肝前体细胞和内皮细胞共培养在治疗急性肝损伤中的应用
阅读说明：本技术 肝前体细胞和内皮细胞共培养在治疗急性肝损伤中的应用 (Application of co-culture of liver precursor cells and endothelial cells in treatment of acute liver injury ) 是由 鄢和新 刘文明 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体是一种人肝前体细胞与内皮细胞共培养体系,以及共培养后的肝细胞球在制备急性肝损伤治疗药物中的应用。本发明采用无基质胶、低血清共培养体系,发现共培养后,可以有效增加促进肝细胞功能的提升,操作简单、花费低、培养周期短,海藻酸盐微囊包被后可以明显提高急性肝损伤小鼠的生存率,高达90％以上,远高于对照组的16.7％。与多潜能干细胞诱导得到的类肝细胞和原代肝细胞相比,肝前体细胞将更具有临床实用价值,为干细胞移植治疗肝损伤提供了新的思路和替代治疗方案。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a co-culture system of human liver precursor cells and endothelial cells and application of co-cultured hepatocyte balls in preparation of a medicine for treating acute liver injury. The invention adopts a co-culture system without matrigel and with low serum, and finds that after co-culture, the improvement of the function of the liver cells can be effectively improved, the operation is simple, the cost is low, the culture period is short, and the survival rate of mice with acute liver injury can be obviously improved after the alginate microcapsules are coated, and is more than 90 percent and far higher than 16.7 percent of that of a control group. Compared with the hepatic cell like cells and primary hepatic cells obtained by the induction of the pluripotent stem cells, the hepatic precursor cells have more clinical practical value, and provide a new thought and alternative treatment scheme for treating liver injury by stem cell transplantation.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是通过建立的无基质胶、低血清肝前体样细胞(hepLPCs)与内皮细胞(HUVEC)共培养体系可以明显提高肝前体细胞(hepLPCs)的肝功能，海藻酸盐微囊包被后可以显著提高急性肝损伤小鼠的生存率，进而为干细胞移植治疗肝损伤提供新的思路和替代治疗方案。
背景技术
肝脏是人体内最大的实质器官，在人体中扮演重要角色。它调控碳水化合物的代谢、尿素和脂质代谢、必需营养物质的储存、血浆蛋白质的产生、胆汁酸和肝脏的分泌等；同时肝脏作为人体的物质能量转化中心，有充足的底物及细胞色素酶直接/间接参与人体对各种外来物质的生物转化作用。中国是肝炎感染的高发国家，因此重症肝脏疾病在中国的发病率也非常高。肝脏移植仍然是重症肝脏疾病治疗最有效的手段。肝细胞作为肝脏中含量最丰富的实质细胞，是肝脏领域研究的“金标准”，尤其在体外培养、药物毒性筛选及生物人工肝方面的研究中起到举足轻重作用。
体外肝细胞培养主要采用三种策略：一是肝脏细胞的体外直接培养，二是通过干细胞的体外肝细胞定向分化培养，三是通过诱导纤维祖细胞转分化为类肝细胞培养。利用人类胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESC)和诱导多潜能性干细胞(humanInduced pluripotent stem cells，hiPSC)的体外分化技术，可以诱导干细胞分化成具有肝细胞标记物和部分肝细胞功能的“类肝细胞”[Clevers H.Modeling Development andDisease with Organoids[J].Cell,2016,165(7):1586-1597.]。通过体外化学诱导或者转染肝细胞特异性的转录因子，可以诱导成纤维细胞转分化为具有部分肝细胞功能的肝细胞。然而近期的研究显示，这种体外的重编程将可能导致遗传和表观遗传改变，诱导产生基因组不稳定性和基因突变，将转基因生物材料移植入人体将面临很大的伦理学问题，这些缺陷将导致hESC和hiPSC来源的“类肝细胞”细胞移植具有巨大的风险[Dudley S C,Jr.Beware of cells bearing gifts:cell replacement therapy and arrhythmic risk[J].Circ Res,2005,97(2):99-101.]。因此肝细胞被视为细胞移植和治疗的理想细胞源。2017年，发明人团队发现体外通过小分子组合可诱导成熟肝细胞转化为具有增殖能力的肝前体样细胞，并具有分化为成熟肝细胞的潜能[Wu H,Zhou X,Fu G B,He Z Y,Wu H P,YouP,Ashton C,Wang X,Wang H Y,Yan H X.Reversible transition between hepatocytesand liver progenitors for in vitro hepatocyte expansion[J].Cell Res,2017,27(5):709-712.]。体外通过小分子组合高效活化肝细胞重编程相关信号通路所产生的前体细胞，安全性及均一性高，在急性肝损伤治疗中具有一定临床应用价值。同时我们引入HPVE6/E7系统获得永生化肝前体细胞，可以获得大量肝前体细胞，为开展细胞治疗提供大量细胞源[Xiao J,Wang X,Wu Y,Zhao Q,Liu X,Zhang G,Zhao Z,Ning Y,Wang K,Tan Y,DuB.Synergistic effect of resveratrol and HSV-TK/GCV therapy on murine hepatomacells[J].Cancer Biol Ther,2019,20(2):183-191.]。考虑到细胞安全性，为了便于清除，我们还引入了HSV-TK自杀系统。该基因转导的细胞表达功能性HSV-TK，可诱导转化无毒更昔洛韦(GCV)转化为有毒GCV-三磷酸盐抑制DNA合成从而导致细胞死亡[Jianyong Xiao,Xiaolan Wang,Yingya Wu,Qing Zhao,Xiaodong Liu,Guangxian Zhang,Zengqiang Zhao,Yizhen Ning,Kun Wang,Yuhui Tan,Biaoyan Du.Synergistic effect of resveratroland HSV-TK/GCV therapy on murine hepatoma cells.Cancer Biol Ther.2019；20(2):183-191.]。
近几年，为了体外模拟器管的复杂性，细胞培养方式也从传统的2D(2Dimension)培养到共培养(Co-culture)演变为类器官(Organoid)，尽管近几年类器官越来越成为研究的热点，但是依然无法规避其弊端，①由于类营养物质和氧气的被动扩散，使得类器官中心的细胞存活受到影响，所以类器官的大小被限制在几毫米之内；②越来越多的类器官被报道即便培养很久依然处于未成熟状态，类似于胚胎和胎儿组织，而非成年组织，对发育方面的了解受到限制[Lancaster M A,Renner M,Martin C A,Wenzel D,Bicknell L S,HurlesM E,Homfray T,Penninger J M,Jackson AP,Knoblich J A.Cerebral organoids modelhuman brain development and microcephaly[J].Nature,2013,501(7467):373-379.]；③操作复杂、培养成本高。而内皮细胞(Endothelial cells，EC)可能在克服上述局限性方面发挥关键作用[Garcia M D,Larina I V.Vascular development and hemodynamicforce in the mouse yolk sac[J].Front Physiol,2014,5(308).Dye B R,Dedhia P H,Miller AJ,Nagy M S,White E S,Shea L D,Spence J R.A bioengineered nichepromotes in vivo engraftment and maturation of pluripotent stem cell derivedhuman lung organoids[J].Elife,2016,5]。因此迫切需要建立一套可控的肝脏细胞培养新技术体系，在体外培养出具有较好功能的正常成熟肝细胞。
发明内容
本发明的目的在于建立一种肝前体细胞与内皮细胞共培养体系，该体系不需要基质胶，低血清，无需分化，培养周期短，它通过细胞间相互作用改善肝前体细胞的肝功能，从而提高急性肝损伤小鼠的生存率，进而为干细胞移植治疗肝损伤提供新的思路和替代治疗方案。
肝细胞与内皮细胞共培养早在2013年便被报道过，Takanori Takebe发现将iPSC与内皮细胞(HUVEC)和间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)共培养形成LiverBud，特定的肝细胞(用于追踪肝细胞命运的未成熟内胚层细胞)通过与内皮细胞和间充质细胞之间发生相互作用自组装成三维iPSC-LB，可以血管化，在培养中研究者分别使用了多潜能干细胞、内皮细胞、间充质干细胞的混合培养基，但是作者依然无法规避使用多潜能干细胞可能带来的临床前潜在风险[Takebe T,Sekine K,Enomura M,Koike H,Kimura M,Ogaeri T,Zhang R R,Ueno Y,Zheng Y W,Koike N,Aoyama S,Adachi Y,TaniguchiH.Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ budtransplant[J].Nature,2013,499(7459):481-484.]。尽管如此，Takebe的研究突出了体外生长的类器官胚芽具有治疗器官衰竭的巨大潜力。本发明在前人基础上建立了一种可以使肝前体细胞和内皮细胞共培养的低血清培养条件，不需要经过分化过程即可显著提高肝细胞功能，培养成本低、周期短、操作简单。
与我们的发明类似，近期研究发现小鼠肝血窦内皮细胞(LSEC)可以促进LPC改善肝细胞功能[Kim Y,Rajagopalan P.3D hepatic cultures simultaneously maintainprimary hepatocyte and liver sinusoidal endothelial cell phenotypes[J].PLoSOne,2010,5(11):e15456.]，并通过肝脏特异性导管系统产生肝胆类器官，但尚未探讨其机制[Yap K K,Gerrand Y W,Dingle AM,Yeoh G C,Morrison W A,Mitchell G M.Liversinusoidal endothelial cells promote the differentiation and survival ofmouse vascularised hepatobiliary organoids[J].Biomaterials,2020,251(120091).]。结合肝细胞，内皮细胞和Kuffer细胞可以模拟NAFLD在体外的进展[SuurmondC E,Lasli S,Van Den Dolder F W,Ung A,Kim H J,Bandaru P,Lee K,Cho H J,AhadianS,Ashammakhi N,Dokmeci M R,Lee J,Khademhosseini A.In Vitro Human Liver Modelof Nonalcoholic Steatohepatitis by Coculturing Hepatocytes,Endothelial Cells,and Kupffer Cells[J].Adv Healthc Mater,2019,8(24):e1901379.]，进一步揭示了共培养的广阔前景[Kostadinova R,Boess F,Applegate D,Suter L,Weiser T,Singer T,Naughton B,Roth A.A long-term three dimensional liver co-culture system forimproved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity[J].Toxicol Appl Pharmacol,2013,268(1):1-16.Lubberstedt M,Muller-Vieira U,BiemelK M,Darnell M,Hoffmann S A,Knospel F,Wonne E C,Knobeloch D,Nussler A K,Gerlach J C,Andersson T B,Zeilinger K.Serum-free culture of primary humanhepatocytes in a miniaturized hollow-fibre membrane bioreactor forpharmacological in vitro studies[J].J Tissue Eng Regen Med,2015,9(9):1017-1026.]。人们已经充分认识到，与内皮细胞的共培养物可以保持肝细胞良好的分化潜能并且功能相对稳定，从而提高肝脏的特异性功能。但是，具体机制未明。至今仍没有有关人源3D共培养系统中肝向分化的机制研究。基于此，我们从hepLPCs或hepLPCs+HUVEC 1：1(称为vhepLPCs)建立无基质胶和低FBS的3D培养系统。我们将阐明细胞间相互作用机制，以掌握肝细胞成熟的关键机制。为肝前体细胞工程化应用奠定基础。
本发明在前期基础上[Zhenyu Wang,Weijian Li,Hongshu Jing,Ming Ding,Gongbo Fu,Tianjie Yuan,Weijian Huang,Mengjun Dai,Dan Tang,Min Zeng,Yi Chen,Hongdan Zhang,Xuejing Zhu,Yuan Peng,Qigen Li,Wei-Feng Yu,He-Xin Yan,BoZhai.Generation of hepatic spheroids using human hepatocyte-derived liverprogenitor-like cells for hepatotoxicity screening.Theranostics.2019 Sep 18；9(22):6690-6705.Wei-Jian Li,Xue-Jing Zhu,Tian-Jie Yuan,Zhen-Yu Wang,Zheng-QianBian,Hong-Shu Jing,Xiao Shi,Cai-Yang Chen,Gong-Bo Fu,Wei-Jian Huang,Yao-PingShi,Qian Liu,Min Zeng,Hong-Dan Zhang,Hong-Ping Wu,Wei-Feng Yu,Bo Zhai,He-XinYan.An extracorporeal bioartificial liver embedded with 3D-layered humanliver progenitor-like cells relieves acute liver failure in pigs.Sci TranslMed.2020 Jul 8；12(551):eaba5146.]，建立人肝前体细胞与内皮细胞共培养体系，形成vhepLPCs spheroids，我们发现共培养后vhepLPCs的肝功能明显提升，从基因水平、蛋白水平、功能实验多方面进行了验证；同时发现vhepLPCs可以显著提高急性肝损伤小鼠的生存曲线，海藻酸盐微囊包被后小鼠的生存率可以达到90％以上。常规的细胞移植方法包括脾脏移植、门静脉移植，不可避免的由于手术会造成出血风险。藻酸盐是一种保护肝细胞免受宿主侵害的生物惰性材料。采用海藻酸盐微囊包被后，一方面避免免疫排斥，另一方面可以使细胞自由通过底物和蛋白间，为细胞治疗提供新的策略。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种人肝前体细胞与内皮细胞共培养培养基，是以Advance DMEM/F12作为基础培养基，添加1×B27 supplement(Gibco)、1×L-谷氨酰胺的试剂(如GlutaMAX-I)、1×pH调节剂(HEPES)、1×原代细胞抗生素(如0.1mg/ml primocin)以及1×青霉素-链霉素，同时添加1-20mM烟酰胺、1-10mM N-乙酰半胱氨酸、小分子化合物1-50ng/ml HGF、1-100ng/ml EGF、1-10μM CHIR-99021、0.1-20μM Y27632、300-700nM TGF-β抑制剂A8301、1-100mg/ml维生素C、1-10ng/ml OSM；额外加入1-20ng/ml VEGF、1-20ng/mlFGF10、0.1-10％FBS(Corning)。
进一步优选的，所述的人肝前体细胞与内皮细胞共培养培养基，是以AdvanceDMEM/F12作为基础培养基，添加1×B27 supplement(Gibco)、1×L-谷氨酰胺的试剂(如GlutaMAX-I)、1×pH调节剂(HEPES)、1×原代细胞抗生素(如0.1mg/ml primocin)以及1×青霉素-链霉素，同时添加10mM烟酰胺、1.56mM N-乙酰半胱氨酸、小分子化合物25ng/mlHGF、50ng/ml EGF、3μM CHIR-99021、10μM Y27632、500nM TGF-β抑制剂A8301、50mg/ml维生素C、2ng/ml OSM；额外加入10ng/ml VEGF、10ng/ml FGF10、1％FBS(Corning)。
进一步的，所述的基础培养基Advance DMEM/F12为商品化培养基：Invitrogen，12634-034。
本发明的第二方面，提供一种人肝前体细胞与内皮细胞共培养方法，包括以下步骤：
将生长至对数期的肝前体细胞与内皮细胞分别用Tryple消化计数，以1：1的数量比按2*105细胞密度接种到低黏附6孔板中，加入新鲜的如上所述的人肝前体细胞与内皮细胞共培养培养基3ml(modified co-culture medium，改良共培养培养基)；培养过程中细胞逐渐聚团，形成肝细胞球(spheroids)，进而转变为低增殖状态，培养5天。
本发明的第三方面，提供一种采用如上所述的共培养方法共培养得到的肝细胞球。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的共培养得到的肝细胞球在制备急性肝损伤治疗药物中的应用。
进一步的，所述的急性肝损伤治疗药物为细胞治疗药物。
本发明的第五方面，提供一种微囊化制剂，所述的微囊化制剂是指采用海藻酸盐微囊包被如上所述的人肝前体细胞与内皮细胞共培养得到的肝细胞球。
进一步的，所述的微囊化制剂的制备方法为：收集如上所述的共培养得到的肝细胞球至离心管内，弃上清后重悬于适量体积的海藻酸钠溶液(2*106/ml)，尽量避免产生气泡；将细胞-海藻酸钠混合液装载至注射器泵，开启静电液滴发生仪，调节泵速，制备海藻酸钠胶珠，并滴入含100mmol/的氯化钙溶液的烧杯内进行充分钙化20分钟；转移海藻酸钙胶珠至50ml离心管，加入5倍胶珠体积的PLL溶液，室温下振荡成膜5-8分钟；用0.9％氯化钠充分洗涤微胶囊3次，再加入约8倍体积的柠檬酸钠溶液液化胶珠2-5分钟；上述液化后胶珠经洗涤后，需再用0.15％海藻酸钠溶液处理约10分钟，充分洗涤后可直接用于体内移植。
本发明的第六方面，提供一种如上所述的微囊化制剂在制备急性肝损伤治疗药物中的应用。
本发明优点在于：
本发明首次建立无基质胶、低血清共培养方式培养肝前体细胞与内皮细胞spheroids，发现共培养之后可以明显提高肝细胞功能，并且海藻酸微囊包被vhepLPCsspheroids可以明显提高急性肝损伤小鼠的生存时间，对于推进细胞治疗提供新的策略。
附图说明
图1：肝前体细胞hepLPCs安全性鉴定；A：hepLPCs经过慢病毒介导转染HSV-TK/GCV自杀系统，GCV处理48h可以明显抑制细胞活力，成剂量依赖性；B：GCV处理48h后，q-PCR检测凋亡相关标志物CASP3，BCL-2表达，与对照组相比实验组表达明显升高；C：转染GFP的肝前体细胞，经GCV处理发现明显抑制细胞活力；D：将高密度肝前体细胞hepLPCs接种到NSG小鼠皮下，实验组腹腔注射50mg/kg GCV，5天后取材、包埋，镜下观察细胞活力变化，可以发现与对照组相比，GCV处理后活细胞比例明显减少，生理盐水作为对照，每组小鼠均大于3只。
图2：肝前体细胞与内皮细胞无基质胶、低血清共培养体系的建立；A：2D单层培养hepLPCs、3D单独hepLPCs spheroids、3D hepLPCs与HUVEC共培养vhepLPCs spheroids、2D单层分化14天hepLPCs 4种状态下细胞形态变化，bars：100μm；B：q-PCR检测肝功能相关标志物ALB，HNF4A表达，共培养vhepLPCs中ALB和HNF4A的表达明显高于其余三组；C：将hepLPCs和vhepLPCs spheroids进行糖原染色，鉴定培养的细胞糖原累积的能力，bars：20μm；D：将hepLPCs和vhepLPCs spheroids进行油红染色，鉴定细胞脂质代谢的能力，bars：20μm；E：hepLPCs和vhepLPCs可以吸入靛青紫，说明spheroids具有良好的肝功能，bars：20μm。
图3：共培养可以促进肝细胞成熟；A：首先确定在共培养条件下内皮细胞能够在低血清条件下存活，因此通过q-PCR检测内皮细胞标志物VEGFA的表达情况，发现共培养后VEGFA表达明显升高；B：WB检测hepLPCs和vhepLPCs spheroids CD31的表达，发现共培养后，CD31的表达明显升高；C：IF进一步验证，发现共培养后表达ALB的spheroids中也部分表达CD31，说明两种细胞在该培养体系中发生了相互作用，bars：100μm；D：q-PCR检测hepLPCs和vhepLPCs spheroids肝功能标志物ALB，CYP3A4的表达情况，发现共培养之后，肝功能标志物表达明显升高；E：蛋白水平进一步验证；F：免疫荧光结果显示，单独的hepLPCsspheroids部分表达肝细胞标志物，而共培养后几乎所有的spheroids均表达Albumin、CYP3A4、HNF4A，bars：100μm。
图4：微囊化vhepLPCs spheroids可以显著提升急性肝损伤小鼠的生存率；A：将活力较好的hepLPCs/vhepLPCs spheroids按照一定密度包裹在海藻酸盐微囊中，明场下显示包被效率＞50％，bars：100μm；B：包被后的海藻酸盐微囊进行活力检测，Calcein-AM/EthD-1染色结果显示细胞活力＞90％；C：CCL4处理NSG小鼠诱导急性肝性损伤，次日移植微囊化的spheroids进行治疗，7天以内每日称重、眼眶静脉采血、记录小鼠生存状况，根据小鼠存活时间绘制生存曲线，结果显示vhepLPCs spheroids 7日生存率为90.9％，明显高于hepLPCs spheroids 70％和对照组16.7％；D：术后第二天，剖开小鼠腹腔发现，实验组微囊均富集在肝脏周围；E：ALT、AST检测显示，移植前(-1)，ALT、AST均处于比较低的水平，移植当天(0)小鼠均处于明显损伤状态，术后第一天(1)，治疗组较对照，ALT、AST均有明显降低，3天以后三组之间便没有明显差异；F：组织学染色结果显示，对照组有明显肝损伤，而治疗组小鼠肝脏形态完整。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
一、实验材料
本发明所用的B27无血清添加剂购于源培生物有限公司；N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine)、烟酰胺(Nicotinamide)、维生素C购于Sigma-Aldrich；重组蛋白肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和上皮生长因子(FGF10)购于Peprotech公司；小分子化合物Rock抑制剂(Y-27632)、TGF-β抑制剂(A-83-01)购于陶素生化；抑瘤素M(OSM)、GSK3β抑制剂(CHIR99021)购于TargetMol公司；所用肝前体细胞来源于课题组之前建立的永生化细胞系(Zhenyu Wang,Weijian Li,Hongshu Jing,MingDing,Gongbo Fu,Tianjie Yuan,Weijian Huang,Mengjun Dai,Dan Tang,Min Zeng,YiChen,Hongdan Zhang,Xuejing Zhu,Yuan Peng,Qigen Li,Wei-Feng Yu,He-Xin Yan,BoZhai.Generation of hepatic spheroids using human hepatocyte-derived liverprogenitor-like cells for hepatotoxicity screening.Theranostics.2019Sep 18；9(22):6690-6705.Wei-Jian Li,Xue-Jing Zhu,Tian-Jie Yuan,Zhen-Yu Wang,Zheng-QianBian,Hong-Shu Jing,Xiao Shi,Cai-Yang Chen,Gong-Bo Fu,Wei-Jian Huang,Yao-PingShi,Qian Liu,Min Zeng,Hong-Dan Zhang,Hong-Ping Wu,Wei-Feng Yu,Bo Zhai,He-XinYan.An extracorporeal bioartificial liver embedded with 3D-layered humanliver progenitor-like cells relieves acute liver failure in pigs.Sci TranslMed.2020Jul 8；12(551):eaba5146.)，并使用特定的细胞培养基(即TEM增殖培养基)培养(Zhenyu Wang,Weijian Li,Hongshu Jing,Ming Ding,Gongbo Fu,Tianjie Yuan,WeijianHuang,Mengjun Dai,Dan Tang,Min Zeng,Yi Chen,Hongdan Zhang,Xuejing Zhu,YuanPeng,Qigen Li,Wei-Feng Yu,He-Xin Yan,Bo Zhai.Generation of hepatic spheroidsusing human hepatocyte-derived liver progenitor-like cells for hepatotoxicityscreening.Theranostics.2019 Sep 18；9(22):6690-6705.Wei-Jian Li,Xue-Jing Zhu,Tian-Jie Yuan,Zhen-Yu Wang,Zheng-Qian Bian,Hong-Shu Jing,Xiao Shi,Cai-YangChen,Gong-Bo Fu,Wei-Jian Huang,Yao-Ping Shi,Qian Liu,Min Zeng,Hong-Dan Zhang,Hong-Ping Wu,Wei-Feng Yu,Bo Zhai,He-Xin Yan.An extracorporeal bioartificialliver embedded with 3D-layered human liver progenitor-like cells relievesacute liver failure in pigs.Sci Transl Med.2020 Jul 8；12(551):eaba5146.)；GCV购于TargetMol公司；Advance DMEM培养基购于Gibco公司；青霉素与链霉素双联合抗生素购买自博锐生物医药公司；原代细胞抗生素primocin购于Invivogen；Hepes溶液和GlutMax溶液购于上海源培生物公司；用于细胞的冲洗及重悬所用PBS缓冲液(Phosphate BufferSolution)和Tryple购于Gibco公司；用于2D肝前体细胞实验所用的培养基Dulbecco’smodified Eagle medium(DMEM)购于Gibco公司；胎牛血清(FBS)购于Corning公司；用于细胞培养的低黏附孔板购于Corning公司；气麻装置购于玉研生物。
静电液滴发生器(YD-06)、注射器泵(razel a99)、万向摇床、升降台、烧杯、铁丝圈、注射器、金属长针头、金属短针头；1.5％纯化海藻酸钠、0.15％纯化海藻酸钠、100mmol/L氯化钙、0.9％氯化钠、0.05％(W/V)多聚赖氨酸(PLL)、55mmol/L柠檬酸钠。
二、实验方法
本发明采用Graphpad7生物统计软件对相应的实验数据进行分析，采用双尾非配对t检验和one-way ANOVA方差分析比较两组或多组不同处理之间的差异。所有的统计数据，至少使用了三个独立的样品或重复实验的数据，数据均以means±s.e.m.的形式表示，其中ns为无显着性，*P<0.05被认为存在统计学差异，其中**，P<0.01，***，P<0.0001。
1、肝前体细胞无血清3D培养体系的建立：
将生长至对数期的肝前体细胞用Tryple消化计数，按2*105每孔接种到低黏附6孔板中，加入新鲜modified medium 3ml，具体成分为Advance DMEM/F12作为基础培养基，添加1×B27 supplement(Gibco)、1×L-谷氨酰胺的试剂(如GlutaMAX-I)、1×pH调节剂(HEPES)、1×原代细胞抗生素(如0.1mg/ml primocin)以及1×青霉素-链霉素，同时添加10mM烟酰胺、1.56mM N-乙酰半胱氨酸、小分子化合物25ng/ml HGF、50ng/ml EGF、3μMCHIR-99021、10μM Y27632、500nM TGF-β抑制剂A8301、50mg/ml维生素C、2ng/ml OSM。培养过程中细胞逐渐聚团，形成spheroids，进而转变为低增殖状态。培养5天即可取样进行相关细胞学实验。
2.肝前体细胞与内皮细胞共培养体系的建立：
将生长至对数期的肝前体细胞与内皮细胞分别用Tryple消化计数，以1：1的数量比按2*105细胞密度接种到低黏附6孔板中，加入新鲜modified co-culture medium 3ml，具体成分为Advance DMEM/F12作为基础培养基，1×B27 supplement(Gibco)、1×L-谷氨酰胺的试剂(如GlutaMAX-I)、1×pH调节剂(HEPES)、1×原代细胞抗生素(如0.1mg/mlprimocin)以及1×青霉素-链霉素，同时添加10mM烟酰胺、1.56mM N-乙酰半胱氨酸、小分子化合物25ng/ml HGF、50ng/ml EGF、3μM CHIR-99021、10μM Y27632、500nM TGF-β抑制剂A8301、50mg/ml维生素C、2ng/ml OSM。考虑到内皮细胞生长条件因此额外加入10ng/mlVEGF、10ng/ml FGF10、1％FBS(Corning)。培养过程中细胞逐渐聚团，形成spheroids，进而转变为低增殖状态。培养5天即可取样进行相关细胞学实验。
3.肝功能实验验证：
将收取的hepLPCs/vhepLPCs spheroids加入Trizol提取总RNA即可进行相关转录组学鉴定；将hepLPCs/vhepLPCs spheroids加入蛋白裂解液后可进行肝功能相关标志物的检测，如Albumin、CYP3A4；功能方面可进行油红染色、PAS染色、ICG吸入、免疫荧光染色等。
4.急性肝损伤小鼠造模
实验中所使用的6-8周，体重约为18-20g的雄性野生型NSG小鼠从购于南京模式动物研究中心并在南方模式动物房进行实验。CCL4用量为10ml/kg，与橄榄油以1:9的比例配好置于常温暗处放置备用。小鼠随机分为3组，每组11只，腹腔注射CCL4 200μl，次日进行细胞移植。
5.hepLPCs/vhepLPCs spheroids微囊化和移植
收集hepLPCs/vhepLPCs spheroids至离心管内，弃上清后重悬于适量体积(2*106/ml)的海藻酸钠溶液(山东明月)，尽量避免产生气泡。将细胞-Alginate混合液装载至注射器泵，开启静电液滴发生仪，调节泵速，制备海藻酸钠胶珠，并滴入含100mmol/的氯化钙溶液的烧杯内进行充分钙化20分钟。转移海藻酸钙胶珠至50ml离心管，加入5倍胶珠体积的PLL溶液，室温下振荡成膜5-8分钟。用0.9％氯化钠充分洗涤微胶囊3次，再加入约8倍体积的柠檬酸钠溶液液化胶珠2-5分钟。因后续要进行体内移植试验，上述液化后胶珠经洗涤后，需再用0.15％海藻酸钠溶液处理约10分钟已完成中和，充分洗涤后可直接用于体内移植。通过腹腔注射即可，每只小鼠100μl。空微囊作为对照。
6.免疫组化：
免疫组织切片放置于60℃烘烤60分钟后，二甲苯I,II,III每次5min脱蜡，100％，100％，95％，75％乙醇每次5min脱水，结束后放置于双蒸水浸泡5分钟。然后取出组织切片进行抗原修复：0.01M柠檬酸缓冲液中煮沸15min；自然冷却至室温。后阻断内源过氧化物酶活性，3％H2O2 15min。后双蒸水浸泡清洗3次，接着用将山羊血清封闭(5％Goat serum inPBS)1h，提高抗体特异性。然后根据抗体说明书稀释抗体，小心滴加到切片上至完全覆盖，置于4℃孵育过夜。次日从4℃冰箱取出组织切片，为防止温度骤变脱片，置于室温下约20-30分钟后，PBST重复洗3次。滴加与一抗种属来源一致的二抗，1:200(2％BSA in PBS)，室温30min(湿盒抚育)。PBST洗过后，DAB显色1-10min，现配先用。见组织部分呈现砖红色即可终止反应。注意时间不宜超过10分钟，防止假阳性。进一步用双蒸水清洗2次后，将切片放入苏木素溶液中染色。2分钟后在放入盐酸乙醇分化液前，用流水洗去多余苏木素，切片放置于分化液约1至2s后即可取出，至自来水通过流水返蓝5分钟，重新脱水，中性树脂封片，待风干后可在镜下观察。
三、实验结果：
1.肝前体细胞的稳定性鉴定
在本发明中，我们团队的肝前体细胞前期经过慢病毒介导的HPV E6/E7系统构建成永生化的hepLPCs。同时我们在hepLPCs中引入HSV-TK/GCV自杀体系。为了对其安全性进行验证，我们使用gancyclovir(GCV)进行处理，发现体外处理48h后，可以明显抑制hepLPCs的活力(图1A)。基因表达显示凋亡的标志物CASP3，BCL-2的表达明显升高(图1B)。采用慢病毒荧光标记系统转染HepLPCs，使其带上GFP荧光蛋白(GFP-HepLPCs)，有利于示踪体内变化，同时通过流式分选GFP阳性细胞后扩增建立GFP-HepLPCs细胞系。经GCV处理也可以明显发现细胞明显死亡(图1C)。将5*106移植到NSG免疫缺陷鼠皮下，按50mg/kg腹腔注射GCV，5天后取材，镜下发现GFP阳性细胞实验组比对照明显减少(图1D)。
2.建立肝前体细胞与内皮细胞共培养体系
为了获得结构相对复杂、肝细胞功能较好培养条件，首先本发明比较了传统2D培养、3D悬浮式培养、肝前体细胞与内皮细胞3D共培养、2D分化14天后细胞形态间差异，发现细胞均呈现良好的状态，在3D低血清情况下，肝前体细胞与内皮细胞共培养依然保持良好的细胞活力(图2A)。取出适量细胞进行总RNA抽提，逆转录为cDNA，通过qPCR进行成熟肝细胞功能基因检测，发现3D共培养比其余三组肝功能标志物ALB、HNF4A表达高(图2B)。油红染色、糖原染色、靛青紫吸入实验均显示vhepLPCs spheroids具有良好的细胞功能(图2C，D，E)。
3.共培养之后促进肝细胞成熟
本发明在培养过程中，我们发现，共培养vhepLPCs可以促进肝细胞成熟。首先我们确认在无基质胶、低血清共培养体系中内皮细胞可以存活，通过基因表达和蛋白水平进行了验证(图3A，B)，免疫荧光进一步佐证了实验结果(图3C)在。然后本发明通过转录水平检测发现vhepLPCs肝相关标志物ALB，CYP3A4的表达水平明显升高(图3D)，三次不同批次蛋白进一步验证，共培养之后Albumin和CYP3A4表达明显提高(图3E)。免疫荧光结果与蛋白水平一致，单独的hepLPCs spheroids部分表达肝细胞标志物，共培养后Albumin，CYP3A4，HNF4A的表达均一性明显变好(图3F)。
4.共培养之后可以明显改善急性肝损伤小鼠的生存率
本发明为深入对vhepLPCs spheroids功能做出评价，考虑到门静脉移植、脾脏移植会造成凝血风险，本发明将hepLPCs spheroids和vhepLPCs spheroids包被在海藻酸盐微囊中，藻酸盐是一种保护肝细胞免受宿主侵害的生物惰性材料。保护细胞免受宿主的免疫排斥自由穿梭于底物和蛋白之间。微囊包被效率大于50％(图4A)。包被后进行细胞活力检测，Calcein-AM/EthD-1染色结果显示细胞活力良好(图4B)。为了验证体内疗效，本发明构建了CCL4诱导的急性肝损伤小鼠，次日通过腹腔注射1*106细胞，术后每天称重、眼眶静脉采血、记录小鼠生存状况。绘制生存曲线如图4C所示，发现vhepLPCs组小鼠的7日生存率达90.9％，明显高于单独hepLPCs 70％和对照组16.7％，其中三日生存率，vhepLPCs组更是高达100％，与对照组有明显差异。剖开小鼠腹腔可以看到，实验组微囊明显富集在肝脏周围，而对照组则比较弥散(图4D)。血液指标检测显示，实验组在术后第一天ALT，AST明显低于对照组(图4E)。组织学染色结果显示，对照组有明显组织坏死，实验组组织形态相对完整(图4F)。综上，海藻酸盐微囊包被的vhepLPCs spheroids可以显著提高急性肝损伤小鼠的生存率，为干细胞移植治疗肝损伤提供新的思路和替代治疗方案。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。