一种胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法
阅读说明：本技术 一种胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法 (Preparation method of placenta tissue engineering immunogen-removing skin scaffold ) 是由 万美蓉 陈伟 高云 杨若霖 时晰 于 2019-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医用材料技术领域,具体涉及一种胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法。本发明的胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法,包括以下步骤：1)从胎盘中无菌分离出胎盘膜；2)将分离出的胎盘膜清洗后置于抗生素溶液中浸泡,进行消毒处理；3)反复用无菌蒸馏水冲洗浸泡胎盘；4)将消毒后的胎盘膜用不同浓度的乙醇-生理盐水溶液中梯度脱水,去除蛋白,灭活免疫原；5)将脱水后的胎盘膜浸泡于乙醇中,浸泡后取出风干,制成皮肤支架。本发明能够实现简便,快速,高效,大规模制备医用人工皮肤的目的,且易于保存,便于运输。(The invention relates to the technical field of medical materials, in particular to a preparation method of a placenta tissue engineering immunogen-removing skin scaffold. The preparation method of the placenta tissue engineering immunogen-removing skin scaffold comprises the following steps: 1) aseptically separating placental membranes from placenta; 2) cleaning the separated placental membranes, and then soaking the placental membranes in an antibiotic solution for disinfection; 3) repeatedly washing and soaking placenta with sterile distilled water; 4) gradient dehydrating sterilized placenta membrane with ethanol-normal saline solution with different concentrations, removing protein, and inactivating immunogen; 5) and soaking the dehydrated placenta membrane in ethanol, taking out after soaking, and air-drying to obtain the skin stent. The invention can realize the purpose of preparing the medical artificial skin simply, conveniently, quickly and efficiently in a large scale, and is easy to store and convenient to transport.)
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体地，涉及一种胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法。
背景技术
胎盘(placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。胎盘还是一味中药，称之为紫河车，又叫人胎衣、胞衣、衣胞、胎膜。自古以来，胎盘被医者认为是一种良药，可以增强免疫系统而被广泛应用，且其在安全方面更加可靠。
围产期废弃的胎盘组织是重要的再生医学种子细胞来源之一，其来源广泛、易于获取且无伦理道德争议，是近年的研究热点。胎盘作为一种免疫豁免生物移植物，具有抗炎、抗粘连，减轻疼痛，促进上皮化等生物学特性，近年来，随着对胎盘的进一步认知及胎盘保存制备技术的发展，胎盘再次成为研究及应用的热点，被广泛应用于烧伤救治等领域。由此可以看出人胎盘为创伤修复组织工程材料有良好的应用前景。
目前类似研究多使用羊膜为皮肤支架基质材料，但羊膜质地轻薄，拉伸过程易破损。本发明应用胎盘制作皮肤支架，与已有发明所使用的材质(羊膜组织成分)，及相关处理工艺均存在本质不同，自古以来“紫河车”的入药成分为胎盘而非羊膜，现代研究表面胎盘中存在多种激素及免疫因子，有助于局部损伤组织再生(羊膜皮肤支架无此功能)。此外，胎盘皮肤支架产量远高于羊膜皮肤支架(羊膜仅为胎盘内侧一层薄膜结缔组织，做成支架后仅能起到破损组织表面覆盖作用)，本工艺处理后获得的胎盘皮肤支架韧性极佳，相比以往报道中的羊膜支架，拉伸及延展性能显著提升，实际治疗应用中能够依据烧伤创面大小及形状进行任意延展，更加便捷。因此，本发明无论在支架选材还是工艺流程方面均为原创性发明。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，公开了一种人来源的胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法，该方法能够实现简便，快速，高效，大规模制备医用人工皮肤的目的，且易于保存，便于运输。
本发明的具体技术方案如下：
本发明的胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法，包括以下步骤：
1)取产后弃用胎盘组织，用无菌蒸馏水冲洗胎盘、去绒毛、血管和羊膜及其它结缔组织，制备无菌胎盘膜；
2)将分离出的胎盘膜清洗后置于无菌抗生素-生理盐水溶液中浸泡，抗菌处理；
3)将处理后的胎盘膜用不同浓度的乙醇-生理盐水溶液中梯度脱水，去除蛋白，灭活免疫原；
4)将脱水后的胎盘膜浸泡于无菌抗生素-生理盐水溶液中，随后取出风干，制成皮肤支架。
根据本发明所述的制备方法，其中优选地，所述抗生素溶液为含有抗生素的无菌生理盐水溶液。
根据本发明所述的制备方法，其中优选地，步骤2)所述的抗生素为庆大霉素、青霉素和链霉素中的一种或几种。进一步优选地，可以是庆大霉素，防止青霉素过敏、链霉素毒性反应。
根据本发明所述的制备方法，其中优选地，步骤2)使用生理盐水清洗分离出的胎盘膜，清洗后置于抗生素溶液中浸泡5-24小时。
根据本发明所述的制备方法，其中优选地，步骤3)所述不同乙醇-生理盐水溶液中的乙醇浓度分别为75％、35％、15％。
根据本发明所述的制备方法，其中优选地，步骤4)将脱水后的胎盘膜浸泡于无菌生理盐水中1～3天；在无菌环境下进行风干。
根据本发明的
具体实施方式
，本发明的胎盘组织工程去免疫原皮肤支架的制备方法具体可以包括以下步骤：
1、从整体胎盘中无菌分离胎盘膜：
选取已经脱离人体的胎盘，经血清检测排除病毒和细菌及其他病原体感染，如排除HIV，梅毒，HBV和HCV等感染，在无菌条件下从胎盘的内层剥下胎盘，放置到无菌蒸馏水中，反复冲洗除去胎盘表面的血迹，并用镊子自胎盘与绒毛膜间的潜在空隙钝性剥离绒毛、血管及其它结缔组织。用无菌蒸馏水反复冲洗，前述取材均在无菌条件下完成；
2、生理盐水清洗2～3遍，随后置于含抗生素(庆大霉素，青霉素，链霉素等)生理盐水中浸泡5-24小时进行消毒处理；
3、取出胎盘膜，生理盐水清洗后用不同浓度乙醇-生理盐水(75％、35％、15％高到低浓度乙醇)梯度脱水1-3天(去除蛋白，灭活免疫原变性)，最终浸泡于含抗生素无菌生理盐水，该过程在不破坏胎盘基质结构的前提下，有效提高胎盘的韧性，同时还能够有效灭活异体细胞，去除大量异源蛋白及未知免疫原，大大降低了移植过程中发生不良免疫反应的可能性。
4、将浸泡在无菌生理盐水中的胎盘膜置于无菌超净工作台内风干(风干时胎盘膜固定防止回缩)；
5、按临床需求裁剪成不同规格胎盘膜贴片，制成人工皮肤支架，进行无菌真空包装，阴凉干燥处室温无菌保存备用；
6、使用前，取出胎盘皮肤支架贴片，用于皮肤缺损病人。
根据本发明所述的制备方法，其中，步骤1)从胎盘中无菌去除胎盘膜，该过程可以使用本领域公知任意方法获得，本发明不做特别限定，例如可以优选如下步骤：
a)选取脱离母体的胎盘，经血清检测排除病毒和细菌及病原体感染后，在无菌条件下从胎盘的内层剥下羊膜、绒毛及血管结缔组织，将胎盘膜组织放置到无菌水中反复冲洗除去表面的血迹；(血清检测主要排除致病的病毒和细菌及其它病原体感染(如HIV，梅毒，HBV，CMV和HCV)
b)将冲洗后的胎盘组织中残留的绒毛、肌间膜、血管及其它结缔组织剥离干净，制备成为胎盘膜。
本发明所使用的胎盘既可以是人源也可以是其他动物源(例如：猪)。
本发明对剥离出的胎盘膜需用无菌水反复冲洗，从胎盘获取及分离胎盘膜的整个取材过程均在无菌条件下完成。
本发明所使用试剂包括水均需无菌，比如无菌生理盐水、蒸馏水等等。所使用的无菌水可以是无菌蒸馏水或无菌超纯水。
本发明可以将风干的胎盘膜按临床需求裁剪成不同规格胎盘膜贴片，制成人工皮肤支架，进行无菌真空包装，阴凉干燥处室温无菌保存备用；使用前，取出胎盘皮肤支架贴片，可用于皮肤缺损病人，也可以用于骨不连，骨缺损患者。
本发明还提供了一种胎盘组织工程去免疫原胎盘膜支架，其中，所述皮肤支架材料为去除免疫原的胎盘膜。
进一步优选地，本发明所述皮肤支架可以由上述任一所述的制备方法制备而成。
本发明使用去血管胎盘膜为人工皮肤基质材料，其韧性及厚度较其他羊膜来源皮肤支架均有显著性提高，本发明应用范围将更加广阔，且获取储存及运输过程更加便捷。
生理盐水清洗后用不同浓度乙醇-生理盐水(75％、35％、15％高到低浓度乙醇)梯度脱水1-3天(去除蛋白，灭活免疫原)，最终浸泡于含抗生素无菌生理盐水，该过程在不破坏胎盘膜基质结构的前提下，有效提高胎盘膜的韧性，同时还能够有效灭活异体细胞，去除大量异源蛋白及未知免疫原，大大降低了移植过程中发生不良免疫反应的可能性。
本发明所述制备方法需要对胎盘进行漂洗消毒，乙醇进行连续梯度脱水，无菌台内风干，按临床需求截成不同规格胎盘膜贴片，无菌真空包装后备用。制备成方便保存、运输的胎盘膜贴片，同时使胎盘中的异体细胞及免疫原蛋白充分变性，且不存在对胎盘本身的机械损伤，还可以有效提高胎盘膜的韧性；使用前将独立保存的胎盘膜贴片可直接敷于患处，有助于伤口的快速愈合。本发明所采用的方法能够实现快速，高效，大规模制备医用人工皮肤支架的目的。且我们使用的材料为人的胎盘，来源广泛，且人源的胎盘为孕妇生产后的废弃物，成本较低且不存在伦理问题。本发明借助全新技术方法能够大量获得胎盘来源的皮肤支架贴片，目前已在猪(大动物模型)上进行烧伤后皮肤再生验证，效果显著，无不良反应。
附图说明
图1为实施例1中胎盘膜皮肤支架制备图，其中左图为去免疫原新鲜胎盘支架，右图为去免疫原胎盘膜贴片；
图2为实施例2中猪皮肤支架治疗图片(猪模型均为深III度烫伤)。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
制备皮肤支架：
1.从胎盘中无菌分离胎盘：
选取已经脱离人体的胎盘，经血清检测排除病毒和细菌及其他病原体感染，如排除HIV，梅毒，HBV和HCV等感染，在无菌条件下从胎盘的内层剥下胎盘，放置到无菌蒸馏水中，反复冲洗除去胎盘表面的血迹，并用镊子自胎盘与绒毛膜间的潜在空隙钝性剥离绒毛、血管及其他结缔组织。用无菌蒸馏水反复冲洗，过夜浸泡、直到胎盘膜洁白，前述取材均在无菌条件下完成；
2.生理盐水清洗2～3遍，随后置于含抗生素(庆大霉素)生理盐水中浸泡5-24h天进行消毒处理；
3.取出胎盘膜，生理盐水清洗后用不同浓度乙醇-生理盐水梯度(75％、35％、15％高到低浓度乙醇)脱水1-3天(去除蛋白，灭活免疫原)，该过程在不破坏胎盘基质结构的前提下，有效提高胎盘的韧性，同时还能够有效灭活异体细胞，去除大量异源蛋白及未知免疫原，大大降低了移植过程中发生不良免疫反应的可能性。
4.将乙醇脱水的胎盘膜在无菌生理盐水中浸泡后，置于无菌超净工作台内风干；
5.按临床需求裁剪成不同规格胎盘膜贴片，制成人工皮肤支架，进行无菌真空包装，阴凉干燥处室常温无菌保存备用；
6.使用前，取出胎盘膜皮肤支架贴片，可用于皮肤缺损病人，也可用于骨不连，骨缺损患者。
本实施例制备的皮肤支架如图1所示，(左图)去免疫原新鲜胎盘支架，(右图)脱水去免疫原胎盘支架。
实施例2
制备皮肤支架：具体方法同实施例1。
分组情况：A组对照组无支架包扎治疗组
B组实验组：支架包扎治疗组
操作步骤：电烙铁加热5分钟，直接放置小猪背部2分钟，电烫形成重Ⅲ度烧伤，烫伤3天后进行手术，去除坏死组织，随后分别进行有支架或无支架包扎治疗，详细建模及治疗情况如下：
(A组对照组)无支架组：
滇南小耳猪，编号152709，性别；公猪，日龄115天，体重10，6KG，25％戊巴比妥10ml，肌肉注射，10分钟；
a.用电烙铁加热5分钟，直接放置小猪背部2分钟
b.电烫重Ⅲ度，烫伤创口面积10*11cm(皮肤表面焦糊状、水泡)；
c.3天后，在无菌手术台进行坏死皮肤切除手术，创口面积10*11cm，伤口深肌间膜，1.0-2.0cm；
d.无菌凡士林油纱布包扎；
e.5天创口面积扩大为11*14cm，感染、奇臭，局部水泡，红肿溃烂，浓痂，有蛆虫乱爬，局部用抗生素生理盐水冲洗；肌肉注射阿莫西林0.2g/天进行消炎抗菌治疗；
d.6天感染性死亡。
实验结果如图2所示，其中，A-D为对照组伤口情况，创伤当天伤口面积10*11cm(A)，三天后手术创口面积10*11cm(B)，5天伤口面积扩大为11*14cm且伴发感染(C)，6天感染性死亡，创口有蛆虫(D)；
(B组实验组)支架组
滇南小耳猪，编号000001，性别；公猪，日龄115天，体重11.5KG，25％戊巴比妥11ml，肌肉注射，10分钟，
a.用电烙铁加热5分钟，直接放置小猪背部2分钟；
b.电烫重Ⅲ度，烫伤创口面积10*11cm(皮肤表面焦糊状、水泡)；
c.3天后，在无菌手术台进行坏死皮肤切除手术，创口面积14*19cm，伤口深肌间膜，1.5-2.0cm。
d.术中将制备好的去免疫原无菌皮肤支架贴于伤口创面；
e.无菌凡士林油纱布包扎；
f.支架组5天创口面积9*13cm无感染；
g.支架组25天、伤口面积2*4cm
h.支架组30天伤口愈合，并可观察到新生毛发。
支架组实验结果如图2所示，其中，E-H为支架组伤口情况，创伤当天伤口面积10*11cm(E)，3天后手术创口面积14*19cm，伤口深肌间膜，1.5-2.0cm(F)。支架组5天伤口面积5*13cm。支架组25天、伤口面积2*4cm(G)，支架组30天伤口愈合，局部开始有毛发生长(H)，表明已有毛囊形成。
综合上述实验结果分析表明，本发明所使用的皮肤支架具有良好的重度烧伤治疗效果，且治疗过程中能够有效预防创面感染及其导致死亡现象(对照组3头猪，在烧伤后一周内相继死于感染，图2所示其一，烫伤后第6天死亡)。而采用本发明皮肤支架治疗组(n＝3)，均未发生烧伤后感染现象(可能与本发明处理过程中将皮肤支架浸泡抗生素有关,同时皮肤支架能够有效阻隔烧伤创面与外界空气接触，阻断病原微生物诱发的创面感染)，在1个月左右伤口完全愈合，并出现毛发生长迹象。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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