阅读说明：本技术 麦冬提取物、氨基酸、氨基酸衍生物和乳酸钙水合物的协同作用 (Synergistic effect of ophiopogon root extract, amino acid derivative and calcium lactate hydrate ) 是由 安德鲁·菲利普·萨拉扎 乔尔格·冯·哈根 鲁楠 亚历山德拉里·兰 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及由组分a)、组分b)、组分c)和组分d)组成的活性混合物,所述组分a)是从麦冬(Ophiopogon japonicus)获得的草药提取物,所述组分b)是丝氨酸、精氨酸和组氨酸的混合物,所述组分c)是吡咯烷酮-5-羧酸,并且所述组分d)是乳酸钙水合物,以及其在化妆品和/或皮肤病学组合物中的用途。本发明还涉及化妆品和/或皮肤病学组合物,其包含：a)从麦冬(Ophiopogon japonicus)获得的草药提取物；b)氨基酸：丝氨酸、精氨酸和组氨酸；c)氨基酸衍生物：吡咯烷酮-5-羧酸；和d)乳酸钙水合物。本发明还涉及通过局部施用所述活性混合物或所述化妆品或皮肤病学组合物的非治疗方法。(The present invention relates to an active mixture consisting of a component a) an herbal extract obtained from Ophiopogon japonicus (Ophiopogon japonica), a component b) a mixture of serine, arginine and histidine, a component c) pyrrolidone-5-carboxylic acid and a component d) calcium lactate hydrate, and its use in cosmetic and/or dermatological compositions. The present invention also relates to a cosmetic and/or dermatological composition comprising: a) herbal extracts obtained from radix Ophiopogonis (Ophiopogon japonicus); b) amino acids: serine, arginine, and histidine; c) amino acid derivatives: pyrrolidone-5-carboxylic acid; and d) calcium lactate hydrate. The invention also relates to a non-therapeutic method by topical application of said active mixture or said cosmetic or dermatological composition.)

具体实施方式

本发明意义上的“活性混合物”是指对皮肤细胞，优选对人皮肤细胞具有协同作用的所有组分a)，b)，c)和d)的混合物。

如前所述，优选地，所述由

a)从麦冬(Ophiopogon japonicus)获得的草药提取物；

b)氨基酸：丝氨酸、精氨酸和组氨酸；

c)氨基酸衍生物：吡咯酮酮-5-羧酸；和

d)乳酸钙水合物组成的活性混合物的特征在于组分a)是从麦冬(Ophiopogonjaponicus)根获得的草药提取物。

特别优选地，本发明的活性混合物的特征在于组分a)含有麦冬根的酶水解产物。

优选地，麦冬根提取物可以通过包括以下阶段的方法获得：

-麦冬块根粉末在水中溶解，

-至少一次酶水解，

-分离可溶相和不溶相，和

-通过热处理进行酶促灭活。

这些阶段在植物提取领域中是常见的，并且本领域技术人员能够基于其一般知识调整其反应参数。

酶促灭活之后可以进行一个或多个过滤和/或浓缩阶段。优选地，酶促失活之后是至少一个过滤阶段和一个灭菌过滤阶段。使用的酶是碳水化合物酶。它们可以是纯化的酶，单组分酶或不同酶的混合物。

优选地，通过所述方法获得的麦冬提取物包含相对于干物质的总重量计至少60％重量的果聚糖，优选至少80％。优选地，所述材料的果糖含量为28至245g/l，优选85至127g/l。根据Boratynski，J.，Analytical Biochemistry，1984,137,2,528-532中所述的测定酮糖的方法，通过分光光度法计量加入果糖。

优选的麦冬根的水提取物具有95至99％的碳水化合物(包括多糖)和1至5％的多酚。

特别优选地，本发明的活性混合物的特征在于组分a)是麦冬根提取物，其包含水、1,2-己二醇和辛乙二醇。

组分a)特别优选是由85.90％至90.10％的水，9.00％至13.00％的如上所述的麦冬根提取物，0.45％至0.55％的1,2-己二醇和0.45％至0.55％的辛乙二醇组成的水溶液，以商品名由法国的Silab公司上市销售。

本发明还涉及如前所述的所述活性混合物或具有如前或下文所述的优选描述的组分a)，b)，c)和d)的活性混合物在制备化妆品和/或皮肤病学组合物中的用途。

所述化妆品和/或皮肤病学组合物可包含如前所述或优选如前描述的活性混合物，其量为0.1至20重量％，优选0.5至10重量％，更优选1至6重量％，基于化妆品和/或皮肤病学组合物的总重量。

本发明进一步涉及化妆品和/或皮肤病学组合物，其包含如前所述或优选在其之前或之后描述的组分a)，b)，c)和d)。

在所述化妆品和/或皮肤病学组合物中，组分a)，b)，c)和d)的总重量含量为0.1-20％重量，优选0.5-10％重量，更优选1-6％重量。基于化妆品和/或皮肤病学组合物的总重量。

活性混合物和/或组合物中的氨基酸、氨基酸衍生物和乳酸钙水合物包括所有立体异构体或外消旋混合物。

优选使用L-丝氨酸。优选使用L-精氨酸。优选使用L-组氨酸。优选使用L-吡咯烷酮-5-羧酸。

优选使用L-乳酸钙水合物。优选的L-乳酸钙水合物是L-乳酸钙五水合物。

在如上所述的所述混合物或化妆品或皮肤病学组合物中，0.2至0.5当量的乳酸钙水合物应优选与1当量的丝氨酸一起使用。当根据本发明使用时，特别优选0.3至0.4当量的乳酸钙水合物与1当量的丝氨酸一起使用。当根据本发明使用时，特别优选使用1：0.33的丝氨酸和乳酸钙水合物的分子比例。

优选丝氨酸的量是在根据本发明的活性混合物或化妆品或皮肤病学组合物中组分b)，c)和d)的组合中的最高量。

优选的是，吡咯烷酮-5-羧酸，特别是L-吡咯烷酮-5-羧酸的量是根据本发明的活性混合物或化妆品或皮肤病学组合物中组分b)，c)和d)的组合中第二高的量。

优选地，L-丝氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-吡咯烷酮-5-羧酸和L-乳酸钙五水合物用于本发明的活性混合物或化妆品或皮肤病学组合物中。

在活性混合物中的组分b)，c)和d)中，丝氨酸的含量优选为25-35％重量，精氨酸的含量优选为5-10％重量，组氨酸的含量优选为5-10％重量。优选含有10-30％重量的吡咯烷酮-5-羧酸，优选含有25-35％重量的乳酸钙水合物，其中组分b)，c)和d)的组合总量为100％重量。

在活性混合物中的组分b)，c)和d)中，L-丝氨酸的含量优选为25-35％重量，L-精氨酸的含量优选为5-10％重量，L-组氨酸的含量优选为5至10％重量，L-吡咯烷酮-5-羧酸的含量优选为10至30％重量，L-乳酸钙五水合物的含量优选为25至35％重量，其中组分b)，c)和d)的组合总量为100％重量。

特别优选以下量的组分：L-丝氨酸29％至31％重量，L-精氨酸7％至8％重量，L-组氨酸7％至8％重量，20％至25％按重量计，L-吡咯烷酮-5-羧酸和29％至31％重量的L-乳酸钙五水合物，其中组分b)，c)和d)的组合总量为100％重量。

优选地，由30.6重量％的L-丝氨酸，7.5重量％的L-精氨酸，7.3重量％的L-组氨酸，24.2重量％的L-吡咯烷酮-5-羧酸和30.4％重量的L-乳酸钙五水合物组成的混合物与如前所述或优选如前描述的组分a)组合，构建根据本发明的优选的活性混合物。

如前所述或优选如前描述的活性混合物优选含有组分a)与组分b)，c)和d)之和，其比例为5：1至1：5，优选比例为3：1至1：3，特别优选按重量比1：1，3：1和1：3。

如前所述或优选如前描述的化妆品和/或皮肤病学组合物优选含有组分a)和组分b)，c)和d)之和，其比例为5：1至1：5，优选比例为3：1至1：3，特别优选按重量比1：1，3：1和1：3。

出于本发明的目的，术语“组合物”也与术语“制剂”同义使用。

这里的制剂通常是化妆品或皮肤病学上的制剂，其可以局部施用。“可以局部施用”是指制剂在外部和局部施用，即制剂必须是合适的，例如，能够施用于皮肤。在这种情况下，制剂包含化妆品上、药学上或皮肤病学上合适的载体，并且根据所需的性质特征，任选还包含其他合适的成分。局部制剂优选用作化妆品组合物。合适的载体和助剂或填料在本领域中是已知的。

根据本发明的制剂还可含有研磨剂，抗痤疮剂，抗皮肤老化剂，抗蜂窝织炎剂，去头屑剂，抗炎剂，刺激预防剂，刺激抑制剂，抗氧化剂，收敛剂，汗液抑制剂，防腐剂，抗静电剂，粘合剂，缓冲剂，载体材料，螯合剂，细胞刺激剂，清洁剂，护理剂，脱毛剂，表面活性剂，除臭剂，止汗剂，软化剂，乳化剂，酶，精油，纤维，成膜剂，固定剂，泡沫形成剂，泡沫稳定剂，防止发泡的物质，泡沫促进剂，胶凝剂，凝胶形成剂，护发剂，头发定型剂，头发拉直剂，保湿剂，湿润物质，保湿物质，漂白剂，增强剂，染色去除剂，光学增白剂，浸渍剂，防污剂，减摩剂，润滑剂，遮光剂，增塑剂，包覆剂，抛光剂，光泽剂，聚合物，蛋白质，再润滑剂，研磨剂，有机硅，皮肤舒缓剂，皮肤清洁剂，护肤剂，皮肤修复剂，亮肤剂，护肤剂，皮肤柔软剂，头发促进剂，清凉剂，皮肤清凉剂，温热剂，皮肤温热剂，稳定剂，紫外线吸收剂，有机紫外线过滤剂，无机紫外线过滤剂，洗涤剂，织物调理剂，悬浮剂，皮肤鞣剂，增稠剂，维生素油，蜡，脂肪，磷脂，饱和脂肪酸，单或多不饱和脂肪酸，α-羟基酸，多羟基脂肪酸，液化剂，染料，颜色保护剂，颜料，防腐剂，芳香剂，调味物质，有气味物质，多元醇，表面活性剂或电解质。

对于组合特别适合的活性成分是依克多因(Ectoin)，羟基依克多因，海藻糖，甘油，糖基甘油，β-甘露糖基甘油(firoin)，β-mannosylglyceramide(firoinA)，二-磷酸肌醇(DIP)，环状2,3-二磷酸甘油酸(cDPG)，1,1-二甘油磷酸酯(DGP)，二甘露糖基二磷酸肌醇(DMIP)，甜菜碱，甘氨酸甜菜碱，脯氨酸甜菜碱，谷氨酸甜菜碱，丙氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺，N-乙酰赖氨酸，谷氨酰胺1-酰胺，牛磺酸，胆碱，胆碱O-硫酸盐，肉毒碱，砷甜菜碱，巴豆甜菜碱，磺基乙酸二甲酯，磺酸二甲酯，高甜菜碱，三甲胺N-氧化物，泛醇，山梨糖醇，葡甲胺，透明质酸或透明质酸衍生物，尿素尿素)和烟酰胺(烟酰胺)，5,7-二羟基-2-甲色酮，以商品名上市销售或商业产品RenouMer，VTA，PoppySE，Isoquercetin或Cyclopeptide 5，Cyclopeptide 5无醇，SereneShield，Emblica，或液体。

制剂可包括或包含，基本上由上文和/或下文提到的必要或任选组分组成或由其组成。可用于制剂中的所有化合物或组分是已知的和可商购的或可通过已知方法合成。

这些其它活性成分优选以0.01至20重量％，特别优选0.1至15重量％，非常特别优选0.2至8重量％的量存在于局部制剂中，基于制剂的总量。

有机紫外线过滤剂，即所谓的亲水或亲脂防晒过滤剂，在UVA区域和/或UVB区域和/或IR和/或VIS区域是有效的(吸收剂)。这些物质尤其可选自二苯甲酰甲烷衍生物，肉桂酸衍生物，水杨酸衍生物，樟脑衍生物，三嗪衍生物，β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物，对氨基苯甲酸衍生物和聚合物过滤剂和硅氧烷过滤剂。所述UV过滤剂通常根据INCI命名法命名如下。

特别适合与本发明的活性混合物组合的是水杨酸乙基己酯，苯基苯并咪唑磺酸，二苯甲酮-3，二苯甲酮-4，二苯甲酮-5，2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸正己酯，4-甲基亚苄基樟脑，对苯二甲酰二樟脑磺酸，苯基二苯并咪唑四磺酸二钠，亚甲基双(苯并三唑基)四甲基丁基苯酚，丁基甲氧基二苯甲酰甲烷，乙基己基三嗪酮，二乙基己基丁酰胺三嗪酮，三唑甲酚三硅氧烷，亚苯基双二苯基三嗪，聚硅氧烷-15，1,1-二羧基(2,2'-二甲基丙基)-4,4-二苯基丁二烯，2,4-双[5-1(二甲基丙基)苯并恶唑-2-基(4-苯基)亚氨基]-6-(2-乙基己基)亚氨基-1,3,5-三嗪，及其混合物。这些有机UV过滤剂通常以0.01重量％至20重量％，优选1重量％至10重量％的量掺入制剂中。

制剂可优选包含助剂，例如化妆油(例如辛酸/癸酸甘油三酯，C12-15烷基苯甲酸酯，肉豆蔻酸异丙酯，芳基烷基苯甲酸酯，例如苯甲酸苯乙酯(X-Tend 226)或Cosmacol品牌的油组分，如二肉豆蔻醇酒石酸酯，三C14-C15烷基柠檬酸酯，C12-C13乳酸烷基酯，十三烷醇水杨酸酯，C12-C13烷基辛酸酯，C12-C13烷基苹果酸酯，C12-C13烷基柠檬酸酯，C12-C13烷基酒石酸盐，或极性-质子助剂(例如丙二醇，甘油，异丙醇，乙醇)或所谓的增溶剂(例如丁基邻苯二甲酰亚胺，异丙基邻苯二甲酰亚胺，二甲基异山梨醇)。非常特别优选的化妆油是C12-C13乳酸烷基酯(可以以商品名Cosmacol ELI购得)，以及苯乙酸苯乙酯(可以以商品名为X-Tend 226购得)。

如前所述的制剂可以通过将根据本发明的活性混合物或组分a)，b)，c)和d)与适合于这种制剂的载体混合并任选地与助剂和/或填料混合来合成。合适的载体和助剂或填料在以下部分中详细描述。

制剂的所述组分可以借助于本领域技术人员熟知的技术以常规方式掺入。

适合外用的制剂，例如可以作为乳霜或乳(O/W，W/O，O/W/O，W/O/W，W/Si)，作为洗液或乳液，以油-醇，油-水或水-醇凝胶或溶液的形式应用或喷洒至皮肤上。它们可以是固体棒的形式或配制成气溶胶。它们可以是洗发水，沐浴露，洁面乳或精华素。

下文中，例如，可以提及作为待使用的制剂的应用形式：溶液，悬浮液，乳液，PIT乳液，糊剂，软膏，凝胶，霜剂，洗剂，粉末，油，气雾剂，膏药，压布，绷带和喷雾剂。

优选的助剂来自防腐剂，稳定剂，增溶剂，着色剂，气味改进剂，增稠剂，增塑剂，保湿剂，界面活性剂，乳化剂，防腐剂，消泡剂，香料，蜡，羊毛脂，推进剂和化妆品中常用的其它成分。

软膏，糊剂，乳膏和凝胶可包含适于局部施用的常规载体，例如动物和植物脂肪，蜡，石蜡，淀粉，黄蓍胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅氧烷，膨润土，二氧化硅，滑石和氧化锌，或这些物质的混合物。

粉末和喷雾剂可包含常规载体，例如乳糖，滑石，二氧化硅，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可另外包含常规易挥发的液化推进剂，例如氯氟烃，丙烷/丁烷或二甲醚。也可以有利地使用压缩空气。

溶液和乳液可包含常规载体，例如溶剂，增溶剂和乳化剂，例如水，乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油，特别是棉籽油，花生油，小麦胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油，XTend 226，甘油脂肪酸酯，聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，或这些物质的混合物。

悬浮液可包括常规载体，例如液体稀释剂，例如水，乙醇或丙二醇，悬浮介质，例如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂和黄蓍胶，或这些物质的混合物。

面部和身体油可包含常规载体，例如合成油，例如脂肪酸酯，脂肪醇，硅油，天然油，例如植物油和油性植物提取物，石蜡油，羊毛脂油或这些物质的混合物。

进一步典型的化妆品应用形式还有唇膏，唇部护理棒，粉末化妆品，乳液化妆品和蜡化妆品，以及防晒剂，晒前和晒后制剂。

优选的制剂形式还特别包括乳液。

乳液是有利的，并且包括例如所述脂肪，油，蜡和其它脂肪物质，以及水和乳化剂，如通常用于此类制剂的那样。可以使用的乳化剂例如是已知的W/O和O/W乳化剂。在优选的O/W乳液中使用其它常规助乳化剂是有利的。

用于所述局部制剂的优选油和/或脂质包括：石蜡，异链烷烃，二辛基醚，PPG-15，硬脂基醚，蜂蜡，烛树蜡，巴西棕榈蜡，硬脂酸乙基己酯，辛酸/癸酸甘油三酯，乳酸十六烷基酯，硬脂酸硬脂酸酯，异壬酸异壬酯，辛基十二烷醇，己基癸醇，角鲨烯，天然甘油三酯如樱桃仁油(Prunus Cerasus)，鳄梨油，红花籽油，澳洲坚果籽油，可可脂(Theobroma Cacao)，牛油果黄油及其混合物。

用于所述制剂的优选吸收和/或增稠剂包括改性玉米淀粉，二氧化硅，滑石，硬脂酸锌，硫酸镁，氧化锌，硼硅酸钙和铝，淀粉和衍生物，聚氨酯，以及它们的混合物。

如前所述或优选如前描述的活性混合物协同刺激通过HAS1的透明质酸的合成，协同地刺激水转运蛋白AQP1的合成并协同地增加表皮和真皮的活细胞中的丝聚蛋白含量。

通过这种独特的性质组合，活性混合物能够防止与皮肤老化相关的干燥并协同地增强表皮的屏障功能。

本发明还涉及通过向人类皮肤局部施用如前所述的活性混合物或通过局部施用包含如前所述的活性混合物的化妆品或皮肤病学组合物或包含如前所述的组分a)，b)，c)和d)的化妆品或皮肤病学组合物来改善与衰老相关的皮肤干燥的非治疗方法。优选地，所述非治疗方法是应用化妆品组合物的美容方法。

本发明还涉及通过向人类皮肤局部施用如前所述的活性混合物或通过局部施用包含如前所述的活性混合物的化妆品或皮肤病学组合物或包含如前所述的组分a)，b)，c)和d)的化妆品或皮肤病学组合物来减少或预防与衰老相关的慢性炎症和刺激的非治疗方法。优选地，所述非治疗方法是应用化妆品组合物的美容方法。

另一方面，本发明还涉及通过向人类皮肤局部施用如前所述的活性混合物或通过局部施用包含如前所述的活性混合物的化妆品或皮肤病学组合物或包含如前所述的组分a)，b)，c)和d)的化妆品或皮肤病学组合物来来刺激表皮和真皮的活细胞中透明质酸，水通道蛋白和丝聚蛋白的合成的非治疗性方法。优选地，所述非治疗方法是应用化妆品组合物的美容方法。

该应用使用标准技术进行，例如通过将洗发剂，沐浴露，乳霜，洁面乳，糊剂，凝胶，洗剂，精华素施用于待治疗的皮肤，或将预定量的包含如前所述的活性混合物的制剂或如前所述的活性混合物溶解在水中和随后使用由所述水混合或形成的泡沫用于清洁或皮肤处理。

应该指出的是，本发明中描述的实施例的变型包含在本发明的范围内。除非明确排除，否则本发明中公开的任何特征可以替换用于相同目的或等同或类似目的的替代特征。因此，除非另有说明，否则本发明中公开的任何特征应被视为通用系列或等同或类似特征的示例。

除非特定特征和/或步骤相互排斥，否则本发明的所有特征可以以任何方式彼此组合。对于本发明的优选特征尤其如此。同样，非必要组合的特征可以单独使用(而不是组合使用)。

本发明所公开的技术教导可以被抽象出来并与其他例子相结合。

上文和下文提及的所有申请和出版物的完整公开内容通过引用并入本申请。

以下实施例旨在说明本发明。但是，它们绝不应被视为限制。

材料：

本实施例中使用的组分b)，c)和d)由表1中公开的下列成分组成。所述混合物在下文中称为混合物1。

表1：

PCA＝吡咯烷酮-5-羧酸

组分a)是产品SP，如表2中所描述，在下文中将被命名为OJ。其以1％的浓度使用。

表2：

实施例中使用的活性混合物是OJ与混合物1的重量比为2：1的混合物。所述混合物在下文中称为OJ+NMF。

实施例1：

将适于在补充有10％FCS(Biochrom，Merck，德国)的DMEM(Thermo Fisher，德国Art.111995123)中生长的人表皮角质形成细胞细胞系HaCAaT细胞接种到6孔板中的盖玻片上，在37℃，5％CO₂中以0.5×10⁵个细胞/cm²的密度培养24小时。此后，将细胞用OJ(1％v/v)或OJ+NMF(1％v/v+0.5％w/v)处理48小时，并在相同条件下孵育。

在该实验中，分析OJ和OJ+NMF作为活性混合物是否能够增加在参与皮肤水分保留的大分子的合成中起作用的蛋白质。皮肤保水中的关键分子是透明质酸。该分子由透明质酸合成酶1(HAS-1)和透明质酸合成酶2(HAS-2)合成。

使用来自通用探针库的引物以Realtime Ready系统(Roche，Manheim，德国)提供的定制测定的形式进行基因表达分析。为此，在RNeasy Mini Kit(QIAGEN，Hilden，德国)的帮助下分离RNA。使用具有RNase抑制剂试剂盒(Thermo，Darmstadt，德国)的High-CapacitycDNA Reverse Transcription试剂盒从分离的RNA合成cDNA。最后，使用LC480(Roche，Manheim，德国)按照制造商推荐的循环条件分析基因表达。使用2^-ΔΔCt方法计算相对于对照的倍数变化。

结果1：

如图1所示，未处理的HaCaT细胞确实产生基础水平的HAS-1，其设定为1作为参考。用OJ处理使HAS-1RNA上调58％，而OJ和混合物1(OJ+NMF)的活性混合物使HAS-1RNA上调258％。UT是未经处理的对照。

实施例2：

将适于在补充有10％FCS(Biochrom，Merck，德国)的DMEM(Thermo Fisher，德国Art.11995123)中生长的人表皮角质形成细胞细胞系HaCAaT细胞接种到6孔板中的盖玻片上，在37℃，5％CO₂中以0.5×10⁵个细胞/cm²的密度培养24小时。此后，将细胞用混合物1(0,5％w/v))、OJ(1％v/v)或OJ+NMF(1％v/v+0.5％w/v)处理48小时，并在相同条件下孵育。

在这里，我们分析了对于细胞中水的储存以及细胞的不同层中水的流动性(由水通道蛋白调节)的影响，并对水通道蛋白家族的表达谱进行了量化。

如图2所示，通过用OJ处理检测到水通道蛋白1上调了161％，并且OJ+NMF的活性混合物使表达增加至233％。UT是未处理的对照。没有检测到混合物1引起的上调。

实施例3：

将适于在补充有10％FCS(Biochrom，Merck，德国)的DMEM(Thermo Fisher，德国Art.111995123)中生长的人表皮角质形成细胞细胞系HaCAaT细胞接种到6孔板中的盖玻片上，在37℃，5％CO₂中以0.5×10⁵个细胞/cm²的密度培养24小时。此后，将细胞用混合物1(0.5％)、OJ(1％)或OJ+NMF(1％v/v+0.5％w/v)处理48小时，并在相同条件下孵育。

进行该实验以分析在活性混合物OJ+NMF处理48小时后对皮肤屏障蛋白紧密连接蛋白、闭合小带和丝聚蛋白的表达的影响。紧密连接蛋白和闭合小带的增加表明角质形成细胞彼此的结合得到改善。而由于丝聚蛋白的降解产生天然保湿因子，因此丝聚蛋白的增加意味着皮肤的屏障功能和保湿能力的潜在改善。

免疫荧光染色和显微镜检查：

然后使用标准免疫荧光方案(基于J.E.Gautrot等，Biomaterials33(2012)5221-5229)使用市售的针对紧密连接蛋白1，ZO-1和丝聚蛋白的一抗(R&D systems，德国)来固定细胞并染色。使用驴抗兔IgG NorthernLights^TM NL637-缀合的抗体作为检测的二抗(R&Dsystems，德国)。使用SP8共聚焦激光扫描显微镜(Leica，德国)进行成像(共聚焦显微镜)。

结果3：

如图3所示，HaCAaT细胞与1％OJ的孵育显示没有紧密连接蛋白、ZO-1和聚丝蛋白的上调(未处理vs OJ)。

孵育混合物1显示紧密连接蛋白的上调(未处理vs混合物1)，其余的另外两个则没有。OJ+NMF的组合显示出相对于所有其他测试条件的对丝聚蛋白的协同上调。

实施例4：丝聚蛋白的定量测量

将HACAT细胞在补充有10％FCS(Biochrom，Merck，德国)的DMEM(Thermo Fisher，德国Art.11995123)中于37℃，5％CO₂下培养48小时，接种密度为0.5×10⁵细胞/cm²。与标准品相比，进行夹心ELISA以定量细胞中产生的丝聚蛋白的量。OJ的浓度为1％v/v，混合物1以0.5％w/v使用(p<0.01)。用0.5％(w/v)混合物1处理对丝聚蛋白与总蛋白浓度的比率(0.07)没有影响。用OJ处理确实将该比率增加到0.086。混合物1和OJ的组合(OJ+NMF，1％v/v+0.5％w/v)确实将丝聚蛋白比率增加至0.096，因此合计协同增加了14％。

图4总结了丝聚蛋白的定量测量的这些结果。

制剂实施例

实例1：O/W乳液

程序：

在水相中分散黄原胶。将A相和B相加热至75℃。将A相搅拌到B相中。均化。冷却至室温并加入C和D相，缓冲液和分散的混合物1。搅拌直至全部溶解。

供应商

(1)Seppic；(2)BASF AG；(3)Evonik Nutrition&Care GmbH；(4)Biesterfeld；(5)Merck KGaA,Darmstadt,Germany/EMD Performance Materials；(6)Azelis GermanyGmbH；(7)Schülke&May GmbH；(8)Silab

实例2：面霜(O/W)

程序：

分别合并A相和B相，加热至80℃。在搅拌的同时将A相加入B相。均质。在～60℃加入C相。加入溶解的D相(温热至40-50℃)。在40℃加入E相并用氢氧化钠调节pH至5.0-5.5。

供应商：

(1)Seppic；(2)IOI Oleo GmbH；(3)BASF SE；(4)Gattefossé(Deutschland)GmbH；(5)Merck KGaA,Darmstadt,Germany/EMD Performance Materials；(6)Silab

实例3：具有SPF 15的防晒乳液

程序：

分别合并A相和B相。在搅拌的同时将B1相加入到B中。

搅拌直至获得均相。加入B2相并将A相和B相加热至70-75℃。

在不搅拌的情况下将A相加入到B相中并均化。

在搅拌下冷却，加入C相并将pH调节至5.5-6。

均质。

供应商：

Merck KGaA,Darmstadt,Germany/EMD Performance Materials；(2)EvonikNutrition&Care GmbH；(3)BASF SE；(4)R.T.Vanderbilt Company Inc；(5)RAHN GmbH；(6)Symrise；(7)Silab。