一种壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法
阅读说明：本技术 一种壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法 (Preparation method of chitosan quaternary ammonium salt type acellular dermal matrix material ) 是由 但年华 丁壮 陈一宁 但卫华 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法,其特征是将氧化壳聚糖双季铵盐与脱细胞真皮基质交联,利用氧化壳聚糖双季铵盐中醛基的化学活性使壳聚糖双季铵盐接枝到脱细胞真皮基质上,制得壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料。由于所接枝的壳聚糖双季铵盐是壳聚糖的衍生物,具有良好的生物相容性；同时壳聚糖双季铵盐拥有更多的季铵基团,可以赋予脱细胞真皮基质材料优良的抗菌性能。本方法可以广泛应用于抗菌生物材料的制备。(The invention discloses a preparation method of a chitosan quaternary ammonium salt type acellular dermal matrix material, which is characterized in that oxidized chitosan biquaternary ammonium salt is crosslinked with an acellular dermal matrix, and the chemical activity of aldehyde groups in the oxidized chitosan biquaternary ammonium salt is utilized to graft the chitosan biquaternary ammonium salt on the acellular dermal matrix to prepare the chitosan quaternary ammonium salt type acellular dermal matrix material. Because the grafted chitosan biquaternary ammonium salt is a derivative of chitosan, the grafted chitosan biquaternary ammonium salt has good biocompatibility; meanwhile, the chitosan biquaternary ammonium salt has more quaternary ammonium groups, and can endow the acellular dermal matrix material with excellent antibacterial performance. The method can be widely applied to the preparation of the antibacterial biological material.)
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，应用于生物材料领域。
背景技术
脱细胞真皮基质材料是采用组织工程技术与脱细胞技术，去除了动物皮中的表皮和真皮中的高抗原成分，保留了胶原的天然结构与基底膜，具有良好的结构稳定性的材料。其中含有 I 型胶原和Ⅲ型胶原，并以 I 型胶原为主。由于没有了细胞成分和抗原的免疫活性，一般不会发生排斥反应。脱细胞真皮基质材料可以促进表皮的生长与伤口的愈合，为表皮细胞的生长提供支撑，封闭创伤面，避免伤口暴露，抵御细菌入侵等，在皮肤修复方面应用广泛。但是，脱细胞真皮基质材料的主要成分是胶原纤维，本身不具备抗菌性能，在清创不彻底伤口的治疗中，存在易被细菌感染的缺陷，因此需要赋予其抗感染的能力。
通过交联改性可以解决生物材料的病菌灭活、消除或降低免疫原性、改善物理机械性能、提高耐降解能力，更好地满足使用的需要。物理交联法（如热脱氢）由于局限于材料表面且交联度程度低，未能广泛应用。合成交联剂来源广泛，可以通过分子设计的方法获得特定的分子结构，引入多个化学活性基团到交联剂分子中，因而交联高。但合成交联剂（如戊二醛）由于副产物和纯度不足等原因，容易导致交联后的材料生物相容性差。天然产物及其衍生物交联剂（如京尼平），相对生物相容性较好，但往往品种较少，制备和纯化成本相对较高，难以大规模产业化应用。
糖类是自然界中广泛分布的一类重要的有机化合物，在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。糖类物质具有绿色无毒、可在体内降解、种类多、来源广、具有一定的反应活性等特点，可以将糖类物质用于脱细胞真皮基质材料的改性。多糖的氧化一般是将伯羟基氧化成醛基，常用的氧化方法有高碘酸钠氧化、次氯酸钠氧化、过氧化氢氧化等方法。高碘酸钠具有选择性氧化的特点，能够对邻二羟基进行选择性氧化，制备出具有较强反应活性的醛基，且醛基含量可以调控，操作简单。经高碘酸钠氧化得到的氧化多糖，具有化学活性较强的多个醛基，可以与脱细胞真皮基质材料上的活性基团（如氨基）发生交联，赋予其较高的稳定性、物理机械性能和耐降解性等。
壳聚糖是由甲壳素经过脱乙酰化获得的产物，性质较活泼，具有良好的止血活性、生物降解性和生物相容性，广泛应用于食品、医疗、化工等行业。壳聚糖中含有游离的氨基，由于分子间有强烈氢键作用，导致了其只能溶解于酸性稀溶液中，而在中性、碱性和有机溶剂中基本是不溶的，因而大大限制了其应用。将季铵基团接入到壳聚糖分子中，可以大大改善其水溶性，其抗菌性能也有了一定程度的增强。壳聚糖季铵盐可以作为天然改性交联剂，其良好的抑菌性能与生物相容性受到了广泛关注。例如郭占勇采用烷基化壳聚糖的季铵化改性，合成了一系列N-烷基化壳聚糖季铵盐， 并研究了其对几种细菌的抑菌性能。结果表明，合成的壳聚糖季铵盐比壳聚糖有更强的抑菌效果，其抑菌性能受到季铵基团的影响（郭占勇. 水溶性壳聚糖衍生物的取代基团及氨基正电性对抑菌活性的影响）；樊李红采用壳聚糖季铵盐对海藻酸盐的共混纤维进行处理，制得了具有较高抑菌性能的抑菌性伤口敷料（樊李红, 杜予民, 张宝忠, 等. 海藻酸盐/壳聚糖衍生物复合抗菌纤维）。壳聚糖双季铵盐是通过对壳聚糖单元同时接枝两个季铵盐基团后的产物，它保持了壳聚糖本身大部分的天然结构，因此同时拥有壳聚糖和季铵盐的优良的性质。壳聚糖双季铵盐具有优良的絮凝性、保湿亲水性和生物相容性，在生物医学材料、水处理、造纸行业等广泛应用。壳聚糖双季铵盐具有优良的水溶性和抗菌性，但缺乏化学反应活性；通过高碘酸钠氧化可以使其获得醛基，从而具备化学反应活性，制得兼具化学反应活性和抗菌性能的新型交联剂，将其用于脱细胞真皮基质材料的交联，可以提高脱细胞真皮基质材料的稳定性及抗菌性能，制备出功能性脱细胞真皮基质材料。
发明内容
本发明是通过采用氧化壳聚糖双季铵盐对脱细胞真皮基质材料交联，克服脱细胞真皮基质材料无抗菌性能而提供的一种制备方法。如图1所示壳聚糖季铵盐在经高碘酸钠选择氧化后，原来在-NH2上的季铵基团丢失；而壳聚糖双季铵盐在-OH上的季铵基团仍然存在。氧化壳聚糖双季铵盐可使季铵基团接枝到脱细胞真皮基质材料上，该方法与普通单季铵盐相比，可引入更多的季铵基团，从而弥补壳聚糖单元氧化开环后损失的季铵基团，以保持良好的抗菌功能。
本发明的目的是由以下技术措施来实现的：
1．一种壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征是：（1）称取100重量份的脱细胞真皮基质材料，在20~47℃下，加入100~1000重量份的pH为3.0~9.6的缓冲溶液，浸泡10~60分钟；然后加入1~20重量份的氧化度5~80%的氧化壳聚糖双季铵盐，处理0.5~12小时；弃去废液，加入200~1000重量份的水，清洗10~30分钟；弃去清洗废液，加入100~1000重量份的pH值为3.0~9.6的缓冲液，加入0.5~2.0重量份的氨基酸，在20~40℃下，处理0.5~4.0小时；弃去废液，加入200~1000重量份的水，清洗20~60分钟；弃去废液，加入0.1~1.0重量份的乳酸或者乳酸钠，在20~35℃下，处理30~90分钟，将浴液pH调节至中性；弃去废液，加入200~1000重量份的20~40℃的注射水，清洗1~2小时；弃去废液，加入200~1000重量份的20~40℃注射水，清洗1~2小时。
2．根据权利要求1所述的壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，其中所述的氧化壳聚糖双季铵盐是指壳聚糖双季铵盐通过高碘酸钠选择氧化后形成的结构中含有多个活性醛基基团的产物。
3．根据权利要求1所述的壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，其中所述的pH 为3.0~9.6的缓冲液，该pH是通过使用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液达到的。
4．根据权利要求1所述的壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，其中所述的氨基酸，是指赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
5．权利要求1所述的壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，制得的壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的关键性能达到以下要求：（1）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的抑菌率≥95%；（2）对总状毛霉菌的抑制率≥95%；（3）浸提液细胞毒性为0～1级，无皮肤致敏反应。
6．权利要求1所述的壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料的制备方法，其中特征在于该方法可用于脱细胞猪真皮基质、脱细胞胎牛皮真皮基质、脱细胞鱼皮基质、脱细胞羊皮基质的制备中。
本发明具有以下优点：
（1）交联程度高
本方法所用的氧化壳聚糖双季铵盐含有多个醛基，可以与脱细胞真皮基质材料上的氨基形成多个结合点，产生高强度的交联，从而提高脱细胞真皮基质材料结构稳定性和耐降解能力；
（2）抗菌防霉性能好
本方法通过醛基将壳聚糖双季铵盐引入到脱细胞真皮基质材料中，在相同条件下，比普通季铵盐引入了更多的季铵盐基团，因而具有更好的抗菌、防霉性能。交联后的脱细胞真皮基质材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的抑菌率≥95%；对总状毛霉菌抑制率≥95%；
（3）生物相容性好
壳聚糖是甲壳素脱乙酰化获得的产物，性质较活泼，具有良好的止血活性、生物降解性和生物相容性，其盐也保留了良好的生物相容性。氧化壳聚糖双季铵盐是壳聚糖的衍生物，继承了壳聚糖优良的生物相容性；剩余的醛基采用氨基酸后处理, 可以除去残留的醛基，保证了交联材料的良好生物相容性。材料的浸提液细胞毒性为0～1级，无皮肤致敏反应；
（4）可调控性好
可以通过控制氧化程度、控制交联剂的用量, 来控制交联程度和抗菌性能；
（5）可生物降解
由于壳聚糖双季铵盐具有生物可降解性，接入到生物材料后，仍然可以保持交联材料的生物降解性，可以通过交联程度来调节其降解性能；
（6）可以赋予生物材料良好的亲水、保湿性能
通过在生物材料中引入壳聚糖双季铵盐，将壳聚糖双季铵盐的亲水、保湿性能赋予生物材料，使生物材料具有良好的亲水、保湿性能。
综述所述，本发明以氧化壳聚糖双季铵盐为原材料，将其应用于脱细胞真皮基质材料的交联，制备得到壳聚糖季铵盐型脱细胞真皮基质材料具有更强的抗菌性能，更好的亲水性能，是一种新型的功能性脱细胞真皮基质材料的制备方法，可以广泛应用于抗菌生物材料的制备。
附图说明
图1为壳聚糖单季铵盐与壳取糖双季铵盐的氧化反应对比。
具体实施方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
应用实例1
(1) 称取1kg的脱细胞猪真皮基质，加入到反应器中；
(2)加入3kg的pH为9.6的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，转动30分钟；
(3)称取氧化度为40%的氧化壳聚糖双季铵盐0.1kg，溶解于0.2kg的pH为9.6的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液中；
(4)将溶解好的氧化壳聚糖双季铵盐溶液倒入到反应器中，升温到37℃，反应6小时，倒去废液；
(5)加入6kg无离子水，清洗20分钟，倒去废液；
(6)加入6kg的pH为9.6的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液，加入0.01kg赖氨酸，转动120分钟，倒去废液；
(7)加入6kg的无离子水，清洗30分钟，倒去废液；
(8)加入6kg无离子水，加入0.01kg乳酸，在30℃下处理60分钟，弃去废液；
(9)加入30℃的注射水6kg，清洗1.5小时；倒去清洗液，再加入6kg注射水，清洗1.5小时。
应用实例2
(1)称取100克的脱细胞胎牛皮真皮基质，加入到反应器中；
(2)加入1000克的pH为7.0为的磷酸盐缓冲溶液，转动10分钟；
(3)称取氧化度为80%的氧化壳聚糖双季铵盐1克，溶解于20克的pH为7.0为的磷酸盐缓冲溶液中；
(4)将溶解好的氧化壳聚糖双季铵盐溶液倒入到反应器中，升温到47℃，反应30分钟，倒去废液；
(5) 加入1000克的pH为7.0为的磷酸盐缓冲溶液，加入0.5克精氨酸，转动30分钟，倒去废液；
(6) 加入1000克无离子水，清洗20分钟，倒去废液；
(7) 加入1000克无离子水，加入0.1克乳酸钠，处理30分钟，弃去废液；
(8) 再加入1000克无离子水，清洗20分钟，倒去废液；
(9)加入20℃的注射水1000克，清洗1小时，倒去清洗液；
(10) 加入1000重量注射水，清洗1小时。
应用实例3
（1）称取100kg的脱细胞羊真皮基质，加入到反应器中；
（2）加入100kg的pH为3.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，转动60分钟；
（3）称取氧化度为5%的氧化壳聚糖双季铵盐20kg，加入到反应器中，在20℃下反应12小时，倒去废液；
（5）加入100kg的无离子水，清洗60分钟，倒去废液；
（6）加入100kg的pH为3.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入2kg的组氨酸，转动60分钟，倒去废液；
（7）加入100kg的无离子水，清洗60分钟，倒去废液；
（8）加入100kg无离子水，加入1.0kg的乳酸钠，处理90分钟，弃去废液；
（9）加入37℃的注射水200kg，清洗2小时，倒去清洗液；
（10）再加入200kg注射水，清洗2小时。
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