供β-琼脂糖酶的生产方法，其包括：(a)将上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株接种于作为碳源含有半乳糖(Galactose)的液体培养基，并通过培养来获得培养液的步骤；(b)通过离心上述培养基来获得上层液的步骤；(c)通过将硫酸铵添加到上述上层液中，使上层液中所包含的β-琼脂糖酶沉淀的步骤。考虑培养液或从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶的活性，根据本发明其他例的β-琼脂糖酶生产方法中，上述液体培养基内的半乳糖的浓度优选为0.5％(w/v)至4％(w/v)，并且，考虑培养液或从培养液回收的上层液的DagA酶活性时，更优选为1.0％(w/v)至2.5％(w/v)。另外，考虑培养液或从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，根据本发明的其他例的β-琼脂糖酶生产方法中，上述天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养温度优选为25℃～35℃，更优选为28℃～32℃。另外，考虑培养液或从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，根据本发明其他例的β-琼脂糖酶的生产方法中，上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养搅拌速度优选为200～300rpm，更优选为210～270rpm。另外，考虑从培养液回收的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，根据本发明其他例的β-琼脂糖酶的生产方法中，上述天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养时间优选为40～150小时，更优选为48～120小时。另外，考虑从培养液的上层液中进行提纯的产物的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性，根据本发明的其他例的β-琼脂糖酶生产方法中，优选地，添加上述硫酸铵使上层液的蛋白质饱和浓度达到45％至70％，考虑从培养液的上层液中提纯的产物的DagA酶的活性时，优选地，添加上述硫酸铵使上层液的蛋白质饱和浓度达到45％至55％。
为了解决上述目的，本发明一例提供新琼寡糖的制备方法，其包括：(a')准备天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液或上述培养液的上层液的步骤；及(b')将琼脂(agar)或琼脂糖(agarose)与存在于天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液或上述培养液的上层液中的β-琼脂糖酶(β-agarase)进行酶反应的步骤。优选地，根据本发明的一例的新琼寡糖制备方法中，上述培养液是将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株接种到作为碳源含有半乳糖(Galactose)的液体培养基中，并进行培养的方式来获得。另外，根据本发明的一例的新琼寡糖制备方法中，上述酶反应温度优选为30℃～45℃，更优选为35℃～42℃。
发明效果
如果利用根据本发明的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株，那么可以大量生产活性非常高的β-琼脂糖酶(β-agarase)。另外，根据本发明的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株几乎不表达DagBβ-琼脂糖酶或着表达几乎没有β-琼脂糖酶活性(特别是分解琼脂或琼脂糖(agarose)而转换成DP2(neoagarobiose)的活性)的DagB突变酶，因此没有必要额外地从培养液中将DagA酶进行分离提纯，并且，通过利用天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液或其上层液，可以从琼脂或者琼脂糖制备新琼四糖(neoagarotetraose)或新琼六糖(neoagarohexaose)的含量相对比新琼二糖(neoagarobiose)高的新琼寡糖。
附图说明
图1是示出天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的菌落形态(形态学)的图。图1中的下面一行是用染色试剂对菌落进行染色的结果。
图2是用薄层色谱法(thin layer c小时omatography,TLC)对培养天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株而获得的上层液试料、50％ASP试料(以将硫酸铵添加至上层液中使得蛋白质的饱和浓度达到50％的方式获得的酶试料)及70％ASP试料(以将硫酸铵添加至上层液中使得蛋白质的饱和浓度达到70％的方式获得的酶试料)的DagA酶活性进行分析的结果。
图3是将琼脂糖(agarose)与培养天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株而获得的70％ASP试料反应而进行分解后，用HPLC-ELSD对分解产物内的新琼脂糖组成进行分析的结果。
图4是示出通过将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的DagB基因碱基序列(上面一行(upper line))与天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的DagB基因碱基序列(下面一行(lower line))进行排列及比较的结果中的一部分。
图5是示出基于16S rRNA碱基序列进行制作的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的生物学系统(system)和亲缘关系。
图6是本发明中用于克隆DagB基因而使用的pUWL201pw载体的酶切图。
图7是按培养日示出在本发明实施例中制备的重组菌株WT dagB、重组菌株M22-2C43 dagB及重组菌株pUWL201pw的培养过程中获得的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性。
图8是用还原糖定量法对根据不同培养基内碳源种类的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液的β-琼脂糖酶活性进行测量的结果。
图9是在包含多种条件的碳源的培养基中，在28℃的温度条件和216rpm的振荡条件下对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株进行培养后，用还原糖定量法对β-琼脂糖酶活性进行测量的结果。
图10是在包含多种条件的碳源的培养基中，在30℃的温度条件和250rpm的振荡条件下对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株进行培养后，用还原糖定量法对β-琼脂糖酶活性进行测量的结果。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更加具体地说明。但是下述实施例仅仅是用于清楚地说明本发明的技术特征，而并不是用于限定本发明的保护范围。
1.酶活性测量方法
(1)测量试料的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性
通过利用还原糖定量法(二硝基水杨酸法(DNS method))测量了试料的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性。具体地，在试料10μL中将琼脂糖(agarose)以0.5％(w/v)的浓度进行溶解的20mM Tris-HCl溶液(pH为7)490μL进行混合，并在40℃条件下反应15分钟，然后将与反应液同等量的DNS试剂(通过将二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid)6.5g、2M NaOH325ml和丙三醇(glycerol)45ml溶解在1L蒸馏水中进行制备)加入到其中，并煮沸10分钟后进行冷却，并在540nm处测量了吸光度。将在540nm处吸光度为0.001的活性定义为β-琼脂糖酶(β-agarase)活性1U(单位，Unit)。
(2)评价试料的DagA酶活性
天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)菌株生产DagA酶和DagB酶作为β-琼脂糖酶(β-agarase)。据报道，DagA酶是通过分解琼脂或琼脂糖(agarose)来主要生成DP4(新琼四糖)和DP6(新琼六糖)，而DagB酶是通过分解琼脂或琼脂糖(agarose)来主要生成DP2(新琼二糖)。将琼脂糖(agarose)与试料中的酶进行反应而使其分解后，将分解产物通过薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)进行分析，并以定性的方式对分解产物中所含有的DP2(新琼二糖)、DP4(新琼四糖)和DP6(新琼六糖)的量进行比较，由此对试料的DagA酶活性进行评价。具体地，将试料的β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性调整为250U/ml，并在其中混合以0.5％(w/v)的浓度溶解β-琼脂糖酶(β-agarase)的20mM Tris-HCl(pH为7)溶液1ml，并在40℃条件下反应16小时。之后，将反应液煮沸10分钟后通过离心的方式回收上层液。之后，将上层液5μL滴到TLC硅胶60玻璃板(TLC silica gel 60 glass plate)，并且用展开溶剂(将丁醇、乙醇和灭菌蒸馏水分别以5:3:2(v/v)的方式进行混合的溶液)进行2次展开之后，将10％(v/v)硫酸溶液(基础溶剂为乙醇)薄薄的进行喷雾，并在110℃条件下反应15分钟。之后，在TLC板中对被展开的分解产物的形状进行了比较。另一方面，将DP2(新琼二糖)、DP4(新琼四糖)和DP6(新琼六糖)以30mg/ml的浓度进行混合的溶液用作标准物质溶液。将标准物质溶液0.5μL滴到TLC硅胶60玻璃板并利用相同的方法进行展开。
2.通过紫外线(UV)照射而诱导放线菌天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的突变以及对β-琼脂糖酶进行过表达的突变菌株的筛选
(1)天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的筛选
将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株在平板(plate)上的放线菌基础培养基(基础培养基(Minimal medium)；霍普伍德，1967)上静置培养5日，并且将20％(w/v)丙三醇溶液2ml在平板上铺板，然后收集孢子，用于紫外线照射诱导突变的实验。将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)孢子(spore)储备(stock)液1μL加入到陪替氏培养皿(petri dish)，并添加作为一般细菌营养培养基的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic soy broth)；以蒸馏水1L为基准包括胰蛋白胨(tryptone)17g、大豆蛋白胨(soytone)3g、葡萄糖2.5g、NaCl 5g、K2PO4 2.5g)培养基10ml，通过稀释而形成薄膜。之后，在阻隔周边照明的状态下，在约30cm高度利用30W强度的紫外线(UV)照射45分钟，然后收集培养液，在28℃的温度条件、180rpm的振荡条件及暗的条件下培养8小时。将培养液涂抹在平板(plate)上的MM琼脂培养基上，然后在暗的条件下，在28℃的培养箱中静置培养8日。之后，在所培养的平板(plate)中对存活的菌落(colony)进行计数，并利用染色试剂(刚果红(Congo red))进行染色。其中，初次筛选出了1581个具有较大透明圈(clearzone)大小的菌落。从初次筛选的菌落中，将1400个菌落(colony)个别地在涂覆有MM液体培养基[包含2％(w/v)浓度的琼脂糖(agarose)作为碳源]的玻璃纤维滤纸(glass filterpaper)上进行铺板，并且在28℃条件下静置培养5日，然后二次筛选出了313个形成孢子(spore)较多的菌株。将二次筛选的菌株接种于含有2％(w/v)浓度的琼脂寡糖(agarooligosaccharide)的RSM3(以蒸馏水1L为基准，包含MgCl2·7H2O 5g、酵母提取物11g、CaCO3 0.5g)液体培养基中，并在28℃的温度条件及180rpm的振荡条件下培养2.5日。之后，通过离心培养液来去除细胞碎片(cell debris)，并回收上层液。之后，利用还原糖定量法(DNS method)来测量提纯的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性。另外，作为亲本菌株的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株也通过相同的方法和条件进行培养后对提纯的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性进行了测量。将蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株与二次筛选的菌株的β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性进行比较，并且将其中β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性最高的突变菌株筛选为最终菌株，并将其命名为天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22。
(2)天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的保藏信息本发明的发明人于2016年06月17日将最终所筛选出的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株在作为国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔特别市西大门区弘济内2甲路45儒林大厦3F)进行了韩国专利保藏，其保藏编号为KFCC11668P。
3.通过紫外线照射而诱导天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的突变以及对DagAβ-琼脂糖酶进行过表达的突变菌株的筛选
(1)天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的筛选
在平板(plate)上的放线菌完全培养基(ISP4培养基)上，将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株(天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的突变菌株)静置培养5日，并且将20％(w/v)丙三醇溶液2ml在平板上进行铺板，然后收集孢子(spore)，用于紫外线照射诱导突变的实验。将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的孢子储备(spore stock)液1μL加入到陪替氏培养皿(Petri dish)，并添加作为一般细菌营养培养基的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤；以蒸馏水1L为基准包括胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、葡萄糖2.5g、NaCl 5g、K2PO4 2.5g)培养基5ml，并通过稀释而形成薄膜。之后，在阻隔周边照明的状态下，在距离约为35cm～50cm处利用30W～40W强度的紫外线(UV)照射24～60分钟，然后收集培养液，在28℃的温度条件、180rpm的振荡条件及暗的条件下培养8小时。将培养液涂抹在MM琼脂培养基上，然后在暗的条件下，在28℃的培养箱中静置培养5日。之后，在所培养的平板(plate)中对存活菌落(colony)进行计数，此时，死亡率为99.2％。利用染色试剂(卢戈氏碘液(Lugol’s Iodine))对这些透明圈(clear zone)进行了染色，并比较其大小之后，根据形态(morphology)筛选出不同的菌落的菌株，且在28℃条件下，在平板上的MM琼脂培养基上静置培养5日。之后，将筛选出的菌株接种到含有0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的液体培养基(以蒸馏水1L为基准，包含MgCl2·7H2O 5g、酵母提取物(yeast extract)11g、CaCO3 0.5g)中，并在28℃的温度条件及216rpm的振荡条件下振荡培养2.5日。之后，通过对培养液进行离心来去除细胞碎片(cell debris)，并回收上层液。之后，通过用0.45μm注射器过滤器(syringe filter)对上层液进行除菌及过滤而获得提纯的上层液。之后，对所提纯的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性及DagA酶活性进行了测量。将β-琼脂糖酶(β-agarase)活性及DagA酶活性最高的突变菌株筛选为最终菌株，并将其命名为天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43。
(2)天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的保藏信息
本发明的发明人于2017年09月22日将最终所筛选出的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株在作为国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(地址：韩国首尔特别市西大门区弘济内2甲路45儒林大厦3F)进行了韩国专利保藏，其保藏号为KFCC11742P。另外，本发明的发明人于2019年08月23日请求将上述韩国专利保藏的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株(保藏编号：KFCC11742P)转换为根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的国际专利保藏，其被赋予了保藏编号KCCM12577P。
4.天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的比较
(1)比较各菌株的菌落形态(形态学)
图1是示出天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的菌落形态(形态学)的图。图1中的下面一行的图是用染色试剂对菌落(colony)进行染色的结果。
(2)各菌株的培养及含有β-琼脂糖酶(β-agarase)的酶试料的制备
将菌株分别接种于0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的液体培养基(以蒸馏水1L为基准，包含MgCl2·7H2O 5g、酵母提取物11g、CaCO3 0.5g)1000ml中，并且在28℃的温度条件及216rpm振荡条件下振荡培养2.5日。之后，通过对培养液进行离心来去除细胞碎片(celldebris)，并回收上层液。将回收的上层液用作试料来测量β-琼脂糖酶(β-agarase)的活性，并评价了DagA酶的活性。之后，通过用0.45μm注射器过滤器对上层液进行除菌及过滤而获得提纯的上层液。之后，将硫酸铵添加到所提纯的上层液中，使得上层液中所包含的蛋白质的饱和浓度分别达到50％和70％，并通过作为盐析法的一种的硫酸铵沉淀法(ammoniumsulfate precipitation，ASP)来使β-琼脂糖酶(β-agarase)沉淀，之后通过离心分离来获得了团块(pellet)形式的提纯的β-琼脂糖酶(β-agarase)。根据有关天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的专利申请(韩国公开专利公报第10-2018-0019881号，2018.02.27)的说明书中所记载的内容可以间接的确认，当添加有硫酸铵的上层液的蛋白质饱和浓度为50％时，主要使DagA酶沉淀，并且当添加有硫酸铵的上层液的蛋白质饱和浓度为70％时使DagA酶和DagB酶都会沉淀。将团块形态的提纯的β-琼脂糖酶(β-agarase)在5ml的蒸馏水中溶解后，将其用作试料对β-琼脂糖酶(β-agarase)活性进行了测量，并对DagA酶活性进行了评价。
(3)从各菌株所获得酶试料的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性比较
下述表1是示出了测量通过天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养而获得的上层液试料、50％ASP试料(以将硫酸铵添加至上层液中使得蛋白质的饱和浓度达到50％的方式获得的酶试料)及70％ASP试料(以将硫酸铵添加至上层液中使得蛋白质的饱和浓度达到70％的方式获得的酶试料)的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性的结果。β-琼脂糖酶(β-agarase)活性的单位是U/ml。
[表1]
如上述表1所示，对于预测为主要由DagA酶组成的50％ASP试料而言，从天蓝色链霉菌A3(2)_M22-2C43菌株的培养液中回收的50％ASP试料中显示出了最高的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性。
(4)图2是用薄层色谱法(thin layer chomatography,TLC)对通过天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养而获得的上层液试料、50％ASP试料(以将硫酸铵添加至上层液中使得蛋白质的饱和浓度达到50％的方式获得的酶试料)及70％ASP试料(以将硫酸铵添加至上层液中使得蛋白质的饱和浓度达到70％的方式获得的酶试料)的DagA酶活性进行分析的结果。图2中“M”代表标准物质溶液，并且泳道“1”、“4”及“7”都是从天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的培养液中获得的酶试料，并且泳道“2”、“5”及“9”都是天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的培养液中获得的试料，泳道“3”、“6”及“9”都是从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养基中获得的试料。另外，泳道“1”、“2”及“3”都是上层液试料，泳道“4”、“5”及“6”都是70％ASP试料，泳道“7”、“8”及“9”都是50％ASP试料。
如图2所示，从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液中获得的所有酶试料以与分离提纯的程度无关的方式分解琼脂糖(agarose)而主要生成了DP4(新琼四糖)和DP6(新琼六糖)。相反，从天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22菌株的培养液中获得的上层液试料和70％ASP试料分解琼脂糖(agarose)而主要生成DP2(新琼二糖)。
图3是将琼脂糖(agarose)与通过培养天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株而获得的70％ASP试料反应而进行分解后，用HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发光散射检测器)对分解产物内的新琼脂糖的组成进行分析的结果。琼脂糖(agarose)分解反应条件与DagA酶活性评价中使用的条件相同，并且琼脂糖分解反应在相同的条件下总共重复了4次。当通过HPLC-ELSD对分解产物内的新琼脂糖的组成进行分析时，作为柱子使用了NH2 P-50 4E多模式柱(NH2 P-50 4E multimode column)(250mm×4.6mm)，且作为流动相使用了乙腈(acetonitrile)与水的混合溶液(乙腈：水的混合重量比为65:35)。如图3所示，琼脂糖(agarose)分解产物内DP4(新琼四糖)的含量是DP2(新琼二糖)的5倍～5.5倍，以及DP6(新琼六糖)的含量是DP2(新琼二糖)含量的3倍～3.5倍。
(5)各菌株的β-琼脂糖酶(β-agarase)基因信息
利用PCR反应对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的DagA基因和DagB基因进行了扩增，并对扩增的PCR产物的DNA碱基序列进行了分析。天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22菌株的DagB基因均表现为与SEQ ID NO.1相同的碱基序列。相反，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的DagB基因则通过替换方式的基因突变而发生了修饰，并表现为SEQ ID NO.2的碱基序列。图4是示出通过将天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的DagB基因碱基序列(上面一行(upper line))与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的DagB基因碱基序列(下面一行(lower line))进行排列而进行比较的结果中的一部分。另一方面，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的DagA基因均变现出具有与SEQ ID NO.3相同的碱基序列。因此，预测天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22菌株及天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株均能对具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的DagA酶进行表达。另外，预测天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22菌株能对具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的正常DagB酶进行表达。与此不同地，预测天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株不对正常DagB酶进行表达，或者能对具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列、且几乎没有β-琼脂糖酶(β-agarase)活性的DagB突变酶进行表达。
(6)蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的系统和亲缘关系
通过菌落(colony)PCR对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的16S rRNA碱基序列和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的16S rRNA碱基序列进行了分析。图5是示出基于16S rRNA碱基序列进行制作的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的生物学系统和亲缘关系。
(7)根据DagB基因的表达水平比较
将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的DagB基因克隆到具有图6的酶切图的pUWL201pw载体来制备重组载体，并且利用上述重组载体对不具有β-琼脂糖酶(β-agarase)基因的变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24菌株进行转化来制备重组菌株WT DagB。并且，通过将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的DagB基因克隆到pUWL201pw载体来制备重组载体，并且利用上述重组载体对变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24菌株进行转化来制备重组菌株M22-2C43 dagB。另外，利用pUWL201pw载体对变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24菌株进行转化来制备重组菌株pUWL201pw。之后，对3个重组菌株进行培养，并且在培养第一日、第二日及第三日回收培养液并获得上层液。之后，利用还原糖定量法(DNS method)测量了上层液试料的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性。图7是根据不同培养日来示出在本发明实施例中制备的重组菌株WT dagB、重组菌株M22-2C43 dagB及重组菌株pUWL201pw的培养过程中获得的上层液的β-琼脂糖酶(β-agarase)活性。如图7所示，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)野生型(WT)菌株的DagB基因以具有β-琼脂糖酶(β-agarase)活性的正常DagB酶的形式以较高的水平来表达，相反，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的发生修饰的DagB基因以不表达正常的DagB酶或者表达几乎没有β-琼脂糖酶(β-agarase)活性的DagB突变酶的方式实现表达。
5.为天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的β-琼脂糖酶(β-agarase)建立最适培养条件
(1)培养基内碳源种类及含量
在作为碳源包含1.5重量％浓度的琼脂的放线菌琼脂培养基上，将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株培养4日。之后，在包含选自1.5％(w/v)浓度的半乳糖(Galactose)、2％(w/v)浓度的琥珀酸(succinic acid)、1.5％(w/v)浓度的葡萄糖(Glucose)、0.2％(w/v)浓度的琼脂(agar)及0.5％(w/v)浓度的琼脂(agar)中的一个作为碳源的RSM3液体培养基50ml中，接种3个1cm×1cm大小的菌株菌落，并在28℃的温度条件和216rpm的振荡条件下培养2.5日。之后，从培养液回收上层液，并测量了上层液中所含有的β-琼脂糖酶活性。
图8是用还原糖定量法对根据不同的培养基内碳源种类的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株的培养液的β-琼脂糖酶活性进行测量的结果。图8中Y轴表示β-琼脂糖酶活性，X轴表示培养时间。下述表2示出的是当对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株进行96小时培养时，根据不同的培养基内碳源种类的培养液的β-琼脂糖酶活性。
[表2]
如图8及上述表2所示，从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株中能最适地生产β-琼脂糖酶的培养基内的碳源是半乳糖，并确认其浓度为1.5％(w/v)。
(2)培养温度及培养搅拌速度(rpm)
分别在包含1％(w/v)浓度的半乳糖(galactose)和0.5％(w/v)浓度的琼脂(agar)作为碳源的RSM3液体培养基50ml、包含1.5％(w/v)浓度的半乳糖(Galactose)和0.5％(w/v)浓度的琼脂(agar)作为碳源的RSM3液体培养基50ml及包含0.5％(w/v)浓度的琼脂(agar)作为碳源的液体培养基50ml中，接种3个1cm×1cm大小的菌株菌落，并在28℃的温度条件和216rpm的振荡条件或30℃的温度条件和250rpm的振荡条件下培养2.5日。之后，从培养液中回收上层液，并测量上层液中所含有的β-琼脂糖酶活性。
图9是在包含多种条件的碳源的培养基中，将天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株在28℃的温度条件和216rpm的振荡条件下进行培养时，用还原糖定量法对β-琼脂糖酶活性进行测量的结果。图10是在包含多种条件的碳源的培养基中，将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株在30℃的温度条件和250rpm的振荡条件下进行培养时，用还原糖定量法对β-琼脂糖酶活性进行测量的结果。图9和图10中Y轴表示β-琼脂糖酶活性，X轴表示培养时间。如图9及图10所示，当对天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22-2C43菌株进行培养时，用于最适地生产β-琼脂糖酶的培养条件确认为是30℃的温度及250rpm的振荡(搅拌速度)。
如上所述，虽然通过上述的实施例来对本发明进行了描述，但是本发明并不仅限于此。当然，在不脱离本发明的范畴和思想的范围内可以进行多种变形。因此，本发明的保护范围应解释为包含本发明所附权利要求的范围内的所有实施方式。
[保藏编号]
保藏机构名：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KFCC11668P
登记日期：2016.06.17
[保藏编号]
保藏机构名：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KFCC11742P
登记日期：2017.09.22
[保藏编号]
保藏机构名：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KCCM12577P
转换日期：2019.08.23
微生物保藏证
2016年6月17日
致：李济贤
2016年6月17日以第16-19号，对发明人申请保藏的微生物进行受理，特此通知如下微生物保藏编号。
-如下-
1.微生物名称：天蓝色链霉菌A3(2)_M22
2.微生物保藏编号：KFCC11668P
韩国微生物保藏中心
微生物保藏证
2017年9月22日
致：达因比奥有限公司
2017年9月22日以第17-26号，对贵公司申请保藏的微生物进行受理，特此通知如下微生物保藏编号。
-如下-
1.微生物名称：天蓝色链霉菌A3(2)_M22-2C43
2.微生物保藏编号：KFCC11742P
韩国微生物保藏中心
用于专利申请的布达佩斯条约下的微生物保藏证明
国际模板
由国际保藏机构依据规定7.1发出的对原始保藏的证明
致：达因比奥有限公司
韩国京畿道城南市中原区瓷器莫古路45号14(13209)
1通过适用规则6.4(d)来获得国际保藏机关的法律地位的日期。
<110> 达因比奥有限公司
DyneBio Inc.
<120> 天蓝色链霉菌突变菌株，利用其的β-琼脂糖酶生产方法及利用其的新琼寡糖制备方法
Mutant strain of Streptomyces coelicolor, method for producing
beta-agarase using the same and method for manufacturing
neoagarooligosaccharide using the same
<130> ZPCT-19-0108
<150> KR 10-2018-0112517
<151> 2018-09-19
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 2397
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 源自天蓝色链霉菌A3(2)的DagB基因
<400> 1
atgaccgtgc acaagcgcgc ttgcaccact ccgccgccgc gagccagcag gtcgttccgc 60
gtgaggtggc ctgtcctgat agcggccgcc tgcgccgggt tagtcctggc gaccaccagc 120
cctccggccg tcgcggccgg cgctcatgac ctcggcgacg agaccatgct ctacgacttc 180
caggacggcc tggtaccggc cgaggtcggc ccgtaccagg cgaagacgac aatcgtcggt 240
cgcggcgaca agaagctccg ggtcgatttc caggcccgga agaactacta ctcctcgttc 300
tccgtacgcc ccgagcccgt gtggaactgg tcggcggagg agtccgagtc gctcggcatc 360
gcgatggagc tcacgaaccc gagcgaccgc tccgtccagc tcacgatcga tctggagagc 420
tcgaccggcg tcgccacccg cagtgtcaac gtcccggccg gcggcggtgg cacgtactac 480
ttcgacgtcg acagccccgc gctccaccgc gacaccgggc tgcgcgccga tccgtcctgg 540
ctcgcggaca aggacgtcac ctctgcggtc tggatgtggg gctccaagga gacggacacg 600
agccgcatca gccagctgaa cttctacgtc gccggcctgc tgcacgaccg gtcggtcatc 660
gtggacgaca tccgcgtcgt ccgtgacgcg ccggcagacc ccgattacct caagggcctg 720
gtcgacgcct tcggtcagaa caacaaggtc gactacaagg gaaaggtctc caggacgtcg 780
gagattcttc ggcagcgcgc tgccgaagcc aaggaccttc gcaggcatcc ggttccggag 840
gaccggtcca ggtacggcgg ctggctgaac ggtccacgac tcgaggcgac gggcaacttc 900
cgcgtggaga agtaccaggg gcggtggacc ctggtggacc ctgacggcta cctgttcttc 960
tcaaccggca tcgacaacgc ccgcatgttc gactccccaa ccacgacggg ttacgacttc 1020
gaccatgacg cgatccagga gctgccgccc cccagcctga cggccggcgg ccccgaggac 1080
ctcaaccgcg tccagaagtc ggcgctgccg acccgcacga agatgtccga aacccgcgcc 1140
gacctcttca gcaagttgcc caagtaccgc acccgcgcgg gcgagggctt cggttacgcc 1200
cccgacaccc tggccggtcc cgtcgcgcag ggcgagacct acagcttcta caaggcgaac 1260
gtcgcccgga agtaccccgg cagcaactac atggagcggt ggcgggacaa cacggtcgac 1320
cggatgctca gctggggctt cacctccttc ggcaactgga ccgacccgga gatgtacgac 1380
aacgaccgta tcccgtactt cgcccacggc tggatcaagg gcgacttcaa gacggtgagc 1440
accggccagg actactgggg cccgatgccg gacccgttcg accccgcgtt ctccgacgcc 1500
gcagccagaa ccgcgcgagc agtcgccgac gaggtcgcgg acagcccgtt ggcgatcggc 1560
gtattcatgg acaacgaact gagctggggc aacgccggca gtttcagcac ccgttacggc 1620
gtcgtcatcg acaccatgtc acgtgacgcg gcagagagcc ccaccaagtc ggcgttctcc 1680
gacgaactgg aggagaagta cgggaccatc gacgctctca acgccgcgtg gcagacgaca 1740
gttccgtcat gggaggcact ccgtagcggc agtgccgacc tcggctccga cgagaccgcg 1800
aaggagtccg actactccgc gctcatgacg ctctacgcca ctcagtactt caagacggtc 1860
gacgccgagc tcgacaaggt catgccggac catctctacg cgggttcgag gttcgccagc 1920
tggggccgca caccggaggt cgtcgaggca gcgagcaagt acgtcgacat catgagctac 1980
aacgagtacc gcgagggact gcacccgagc gagtgggcgt ttctcgaaga gctcgacaag 2040
cccagcctca tcggtgagtt ccacatggga acgaccacta ccgggcagcc gcatccgggt 2100
ctcgtctcgg cgggaacgca ggccgagcgg gcacggatgt acgccgagta catggaacag 2160
ctcatcgaca acccgtacat ggtgggcggc cactggttcc agtatgccga ctcgcccgtg 2220
actggcagag cactcgacgg ggagaactac aacattggct tcgtctccgt cacggaccgt 2280
ccctacccgg agatcgtcgc cgctgcccgc gacgtgaacc agcgtctcta tgaccgccga 2340
tacggcaacc tggccacggc cgagggacat tacaccggtc ggcgttcagc ggagtag 2397
<210> 2
<211> 2397
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 源自天蓝色链霉菌A3(2)_M22-2C43的DagB基因
<400> 2
atgaccgtgc acaagcgcgc ttgcaccact ccgccgccgc gagccagcag gtcgttccgc 60
gtgaggtggc ctgtcctgat agcggccgcc tgcgccgggt tagtcctggc gaccaccagc 120
cctccggccg tcgcggccgg cgctcatgac ctcggcgacg agaccatgct ctacgacttc 180
caggacggcc tggtaccggc cgaggtcggc ccgtaccagg cgaagacgac aatcgtcggt 240
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tccgtacgcc ccgagcccgt gtggaactgg tcggcggagg agtccgagtc gctcggcatc 360
gcgatggagc tcacgaaccc gagcgaccgc tccgtccagc tcacgatcga tctggagagc 420
tcgaccggcg tcgccacccg cagtgtcaac gtcccggccg gcggcggtgg cacgtactac 480
ttcgacgtcg acagccccgc gctccaccgc gacaccgggc tgcgcgccga tccgtcctgg 540
ctcgcggaca aggacgtcac ctctgcggtc tggatgtggg gctccaagga gacggacacg 600
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gtggacgaca tccgcgtcgt ccgtgacgcg ccggcagacc ccgattacct caagggcctg 720
gtcgacgcct tcggtcagaa caacaaggtc gactacaagg gaaaggtctc caggacgtcg 780
gagattcttc ggcagcgcgc tgccgaagcc aaggaccttc gcaggcatcc ggttccggag 840
gaccggtcca ggtacggcgg ctggctgaac ggtccacgac tcgaggcgac gggcaacttc 900
cgcgtggaga agtaccaggg gcggtggacc ctggtggacc ctgacggcta cctgttcttc 960
tcaaccggca tcgacaacgc ccgcatgttc gactccccaa ccacgacggg ttacgacttc 1020
gaccatgacg cgatccagga gctgccgccc cccagcctga cggccggcgg ccccgaggac 1080
ctcaaccgcg tccagaagtc ggcgctgccg acccgcacga agatgtccga aacccgcgcc 1140
gacctcttca gcaagttgcc caagtaccgc acccgcgcgg gcgagggctt cggttacgcc 1200
cccgacaccc tggccggtcc cgtcgcgcag ggcgagacct acagcttcta caaggcgaac 1260
gtcgcccgga agtaccccgg cagcaactac atggagcggt ggcgggacaa cacggtcgac 1320
cggatgctca gctggggctt cacctccttc ggcaactgga ccgacccgga gatgtacgac 1380
aacgaccgta tcccgtactt cgcccacggc tggatcaagc gcgacttcaa gacggtgagc 1440
accggccagg actactgggg cccgatgccg gacccgttcg accccgcgtt ctccgacgcc 1500
gcagccagaa ccgcgcgagc agtcgccgac gaggtcgcgg acagcccgtt ggcgatcggc 1560
gtattcatgg acaacgaact gagctggggc aacgccggca gtttcagcac ccgttacggc 1620
gtcgtcatcg acaccatgtc acgtgacgcg gcagagagcc ccaccaagtc ggcgttctcc 1680
gacgaactgg aggagaagta cgggaccatc gacgctctca acgccgcgtg gcagacgaca 1740
gttccgtcat gggaggcact ccgtagcggc agtgccgacc tcggctccga cgagaccgcg 1800
aaggagtccg actactccgc gctcatgacg ctctacgcca ctcagtactt caagacggtc 1860
gacgccgagc tcgacaaggt catgccggac catctctacg cgggttcgag gttcgccagc 1920
tggggccgca caccggaggt cgtcgaggca gcgagcaagt acgtcgacat catgagctac 1980
aacgagtacc gcgagggact gcacccgagc gagtgggcgt ttctcgaaga gctcgacaag 2040
cccagcctca tcggtgagtt ccacatggga acgaccacta ccgggcagcc gcatccgggt 2100
ctcgtctcgg cgggaacgca ggccgagcgg gcacggatgt acgccgagta catggaacag 2160
ctcatcgaca acccgtacat ggtgggcggc cactggttcc agtatgccga ctcgcccgtg 2220
actggcagag cactcgacgg ggagaactac aacattggct tcgtctccgt cacggaccgt 2280
ccctacccgg agatcgtcgc cgctgcccgc gacgtgaacc agcgtctcta tgaccgccga 2340
tacggcaacc tggccacggc cgagggacat tacaccggtc ggcgttcagc ggagtag 2397
<210> 3
<211> 930
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 源自天蓝色链霉菌A3(2)的DagA基因
<400> 3
gtggtcaacc gacgtgatct catcaagtgg agtgccgtcg cactcggagc gggtgcgggg 60
ctcgcgggtc ccgcacccgc cgctcatgcc gcagacctcg aatgggaaca gtaccccgtg 120
ccggccgccc ctggcggaaa caggtcctgg cagcttctcc ccagccattc ggacgacttc 180
aactacaccg gcaagcctca aaccttcagg ggcagatggc tggaccagca caaggatggc 240
tggtcgggcc cggccaacag cctctacagt gcgcgccatt cctgggtggc tgacggaaat 300
ctcatcgtcg agggccgcag ggcgccggac gggagggtct actgcggcta cgtgacctcc 360
cgcaccccag tcgagtaccc tctctatacc gaagtactca tgcgtgtgag cgggctgaag 420
ctctcatcga atttctggct cctgagcaga gacgacgtca acgagattga cgtgatcgaa 480
tgctacggca acgagtcatt gcacggaaag cacatgaaca ccgcctacca catattccag 540
cggaacccct tcactgaact ggcgagaagc cagaaggggt atttcgcaga tgggagctac 600
gggtacaatg gtgagactgg gcaggtgttt ggggacggcg ccgggcaacc tcttcttcgg 660
aatggattcc accgctacgg cgtgcactgg ataagcgcca ccgaattcga tttctacttc 720
aacggcaggt tggtgcgccg gctgaaccgg tcgaacgacc tcagggaccc ccggagccgg 780
ttcttcgacc agccaatgca tctgatcctc aacaccgaga gtcatcagtg gcgcgtcgac 840
cgaggtatcg aacccacgga cgcggaactc gcagacccca gcatcaacaa catctactac 900
cgctgggtca ggacgtatca ggccgtgtag 930
<210> 4
<211> 309
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 源自天蓝色链霉菌A3(2)的DagA
<400> 4
Met Val Asn Arg Arg Asp Leu Ile Lys Trp Ser Ala Val Ala Leu Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Leu Ala Gly Pro Ala Pro Ala Ala His Ala Ala Asp
20 25 30
Leu Glu Trp Glu Gln Tyr Pro Val Pro Ala Ala Pro Gly Gly Asn Arg
35 40 45
Ser Trp Gln Leu Leu Pro Ser His Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Thr Gly
50 55 60
Lys Pro Gln Thr Phe Arg Gly Arg Trp Leu Asp Gln His Lys Asp Gly
65 70 75 80
Trp Ser Gly Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Ser Ala Arg His Ser Trp Val
85 90 95
Ala Asp Gly Asn Leu Ile Val Glu Gly Arg Arg Ala Pro Asp Gly Arg
100 105 110
Val Tyr Cys Gly Tyr Val Thr Ser Arg Thr Pro Val Glu Tyr Pro Leu
115 120 125
Tyr Thr Glu Val Leu Met Arg Val Ser Gly Leu Lys Leu Ser Ser Asn
130 135 140
Phe Trp Leu Leu Ser Arg Asp Asp Val Asn Glu Ile Asp Val Ile Glu
145 150 155 160
Cys Tyr Gly Asn Glu Ser Leu His Gly Lys His Met Asn Thr Ala Tyr
165 170 175
His Ile Phe Gln Arg Asn Pro Phe Thr Glu Leu Ala Arg Ser Gln Lys
180 185 190
Gly Tyr Phe Ala Asp Gly Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Glu Thr Gly Gln
195 200 205
Val Phe Gly Asp Gly Ala Gly Gln Pro Leu Leu Arg Asn Gly Phe His
210 215 220
Arg Tyr Gly Val His Trp Ile Ser Ala Thr Glu Phe Asp Phe Tyr Phe
225 230 235 240
Asn Gly Arg Leu Val Arg Arg Leu Asn Arg Ser Asn Asp Leu Arg Asp
245 250 255
Pro Arg Ser Arg Phe Phe Asp Gln Pro Met His Leu Ile Leu Asn Thr
260 265 270
Glu Ser His Gln Trp Arg Val Asp Arg Gly Ile Glu Pro Thr Asp Ala
275 280 285
Glu Leu Ala Asp Pro Ser Ile Asn Asn Ile Tyr Tyr Arg Trp Val Arg
290 295 300
Thr Tyr Gln Ala Val
305
<210> 5
<211> 798
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 源自天蓝色链霉菌A3(2)的DagB
<400> 5
Met Thr Val His Lys Arg Ala Cys Thr Thr Pro Pro Pro Arg Ala Ser
1 5 10 15
Arg Ser Phe Arg Val Arg Trp Pro Val Leu Ile Ala Ala Ala Cys Ala
20 25 30
Gly Leu Val Leu Ala Thr Thr Ser Pro Pro Ala Val Ala Ala Gly Ala
35 40 45
His Asp Leu Gly Asp Glu Thr Met Leu Tyr Asp Phe Gln Asp Gly Leu
50 55 60
Val Pro Ala Glu Val Gly Pro Tyr Gln Ala Lys Thr Thr Ile Val Gly
65 70 75 80
Arg Gly Asp Lys Lys Leu Arg Val Asp Phe Gln Ala Arg Lys Asn Tyr
85 90 95
Tyr Ser Ser Phe Ser Val Arg Pro Glu Pro Val Trp Asn Trp Ser Ala
100 105 110
Glu Glu Ser Glu Ser Leu Gly Ile Ala Met Glu Leu Thr Asn Pro Ser
115 120 125
Asp Arg Ser Val Gln Leu Thr Ile Asp Leu Glu Ser Ser Thr Gly Val
130 135 140
Ala Thr Arg Ser Val Asn Val Pro Ala Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Phe Asp Val Asp Ser Pro Ala Leu His Arg Asp Thr Gly Leu Arg Ala
165 170 175
Asp Pro Ser Trp Leu Ala Asp Lys Asp Val Thr Ser Ala Val Trp Met
180 185 190
Trp Gly Ser Lys Glu Thr Asp Thr Ser Arg Ile Ser Gln Leu Asn Phe
195 200 205
Tyr Val Ala Gly Leu Leu His Asp Arg Ser Val Ile Val Asp Asp Ile
210 215 220
Arg Val Val Arg Asp Ala Pro Ala Asp Pro Asp Tyr Leu Lys Gly Leu
225 230 235 240
Val Asp Ala Phe Gly Gln Asn Asn Lys Val Asp Tyr Lys Gly Lys Val
245 250 255
Ser Arg Thr Ser Glu Ile Leu Arg Gln Arg Ala Ala Glu Ala Lys Asp
260 265 270
Leu Arg Arg His Pro Val Pro Glu Asp Arg Ser Arg Tyr Gly Gly Trp
275 280 285
Leu Asn Gly Pro Arg Leu Glu Ala Thr Gly Asn Phe Arg Val Glu Lys
290 295 300
Tyr Gln Gly Arg Trp Thr Leu Val Asp Pro Asp Gly Tyr Leu Phe Phe
305 310 315 320
Ser Thr Gly Ile Asp Asn Ala Arg Met Phe Asp Ser Pro Thr Thr Thr
325 330 335
Gly Tyr Asp Phe Asp His Asp Ala Ile Gln Glu Leu Pro Pro Pro Ser
340 345 350
Leu Thr Ala Gly Gly Pro Glu Asp Leu Asn Arg Val Gln Lys Ser Ala
355 360 365
Leu Pro Thr Arg Thr Lys Met Ser Glu Thr Arg Ala Asp Leu Phe Ser
370 375 380
Lys Leu Pro Lys Tyr Arg Thr Arg Ala Gly Glu Gly Phe Gly Tyr Ala
385 390 395 400
Pro Asp Thr Leu Ala Gly Pro Val Ala Gln Gly Glu Thr Tyr Ser Phe
405 410 415
Tyr Lys Ala Asn Val Ala Arg Lys Tyr Pro Gly Ser Asn Tyr Met Glu
420 425 430
Arg Trp Arg Asp Asn Thr Val Asp Arg Met Leu Ser Trp Gly Phe Thr
435 440 445
Ser Phe Gly Asn Trp Thr Asp Pro Glu Met Tyr Asp Asn Asp Arg Ile
450 455 460
Pro Tyr Phe Ala His Gly Trp Ile Lys Gly Asp Phe Lys Thr Val Ser
465 470 475 480
Thr Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Pro Met Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ala
485 490 495
Phe Ser Asp Ala Ala Ala Arg Thr Ala Arg Ala Val Ala Asp Glu Val
500 505 510
Ala Asp Ser Pro Leu Ala Ile Gly Val Phe Met Asp Asn Glu Leu Ser
515 520 525
Trp Gly Asn Ala Gly Ser Phe Ser Thr Arg Tyr Gly Val Val Ile Asp
530 535 540
Thr Met Ser Arg Asp Ala Ala Glu Ser Pro Thr Lys Ser Ala Phe Ser
545 550 555 560
Asp Glu Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Leu Asn Ala Ala
565 570 575
Trp Gln Thr Thr Val Pro Ser Trp Glu Ala Leu Arg Ser Gly Ser Ala
580 585 590
Asp Leu Gly Ser Asp Glu Thr Ala Lys Glu Ser Asp Tyr Ser Ala Leu
595 600 605
Met Thr Leu Tyr Ala Thr Gln Tyr Phe Lys Thr Val Asp Ala Glu Leu
610 615 620
Asp Lys Val Met Pro Asp His Leu Tyr Ala Gly Ser Arg Phe Ala Ser
625 630 635 640
Trp Gly Arg Thr Pro Glu Val Val Glu Ala Ala Ser Lys Tyr Val Asp
645 650 655
Ile Met Ser Tyr Asn Glu Tyr Arg Glu Gly Leu His Pro Ser Glu Trp
660 665 670
Ala Phe Leu Glu Glu Leu Asp Lys Pro Ser Leu Ile Gly Glu Phe His
675 680 685
Met Gly Thr Thr Thr Thr Gly Gln Pro His Pro Gly Leu Val Ser Ala
690 695 700
Gly Thr Gln Ala Glu Arg Ala Arg Met Tyr Ala Glu Tyr Met Glu Gln
705 710 715 720
Leu Ile Asp Asn Pro Tyr Met Val Gly Gly His Trp Phe Gln Tyr Ala
725 730 735
Asp Ser Pro Val Thr Gly Arg Ala Leu Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Ile
740 745 750
Gly Phe Val Ser Val Thr Asp Arg Pro Tyr Pro Glu Ile Val Ala Ala
755 760 765
Ala Arg Asp Val Asn Gln Arg Leu Tyr Asp Arg Arg Tyr Gly Asn Leu
770 775 780
Ala Thr Ala Glu Gly His Tyr Thr Gly Arg Arg Ser Ala Glu
785 790 795
<210> 6
<211> 798
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 源自天蓝色链霉菌A3(2)_M22-2C43的DagB
<400> 6
Met Thr Val His Lys Arg Ala Cys Thr Thr Pro Pro Pro Arg Ala Ser
1 5 10 15
Arg Ser Phe Arg Val Arg Trp Pro Val Leu Ile Ala Ala Ala Cys Ala
20 25 30
Gly Leu Val Leu Ala Thr Thr Ser Pro Pro Ala Val Ala Ala Gly Ala
35 40 45
His Asp Leu Gly Asp Glu Thr Met Leu Tyr Asp Phe Gln Asp Gly Leu
50 55 60
Val Pro Ala Glu Val Gly Pro Tyr Gln Ala Lys Thr Thr Ile Val Gly
65 70 75 80
Arg Gly Asp Lys Lys Leu Arg Val Asp Phe Gln Ala Arg Lys Asn Tyr
85 90 95
Tyr Ser Ser Phe Ser Val Arg Pro Glu Pro Val Trp Asn Trp Ser Ala
100 105 110
Glu Glu Ser Glu Ser Leu Gly Ile Ala Met Glu Leu Thr Asn Pro Ser
115 120 125
Asp Arg Ser Val Gln Leu Thr Ile Asp Leu Glu Ser Ser Thr Gly Val
130 135 140
Ala Thr Arg Ser Val Asn Val Pro Ala Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Phe Asp Val Asp Ser Pro Ala Leu His Arg Asp Thr Gly Leu Arg Ala
165 170 175
Asp Pro Ser Trp Leu Ala Asp Lys Asp Val Thr Ser Ala Val Trp Met
180 185 190
Trp Gly Ser Lys Glu Thr Asp Thr Ser Arg Ile Ser Gln Leu Asn Phe
195 200 205
Tyr Val Ala Gly Leu Leu His Asp Arg Ser Val Ile Val Asp Asp Ile
210 215 220
Arg Val Val Arg Asp Ala Pro Ala Asp Pro Asp Tyr Leu Lys Gly Leu
225 230 235 240
Val Asp Ala Phe Gly Gln Asn Asn Lys Val Asp Tyr Lys Gly Lys Val
245 250 255
Ser Arg Thr Ser Glu Ile Leu Arg Gln Arg Ala Ala Glu Ala Lys Asp
260 265 270
Leu Arg Arg His Pro Val Pro Glu Asp Arg Ser Arg Tyr Gly Gly Trp
275 280 285
Leu Asn Gly Pro Arg Leu Glu Ala Thr Gly Asn Phe Arg Val Glu Lys
290 295 300
Tyr Gln Gly Arg Trp Thr Leu Val Asp Pro Asp Gly Tyr Leu Phe Phe
305 310 315 320
Ser Thr Gly Ile Asp Asn Ala Arg Met Phe Asp Ser Pro Thr Thr Thr
325 330 335
Gly Tyr Asp Phe Asp His Asp Ala Ile Gln Glu Leu Pro Pro Pro Ser
340 345 350
Leu Thr Ala Gly Gly Pro Glu Asp Leu Asn Arg Val Gln Lys Ser Ala
355 360 365
Leu Pro Thr Arg Thr Lys Met Ser Glu Thr Arg Ala Asp Leu Phe Ser
370 375 380
Lys Leu Pro Lys Tyr Arg Thr Arg Ala Gly Glu Gly Phe Gly Tyr Ala
385 390 395 400
Pro Asp Thr Leu Ala Gly Pro Val Ala Gln Gly Glu Thr Tyr Ser Phe
405 410 415
Tyr Lys Ala Asn Val Ala Arg Lys Tyr Pro Gly Ser Asn Tyr Met Glu
420 425 430
Arg Trp Arg Asp Asn Thr Val Asp Arg Met Leu Ser Trp Gly Phe Thr
435 440 445
Ser Phe Gly Asn Trp Thr Asp Pro Glu Met Tyr Asp Asn Asp Arg Ile
450 455 460
Pro Tyr Phe Ala His Gly Trp Ile Lys Arg Asp Phe Lys Thr Val Ser
465 470 475 480
Thr Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Pro Met Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ala
485 490 495
Phe Ser Asp Ala Ala Ala Arg Thr Ala Arg Ala Val Ala Asp Glu Val
500 505 510
Ala Asp Ser Pro Leu Ala Ile Gly Val Phe Met Asp Asn Glu Leu Ser
515 520 525
Trp Gly Asn Ala Gly Ser Phe Ser Thr Arg Tyr Gly Val Val Ile Asp
530 535 540
Thr Met Ser Arg Asp Ala Ala Glu Ser Pro Thr Lys Ser Ala Phe Ser
545 550 555 560
Asp Glu Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Leu Asn Ala Ala
565 570 575
Trp Gln Thr Thr Val Pro Ser Trp Glu Ala Leu Arg Ser Gly Ser Ala
580 585 590
Asp Leu Gly Ser Asp Glu Thr Ala Lys Glu Ser Asp Tyr Ser Ala Leu
595 600 605
Met Thr Leu Tyr Ala Thr Gln Tyr Phe Lys Thr Val Asp Ala Glu Leu
610 615 620
Asp Lys Val Met Pro Asp His Leu Tyr Ala Gly Ser Arg Phe Ala Ser
625 630 635 640
Trp Gly Arg Thr Pro Glu Val Val Glu Ala Ala Ser Lys Tyr Val Asp
645 650 655
Ile Met Ser Tyr Asn Glu Tyr Arg Glu Gly Leu His Pro Ser Glu Trp
660 665 670
Ala Phe Leu Glu Glu Leu Asp Lys Pro Ser Leu Ile Gly Glu Phe His
675 680 685
Met Gly Thr Thr Thr Thr Gly Gln Pro His Pro Gly Leu Val Ser Ala
690 695 700
Gly Thr Gln Ala Glu Arg Ala Arg Met Tyr Ala Glu Tyr Met Glu Gln
705 710 715 720
Leu Ile Asp Asn Pro Tyr Met Val Gly Gly His Trp Phe Gln Tyr Ala
725 730 735
Asp Ser Pro Val Thr Gly Arg Ala Leu Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Ile
740 745 750
Gly Phe Val Ser Val Thr Asp Arg Pro Tyr Pro Glu Ile Val Ala Ala
755 760 765
Ala Arg Asp Val Asn Gln Arg Leu Tyr Asp Arg Arg Tyr Gly Asn Leu
770 775 780
Ala Thr Ala Glu Gly His Tyr Thr Gly Arg Arg Ser Ala Glu
785 790 795