一种脐带血杀伤细胞的冻存液及应用
阅读说明：本技术 一种脐带血杀伤细胞的冻存液及应用 (Cryopreservation solution for umbilical cord blood killer cells and application ) 是由 孙丹 唐忆琳 陈巧林 于 2020-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脐带血CIK细胞的冻存液及应用,所述冻存液为含有葡萄聚糖、多聚赖氨酸CPLL、和5-麦谷蛋白-3-醇的无血清培养基。脐带血单个核细胞诱导培养的第四天用添加5％葡聚糖和7.5％多聚赖氨酸CPLL和50μg/ml5-麦谷蛋白-3-醇的GT-T551 H3基础培养基冻存复苏后的CIK细胞,复苏活率和细胞表型较传统方法更高,复苏后脐带血CIK的增值性更高,杀伤性更强。复苏后能得到更接近于冻存前的细胞活率、增值能力、细胞表型和杀伤活性,长期冻存效果更稳定,且该冻存方法所用冻存液不含血清无动物源成分更安全,且不含DMSO对细胞不产生毒性,是一种值得临床推荐的有效的脐带血CIK冻存方法。(The invention discloses a cryopreservation solution for an umbilical cord blood CIK cell and application thereof, wherein the cryopreservation solution is a serum-free culture medium containing glucan, polylysine CPLL and 5-glutenin-3-ol. On the fourth day of the induction culture of umbilical cord blood mononuclear cells, the recovered CIK cells are cryopreserved by using a GT-T551H 3 basic medium added with 5% of glucan, 7.5% of polylysine CPLL and 50 mu g/ml of 5-glutenin-3-alcohol, so that the recovery survival rate and the cell phenotype are higher than those of the conventional method, and the recovered umbilical cord blood CIK has higher proliferation and stronger killing property. After recovery, the cell viability, the proliferation capacity, the cell phenotype and the killing activity which are closer to those before cryopreservation can be obtained, the long-term cryopreservation effect is more stable, the cryopreservation liquid used by the cryopreservation method does not contain serum and animal-derived components, is safer, does not contain DMSO and does not generate toxicity to cells, and the method is an effective cord blood CIK cryopreservation method which is worthy of clinical recommendation.)
技术领域
本发明涉及脐带血CIK冻存技术领域，更具体地，涉及一种脐带血杀伤细胞CIK的冻存液及应用。
背景技术
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK)是介导细胞毒活性最强的免疫效应细胞，兼具有T淋巴细胞的高度的杀瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等优点，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望。
细胞免疫治疗主要采集患者自身的外周血，通过分离和收集得到的外周血单个核细胞。但一般来说，接受细胞治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染患者，然而此类人群免疫细胞机能十分低下，分离出的免疫细胞活性较低，而异体免疫细胞移植可能引起免疫排斥反应。
由于脐带血具有来源广泛、易于采集、免疫原性低、组织相容性好等优势。脐血已成为获得CIK细胞的一个重要来源，且脐血CIK细胞作用更强，移植后GVHD发生率亦低，越来越引起大家的注意。
再者由于不能确保体外培养与临床使用时间节点的完全统一，为了避免长时间的培养而增加的成本、培养时间超过最佳对数生长期后细胞的生长状态及活性的下降而影响细胞的治疗质量，保存诱导培养后的脐带血CIK细胞也成了必要的方法之一。
目前，常使用的冻存方法是直接冻存单个核细胞，或者冻存诱导培养12天左右的细胞，但是直接冻存单个核细胞和12天左右接近平台期的细胞，复苏率和复苏后的杀伤活性明显降低，且冻存12天左右的细胞冻存和复苏成本大大提高，应用也受到局限。再者市场上普遍使用的冻存液含血清和DMSO，血清含动物源，DMSO对细胞有毒性，使用这样的冻存液存在很大的安全风险。
中国专利CN109874782A和CN111248192A提出的冻存液均只适合于NK细胞，并不适合于CIK细胞。另外，专利CN109874782A的冻存液含有DMSO溶液，DMSO在常温下对细胞有毒性作用。即使在复苏的过程中移除了绝大部分，但微量级的剩余也会对人体产生副作用(神经毒性，心血管衰竭，呼吸停止和致命的心率衰竭)。我们的目的是研究出一种不含DMSO和胎牛血清的冻存液并能最大程度的复原冻存前的细胞性能。而专利CN111248192A的冻存液不含有DM SO和胎牛血清，但是复苏活率、表型及对肿瘤细胞的杀伤率相对较低。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种脐带血杀伤细胞的冻存液及应用。
本发明的第一个目的是提供一种脐带血CIK细胞的冻存液。
本发明的另一个目的是提供所述的冻存液在冻存CIK细胞中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种脐带血CIK细胞的冻存液，为含有葡萄聚糖、多聚赖氨酸CPLL、和5-麦谷蛋白-3-醇的无血清培养基。
优选地，葡萄聚糖在无血清培养基中的添加的质量体积比为2～10％。
优选地，多聚赖氨酸CPLL溶液在无血清培养基中的添加的质量体积比为5～10％，所述多聚赖氨酸CPLL溶液的浓度为0.15～0.35g/ml。
优选地，5-麦谷蛋白-3-醇在无血清培养基中的添加的质量体积比为3～8％。
更优选地，葡萄聚糖在无血清培养基中的添加的质量体积比为5％。
更优选地，多聚赖氨酸CPLL溶液在无血清培养基中的添加的质量体积比为7.5％，所述多聚赖氨酸CPLL溶液的浓度为0.25g/ml。
多聚赖氨酸CPLL为丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸，其溶液的制备步骤为：称量13g丁二酸酐倒入100mL质量浓度为0.25g/mL的ε-多聚赖氨酸水溶液中，放入50℃水中进行水浴，水浴2小时后得到反应液；用10mol/L的NaOH水溶液调整所述反应液的pH至7.2～7.4，得到多聚赖氨酸CPLL溶液。
更优选地，5-麦谷蛋白-3-醇在无血清培养基中的添加的质量体积比为50μg/ml。
优选地，所述无血清培养基为GT-T551无血清培养基、达科为无血清培养基、或X-VIVO 15无血清培养基的任意一种。
更优选地，所述无血清培养基为GT-T551 H3无血清培养基。
以上任一所述的冻存液在冻存CIK细胞中的应用，也属于本发明的保护范围。
优选地，取脐带血单个核细胞，取脐带血单个核细胞，诱导培养CIK细胞，培养的第4天离心收集细胞，添加所述的冻存液进行冻存，
更优选地，所述诱导培养CIK细胞为：脐带血单个核细胞接种于免疫细胞无血清培养基，每50ml体系第0天加入30ugIFN-γ、24小时后加入25μgCD3单抗、0.08μgIL-1a和5万IU的IL-2进行诱导培养。
进一步优选地，所述免疫细胞无血清培养基为GT-T551培养基。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
脐带血单个核细胞诱导培养的第四天用添加5％葡聚糖和7.5％多聚赖氨酸CPLL和5％麦谷蛋白-3-醇的GT-T551 H3基础培养基冻存复苏后的CIK细胞，复苏活率和细胞表型较传统方法更高，复苏后脐带血CIK的增值性更高，杀伤性更强。复苏后能得到更接近于冻存前的细胞活率、增值能力、细胞表型和杀伤活性，长期冻存效果更稳定。且该冻存方法所用冻存液不含血清无动物源成分更安全，且不含DMSO对细胞不产生毒性，是一种值得临床推荐的有效的脐带血CIK冻存方法。
附图说明
图1为细胞复苏活率百分比。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、试剂及耗材
PBS，50mL离心管，10mL移液管，25mL移液管，GT-T551 H3培养基，T175培养瓶，0.4％的台盼蓝染液，1％多聚甲醛，BD试管，枪头，K562细胞，1640培养基，T25培养瓶，96孔板,LDH试剂盒，葡聚糖、多聚赖氨酸CPL、5-麦谷蛋白-3-醇，胎牛血清、DMSO
2、设备
离心机，电动移液枪，生物安全柜，流式细胞仪，漩涡振荡器，CO2培养箱，血球计数仪，倒置显微镜，手动移液枪，MTT
实施例1一种脐带血CIK细胞的冻存液
一种脐带血CIK细胞的冻存液为：添加5％(质量体积)葡萄聚糖、7.5％(质量体积)的多聚赖氨酸CPLL溶液(多聚赖氨酸CPLL溶液的浓度为0.25g/ml)和5％(质量体积)的5-麦谷蛋白-3-醇的GT-T551 H3培养基。
实施例2一种脐带血CIK细胞的冻存液
一种脐带血CIK细胞的冻存液为：添加2％(质量体积)葡萄聚糖、5％(质量体积)的多聚赖氨酸CPLL溶液(多聚赖氨酸CPLL溶液的浓度为0.25g/ml)和3％(质量体积)的5-麦谷蛋白-3-醇的GT-T551 H3培养基。
实施例3一种脐带血CIK细胞的冻存液
一种脐带血CIK细胞的冻存液为：添加10％(质量体积)葡萄聚糖、10％(质量体积)的多聚赖氨酸CPLL溶液(多聚赖氨酸CPLL溶液的浓度为0.25g/ml)和8％(质量体积)的5-麦谷蛋白-3-醇的GT-T551 H3培养基。
对比例1一种脐带血CIK细胞的冻存液
一种脐带血CIK细胞的冻存液为：添加5％(质量体积为)葡聚糖和7.5％(质量体积为)多聚赖氨酸CPLL溶液(多聚赖氨酸CPLL溶液的浓度为0.25g/ml)的GT-T551 H3培养基。
实施例4一种脐带血杀伤细胞的冻存方法
1、采血
在知情同意下采集3例自然分娩健康产妇脐带血100ml。
2、分离脐带血单个核细胞(CBMC)
先全血离心取出血浆，血浆56℃水浴灭活30min，1200g离心10min，取上清备用。再用淋巴细胞分离液提取脐带血单个核细胞，PBS清洗3次，计数细胞后接种
3、诱导培养
GT-T551培养基接种CBMC，每50ml体系第0天加入30ugIFN-γ、24小时后加入25μgCD3单抗、0.08μgIL-1a和5万IU的IL-2进行诱导培养。
4、冻存：在培养的第4天，3份细胞分别进行离心收集，然后每份收集的细胞平均分成3组进行冻存，A组：对比例1的冻存液，B组：实施例1的冻存液，C组：用10％DMSO+20％FBS+70％GT-T551 H3培养基冻存，经过程控降温仪降温，再投入液氮中保存。
其中，程控降温程序分7步：1、仪器降温到4℃将装有细胞的冻存管放入仪器；2、进入下一个程序以1℃/min降到-7℃；3、以15℃/min降到-50℃；4、以15℃/min升温到-25℃；5、保持-25℃3min；6、以1℃/min降到-55℃；7、以10℃/min降到-90℃。
5、复苏
冻存一周后，分别取出三组部分冻存细胞进行复苏培养；半年、一年、两年后分别取出三组部分冻存细胞进行复苏。
复苏培养的具体步骤是：将装有细胞悬液的冻存管从液氮中取出迅速投入到37℃水浴锅中，快速晃动使其2分钟内融化，再将细胞悬液转移到免疫细胞基础培养基中离心后去上清，以1×106/ml接种到免疫细胞完全培养基中，每1～2天补充新的完全培养基调整密度1×106/ml。
实施例5冻存液冻存脐带血CIK细胞效果的检测
一、复苏后的脐带血CIK细胞活率的测定
1、实验方法
将实施例4冻存后的脐带血CIK，取复苏后A、B、C三组CIK细胞，每份1ml，混匀，用台盼蓝染色，倒置显微镜下用血球计数仪计算细胞活率，然后计算每组细胞平均值。
2、实验结果
结果如图1所示，B组复苏活率明显高于A、C组，说明使用同时含有葡萄聚糖、多聚赖氨酸CPLL和5-麦谷蛋白-3-醇的冻存液的细胞复苏活率更高，且冻存半年、一年、两年复苏后细胞活率B组更稳定。
二、表型检测方法
1、实验方法
使用流式抗体分别组合标记复苏后第5、11天的各组5×105个细胞，然后使用流式细胞仪检测三组脐带血CIK中CD3+CD56+比例，并求平均值
2、实验结果
结果如表1所示，结果显示A、B组CD3+CD56+百分比明显高于C，而B组百分比高于A组，说明了使用含有葡萄聚糖、多聚赖氨酸CPLL和5-麦谷蛋白-3-醇的冻存液B组的细胞复苏后细胞表型要明显高于单独使用含有葡萄聚糖、多聚赖氨酸CPLL作为冻存液的A组的及使用传统冻存液的C组的细胞表型，且B组冻存液，冻存细胞细胞表型更稳定。
表1不同冻存时间及培养时间下三组细胞表型：
三、LDH法检测复苏后三组细胞对K562细胞杀伤活性
1、实验方法
于培养的第11、17天收集三组细胞，以肿瘤细胞K562为靶细胞在96孔板上进行LDH杀伤检测，逐步处理后将其置于酶标仪上检测OD值，并根据杀伤活性百分比计算公式：NK细胞杀伤活性(％)＝(实验-NK细胞自发-K562自发)/(K562最大-K562自发)×100％，计算出每组杀伤百分比，并求平均值。
2、实验结果
结果如表2所示，B组对肿瘤细胞K562的杀伤活性明显高于A、C组：收集11天的三组细胞，以K562为靶细胞，效靶比40：1进行杀伤实验，结果显示A组、B组明显高于C组，相较于B组，A组对肿瘤细胞的杀伤活性更强，且使用B组冻存液长期冻存细胞，复苏后细胞的杀伤活性更稳定。
表2三组细胞对K562杀伤活性：
效靶比
一周
半年
一年
两年
A组
69.43
65.88
62.32
57.98
B组
78.29
77.98
77.65
77.12
C组
53.28
48.65
42.34
36.23
实施例6
一、冻存处理
1、采血：在知情同意下采集3例自然分娩健康产妇脐带血100ml
2、分离脐带血PBMC：先全血离心取出血浆，血浆灭活离心备用。再用淋巴细胞分离液提取脐带血单个核细胞，PBS清洗3次，计数细胞。
3、冻存、诱导培养及复苏
将三份脐带血都等分两份：其中一份直接冻存，复苏后再进行诱导培养，记为D组；另一份，按照实施例4的方法先进行诱导培养，将诱导培养第四天的脐带血CIK细胞复苏后再继续培养，记为E组。
二、表型检测
1、实验方法
D、E两组使用流式抗体分别组合标记复苏后第11、14、17天的各组5×105个细胞，然后使用流式细胞仪检测两组脐带血CIK中CD3+CD56+比例，并求平均值。
2、实验结果
两组复苏培养后的CIK细胞CD3+CD56+所占百分比如表3所示，结果显示E组CD3+CD56+百分比明显高于D组，说明脐带血CIK细胞经激活培养四天后冻存要比直接冻存脐带血PBMC复苏后获得的效应细胞比例高。
表3：
CD<sup>3+</sup>CD<sup>56+</sup>百分比
D11
D14
D17
D组
45.33
49.29
52.11
E组
69.21
72.16
75.42
三.LDH法检测两组细胞对K562细胞杀伤活性
1、实验方法
于培养的第11、14、17天收集两组细胞，以肿瘤细胞K562为靶细胞在96孔板上进行LDH杀伤检测，逐步处理后将其置于酶标仪上检测OD值，并根据杀伤活性百分比计算公式：CIK细胞杀伤活性(％)＝(实验-CIK细胞自发-K562自发)/(K562最大-K562自发)×100％，计算出每组杀伤百分比，并求平均值。
2、实验结果
E组对肿瘤细胞K562的杀伤活性明显高于D组：收集11.14、17天的两组细胞，表4以K562为靶细胞，效靶比10：1、20：1、40：1进行杀伤实验，结果相较于D组，E组对肿瘤细胞的杀伤活性更强。
表4：
综上所述，直接冻存的PBMC复苏后再经过激活培养的CIK细胞相较激活培养第四天的CIK细胞冻存复苏后的CD3+CD56+效应细胞的比例及细胞杀伤活性均明显降低。
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