一种同时靶向cd19和bcma的双靶点嵌合抗原受体及其应用
阅读说明：本技术 一种同时靶向cd19和bcma的双靶点嵌合抗原受体及其应用 (Double-target chimeric antigen receptor for simultaneously targeting CD19 and BCMA and application thereof ) 是由 姜钰超 王苗苗 缪佳 刘根桃 吴国祥 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体及编码其的核苷酸和其应用。该多核苷酸的序列为含依次连接的靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列、连接肽的编码序列和靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列的多核苷酸序列或其互补序列。本发明提供的表达同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体中靶向BCMA的CAR结构与靶向CD19的CAR结构完全独立并以只切割肽串联,促使BCMA靶点和CD19靶点对CAR-T细胞信号传导的作用更独立、更有效,此外,表达该双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19和BCMA双阳靶细胞更有效的杀伤,防止因靶点丢失导致的疾病进展,提高了治疗CD19和BCMA介导的疾病(特别是多发性骨髓瘤)的潜在疗效。(The invention provides a double-target chimeric antigen receptor for simultaneously targeting CD19 and BCMA, a nucleotide for encoding the same and application thereof. The sequence of the polynucleotide is a polynucleotide sequence containing a coding sequence of the chimeric antigen receptor targeting CD19, a coding sequence of the connecting peptide and a coding sequence of the chimeric antigen receptor targeting BCMA which are connected in sequence or a complementary sequence thereof. The BCMA-targeted CAR structure and the CD 19-targeted CAR structure in the double-target chimeric antigen receptor expressing the CD19 and the BCMA simultaneously are completely independent and are connected in series only by the cleavage peptide, so that the effects of the BCMA target and the CD19 target on CAR-T cell signaling are more independent and more effective, in addition, the T cell expressing the double-target chimeric antigen receptor can kill CD19 and BCMA double-positive target cells more effectively, the disease progression caused by target loss is prevented, and the potential curative effect of treating CD19 and BCMA-mediated diseases (particularly multiple myeloma) is improved.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤是一种恶性浆细胞疾病，表现为骨髓浆细胞恶性克隆性增生，分泌单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，导致骨骼、肾脏等相关靶器官或组织损伤，常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全、感染等[N Engl J Med,2011.364(11):p.1046-60.]。目前多发性骨髓瘤为血液系统第二大恶性肿瘤，占血液系统恶性肿瘤的10％，多发病于男性，其发病率随着年龄的增长逐年增高，近几年更是有年轻化的趋势[CA CancerJ Clin,2014.64(1):p.9-29.]。
B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)，又称CD269，由184个氨基酸残基组成，其胞内区含80个氨基酸残基，胞外区序列很短，只有一个糖类识别结构域，为B细胞表面分子。BCMA属于缺少信号肽的I型跨膜信号蛋白，是肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)一员，它可分别与B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体(aproliferation induced ligand，APRIL)两种配体相结合[Curr Opin Struct Biol,2004.14(2):p.154-60.]。在正常组织中，BCMA表达于成熟B细胞和浆细胞表面，BCMA基因剔除小鼠免疫系统表现正常，有正常的脾结构，B淋巴细胞的发育正常，但浆细胞数量明显减少，证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用，其机制主要包括BCMA-BAFF蛋白结合，并上调抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，维持细胞生长[J Exp Med,2004.199(1):p.91-8.]。同样地，该机制也在骨髓瘤细胞中发挥了功能，对骨髓瘤细胞的恶性增生起了重要的促进作用[Blood,2004.103(8):p.3148-57.]。研究表明，BCMA普遍表达于多发性骨髓瘤细胞系，在多发性骨髓瘤患者中的检测也得到了一致性的结果[Blood,2004.103(2):p.689-94.]。Kochenderfer等在已有报道的基础上，又联合应用Q-PCR、流式细胞术和免疫组化方法深入研究了BCMA的表达特征，确认BCMA在成熟B细胞、浆细胞之外的正常人体组织无表达，且在CD34+造血细胞中也无表达[Clin Cancer Res,2013.19(8):p.2048-60.]。结合BCMA表达特征与CD19的高度相似性，以及抗CD19 CAR-T细胞治疗的成功进展，表明BCMA可以作为CAR-T细胞的靶点之一用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗。
CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。虽然多发性骨髓瘤作为B细胞系肿瘤通常不表达CD19，因此过去观念中CD19不是多发性骨髓瘤免疫治疗的首选靶标。2015年9月，Carl June研究小组在新英格兰杂志发表了使用CD19分子靶向CAR-T细胞疗法成功治疗1例复发难治多发性骨髓瘤(MM)患者的文章[NEJM,2015.373(11):p.1040-7.]。也有报道指出微量的具有耐药性及疾病复发特性的多发性骨髓瘤克隆具有B细胞表型(即CD19阳性)。最近有一些最新研究表明，通常认为不表达CD19的骨髓瘤细胞表面也存在极低密度的CD19表达(低于100分子每细胞)，这种低密度的CD19表达无法用常规检测手段测出，但这些细胞仍然可以被抗CD19 CAR-T杀伤，这也可能是针对CD19的CAR-T细胞能治疗骨髓瘤的证据之一[Nat Commun,2019.10(1):p.3137.]。
生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
在明确BCMA可作为CAR-T细胞的靶点后，美国国家癌症研究院Kochenderfer等成功构建了抗BCMA CAR-T细胞，并在临床前研究表明该CAR-T细胞特异性地识别BCMA，并在被BCMA激活后大量扩增、分泌细胞因子并发挥杀伤功能，在小鼠成瘤模型中也具有抗肿瘤效应[Clin Cancer Res,2013.19(8):p.2048-60.]。2014年美国国家癌症研究院开展抗BCMACAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤的I期临床研究，针对现今标准治疗方案无反应的多发性骨髓瘤患者，验证抗BCMA CAR-T细胞的临床安全性和有效性(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT02215967)。随后大量中外的靶向BCMA靶点的CAR-T临床研究也展示出了令人振奋的临床效果。鉴于BCMA靶点和CD19靶点均已得到了充分的临床验证，同时靶向BCMA和CD19的双靶点嵌合抗原受体可以显著增加治疗效果，但目前未有相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体及其应用。表达该双靶点嵌合抗原受体的的T细胞在体外对靶点阳性的肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，CD107a表达和IFNγ分泌较高，在效靶比5:1的情况下对MM.1s骨髓瘤细胞杀伤效率高于90％，在效靶比10:1的情况下对Raji淋巴瘤细胞杀伤效率高于90％。体内实验方面，利用NSG小鼠静脉注射H929骨髓瘤细胞构建的骨髓瘤模型，双靶点嵌合抗原受体T细胞可以显著抑制多发性骨髓瘤细胞H929在免疫缺陷小鼠体内的增殖，显著延长小鼠生存周期。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多核苷酸；该多核苷酸的序列为含依次连接的靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列、连接肽的编码序列和靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列的多核苷酸序列或其互补序列。
进一步地，上述靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列包括抗CD19单链抗体的编码序列；该抗CD19单链抗体的编码序列为SEQ ID NO.2。
进一步地，上述靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列包括抗BCMA单域抗体的编码序列；该抗BCMA单域抗体的编码序列选自SEQ ID NO.9～12。
进一步地，上述连接肽为T2A自切割肽；该T2A自切割肽的编码序列为SEQ IDNO.7。
进一步地，上述靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列包含依次连接的CD8信号肽的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、CD8铰链区的编码序列、CD8跨膜区的编码序列、41BB胞内区的编码序列和CD3ζ胞内区的编码序列。
进一步地，上述CD8信号肽的编码序列为SEQ ID NO.1；上述抗CD19单链抗体的编码序列为SEQ ID NO.2；上述CD8铰链区的编码序列为SEQ ID NO.3；上述CD8跨膜区的编码序列为SEQ ID NO.4；上述41BB胞内区的编码序列为SEQ ID NO.5；上述CD3ζ胞内区的编码序列为SEQ ID NO.6。
进一步地，上述靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列含依次连接的GMCSFR信号肽的编码序列、抗BCMA单域抗体的编码序列、CD28铰链区的编码序列、CD28跨膜区的编码序列、CD28胞内区的编码序列和CD3ζ胞内区的编码序列。
进一步地，上述GMCSFR信号肽的编码序列为SEQ ID NO.8；上述抗BCMA单域抗体的编码序列选自SEQ ID NO.9～12；上述CD28铰链区的编码序列为SEQ ID NO.13；上述CD28跨膜区的编码序列为SEQ ID NO.14；上述CD28胞内区的编码序列为SEQ ID NO.15；上述CD3ζ胞内区的编码序列为SEQ ID NO.6。
第二方面，本发明提供了如第一方面提供的多核苷酸编码的同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体；该双靶点嵌合抗原受体选自：
(1)含有依次连接的CD8信号肽、抗CD19单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、41BB胞内区、CD3ζ胞内区、T2A自切割肽、GMCSFR信号肽、抗BCMA单域抗体、CD28铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内区、CD3ζ胞内区的融合蛋白；和
(2)在(1)限定的融合蛋白的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。
进一步地，上述CD8信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；上述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.17；上述CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.18；上述CD8跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO.19；上述41BB胞内区的氨基酸序列为SEQ IDNO.20；上述CD3ζ胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO.21；上述T2A自切割肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.22；上述GMCSFR信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.23；上述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自SEQ ID NO.24～27；上述CD28铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.28；上述CD28跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO.29；上述CD28胞内区的氨基酸序列为SEQ IDNO.30。
第三方面，本发明提供了一种含有如第一方面提供的多核苷酸的载体。
进一步地，上述载体为慢病毒载体，其还含有复制起始位点，3’LTR(longterminal repeat，长末端重复序列)和5’LTR。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有如第一方面提供的多核苷酸或表达如第二方面提供的双靶点嵌合抗原受体。
进一步地，上述宿主细胞为T细胞。
第五方面，本发明提供了含有如第四方面提供的宿主细胞的生物制剂。
第六方面，本发明提供了如第一方面提供的多核苷酸、第二方面提供的双靶点嵌合抗原受体、第三方面提供的载体、第四方面提供的宿主细胞或第五方面提供的生物制剂在制备治疗CD19和BCMA介导的疾病的药物中的应用。
进一步地，上述CD19和BCMA介导的疾病包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
进一步地，上述CD19和BCMA介导的疾病包括多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的表达同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体中靶向BCMA的CAR结构与靶向CD19的CAR结构完全独立并以只切割肽串联，促使BCMA靶点和CD19靶点对CAR-T细胞信号传导的作用更独立、更有效，此外，表达该双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19和BCMA双阳靶细胞更有效的杀伤，防止因靶点丢失导致的疾病进展，提高了治疗CD19和BCMA介导的疾病(特别是多发性骨髓瘤)的潜在疗效。
附图说明
图1是本发明一实施例中KQ-19B CAR慢病毒载体(pLenti7.3-scFv-BBz-VHH-28Z)的结构示意图；
图2是本发明一实施例中KQ-19B CAR元件示意图；
图3是本发明一实施例中各靶细胞表面CD19和BCMA表达情况的流式分析结果图；
图4为本发明一实施例中KQ-19B CAR-T细胞的CAR结构识别CD19和BCMA双阳性肿瘤细胞示意图；
图5是本发明一实施例中KQ-19B-T阳性率的检测结果；
图6是本发明一实施例中KQ-19B-T在体外有效杀伤BCMA和CD19阳性肿瘤细胞的结果图；
图7是本发明一实施例中KQ-19B-T在体外与靶细胞共孵育分泌细胞因子的结果图；
图8是本发明一实施例中KQ-19B-T在体外与多种靶细胞共孵育使CD107a高表达的结果图；
图9显示了本发明一实施例中体内药效D0时间点分两组的依据；
图10是本发明一实施例中KQ-19B-T在骨髓瘤(H929)模型NSG小鼠中的药效结果图；
图11是本发明一实施例中骨髓瘤(H929)模型NSG小鼠的体重变化曲线图；
图12是本发明一实施例中骨髓瘤(H929)模型NSG小鼠的生存曲线。
具体实施方式
本发明一种同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体及编码其的核苷酸和应用。
具体地，该多核苷酸的序列为含依次连接的靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列、连接肽的编码序列和靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列的多核苷酸序列或其互补序列。
在本发明一优选的实施方式中，靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列包括抗CD19单链抗体的编码序列，该抗CD19单链抗体的编码序列为SEQ ID NO.2；上述靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列包括抗BCMA单域抗体的编码序列；该抗BCMA单域抗体的编码序列选自SEQ ID NO.9～12；上述连接肽为T2A自切割肽；该T2A自切割肽的编码序列为SEQ ID NO.7。
在本发明一优选的实施方式中，上述靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列包含依次连接的CD8信号肽的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、CD8铰链区的编码序列、CD8跨膜区的编码序列、41BB胞内区的编码序列和CD3ζ胞内区的编码序列。更优选地，上述CD8信号肽的编码序列为SEQ ID NO.1；上述抗CD19单链抗体的编码序列为SEQ ID NO.2；上述CD8铰链区的编码序列为SEQ ID NO.3；上述CD8跨膜区的编码序列为SEQ ID NO.4；上述41BB胞内区的编码序列为SEQ ID NO.5；上述CD3ζ胞内区的编码序列为SEQ ID NO.6。
在本发明一优选的实施方式中，上述靶向BCMA的嵌合抗原受体的编码序列含依次连接的GMCSFR信号肽的编码序列、抗BCMA单域抗体的编码序列、CD28铰链区的编码序列、CD28跨膜区的编码序列、CD28胞内区的编码序列和CD3ζ胞内区的编码序列。更优选地，上述GMCSFR信号肽的编码序列为SEQ ID NO.8；上述抗BCMA单域抗体的编码序列选自SEQ IDNO.9～12；上述CD28铰链区的编码序列为SEQ ID NO.13；上述CD28跨膜区的编码序列为SEQID NO.14；上述CD28胞内区的编码序列为SEQ ID NO.15；上述CD3ζ胞内区的编码序列为SEQID NO.6。
上述同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体，为上述多核苷酸编码的融合蛋白，选自：
(1)含有依次连接的CD8信号肽、抗CD19单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、41BB胞内区、CD3ζ胞内区、T2A自切割肽、GMCSFR信号肽、抗BCMA单域抗体、CD28铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内区、CD3ζ胞内区的融合蛋白；和
(2)在(1)限定的融合蛋白的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。
在本发明一优选的实施方式中，述CD8信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；上述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.17；上述CD8铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO.18；上述CD8跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO.19；上述41BB胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO.20；上述CD3ζ胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO.21；上述T2A自切割肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.22；上述GMCSFR信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.23；上述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自SEQ ID NO.24～27；上述CD28铰链区的氨基酸序列为SEQID NO.28；上述CD28跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO.29；上述CD28胞内区的氨基酸序列为SEQ ID NO.30。
上文提供的核苷酸序列和氨基酸序列如下表1-2所示：
表1核苷酸序列的具体信息
表2氨基酸序列的具体信息
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例确定CAR结构基因序列与构建CAR慢病毒载体，具体的操作步骤如下：
(1)从uniprot蛋白数据库中确定人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区、人CD28铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区氨基酸序列。从NCBI网站数据库中搜索到抗人CD19单链抗体(FMC63克隆)氨基酸序列。从专利CN201910244701.2中获取抗人BCMA单域抗体(B1克隆)的氨基酸序列。以依次连接的人CD8信号肽、抗人CD19单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区、T2A自切割肽、人GMCSFR信号肽、抗人BCMA单域抗体、人CD28铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区、人CD3ζ胞内区的氨基酸序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，获得更适合在人类细胞表达的核苷酸序列。
(2)将上述密码子优化后的核酸序列(SEQ ID NO.1～9和SEQ ID NO.13～15)委托南京金斯瑞进行基因合成，并构建至pLent7.3慢病毒载体，将含有CAR序列(其结构如图2所示)的慢病毒载体命名为pLenti7.3-scFv-BBz-VHH-28Z(如图1所示)。
实施例2
本实施例构建靶细胞并检测，具体的操作步骤和结果如下：
(1)从NCBI网站数据库中搜索到人CD19蛋白全长氨基酸序列和人BCMA蛋白全长氨基酸序列。以依次连接的人CD19蛋白全长、T2A自切割肽、人BCMA蛋白全长的氨基酸序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，获得更适合在人类细胞表达的核苷酸序列。将上述密码子优化后的核酸序列委托南京金斯瑞进行基因合成，并构建至pLent7.3慢病毒载体，将含有CAR序列的慢病毒载体命名为pLenti7.3-CD19-BCMA。同时委托南京金斯瑞分别构建含编码人CD19蛋白全长和编码人BCMA蛋白全长的慢病毒载体，分别命名为pLenti7.3-CD19和pLenti7.3-BCMA。
(2)靶细胞构建：利用上述质粒制备对应的病毒载体，分别将病毒载体转导K562细胞获得K562-CD19、K562-BCMA和K562-CD19-BCMA三株靶细胞，其后通过有限稀释法获得靶点过表达的单克隆细胞系。此外，亦准备了Raji和MM.1s细胞系作为靶细胞。
如图3所示，以抗CD19和抗BCMA抗体来检测各靶细胞的靶点表达情况：Raji高表达CD19，MM.1s高表达BCMA，K562-CD19弱表达CD19，K562-BCMA弱表达BCMA，K562-CD19-BCMA同时弱表达CD19和BCMA。
实施例3
本实施例对慢病毒进行包装和CAR-T的制备，具体的操作方法如下：
1.CAR慢病毒的包装：首先使用QIAGEN无内毒素大提质粒试剂盒分别提取实施例1所制备的质粒。准备足量的慢病毒质粒pLenti7.3-scFv-BBz-VHH-28Z以及慢病毒系统辅助包装质粒pMD2.G、pMDLg和pRSV。在转染前一天将1.8×107个293T细胞铺至T175培养瓶中。转染前1小时将293T细胞培养基换为30ml无血清培养基。使用磷酸钙沉淀法将适当比例的四质粒混合物共转染到293T细胞中，转染后24小时将细胞培养基换为60ml完全培养基DMEM+10％FBS。转染后48小时收取细胞上清，并加入60ml新鲜完全培养基。72小时再次收取细胞上清，弃去细胞。将收取的细胞上清5000g离心3min以去除杂质，之后使用0.45μm滤膜过滤，随后40000g离心4小时，沉淀病毒，使用0.1ml PBS重悬病毒，检测病毒滴度。放置-80℃冻存备用。
2.双靶点CAR-T制备：本发明人将该双靶点CAR-T命名为KQ-19B-T细胞(其CAR结构识别CD19和BCMA双阳性肿瘤细胞示意图如图4所示)。提前一天包被retronectin、抗人CD3及CD28抗体在6孔板中，4℃过夜，用前PBS洗两次备用。采用常规方法采血并分离PBMC，使用STEMCELL T细胞分选试剂盒分选T细胞，计数，将获得T细胞按1×106个/ml密度重悬在含有5％人AB血清和100IU/ml白细胞介素-2的X-VIVO15培养基中，置入包被的培养板培养。开始培养以后24小时，加入5μg/ml的凝聚胺溶液并按MOI3加入慢病毒，混匀，37℃感染24小时。然后离心收集细胞沉淀，更换为5％人AB血清和100IU/ml白细胞介素-2的X-VIVO15培养基培养。后续培养通过补加培养基将细胞保持在1×106个/ml密度，72小时后利用流式细胞术检测scFv表达以检测CAR分子转导效率。阳性率检测分别使用BCMA-Fc和protein L检测，BCMA-Fc检测的是B1单域抗体，protein L检测的是FMC63抗体的κ轻链。
如图5所示，CAR-T细胞阳性率用protein L检测大约在34％，用BCMA-Fc检测大约为19.9％。由于BCMA-Fc与B1单域抗体结合能力不够强，因此采信protein L测得的阳性率数据。
实施例4
本实施例探究双靶点CAR-T的体外功能，具体的实验方法和结果如下：
1.验证KQ-19B-T细胞体外杀伤靶细胞的能力：用5-羧基荧光素琥珀酰亚胺基(CFSE)将效应细胞染色，分别取KQ-19B-T与MM.1S及Raji细胞以2:1，5:1，10:1的效靶比(E：T)混合共培养，设置两个对照组分别是T细胞与不同效靶比的Raji细胞组以及KQ-19B-T与不同效靶比的K562细胞组。经过4小时共培养后，将细胞用Annexin V及PI试剂盒染色。使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测，结果见图6。
由图6可知，KQ-19B-T细胞能够有效杀伤Raji细胞和MM.1s，但是对照的T细胞不能够有效杀伤靶细胞，说明CAR元件介导了KQ-19B-T对Raji细胞和MM.1s的特异性杀伤。同时，KQ-19B-T细胞无法有效杀伤CD19和BCMA阴性的K562细胞，说明KQ-19B-T对靶细胞的杀伤是靶点特异性的。以上结果说明，KQ-19B-T能够有效的杀伤BCMA阳性的多发性骨髓瘤细胞，同时也能有效的杀伤CD19阳性淋巴瘤细胞，且杀伤作用具有明确的BCMA和CD19靶向性。
2.KQ-19B-T细胞与靶细胞共孵育细胞因子分泌检测：细胞因子分泌是免疫细胞功能的重要体现，因此本发明人通过将KQ-19B-T与靶细胞过夜共培养，运用成熟的商业化试剂盒通过CBA法对三个重要的细胞因子进行检测来评价CAR-T的体外功能。选择2:1的效靶比进行共培养，分别将KQ-19B-T与Raji、MM.1s、三株靶点过表达的K562和野生型K562过夜共培养，同时设置了T细胞与各靶细胞共孵育的对照组。
如图7所示，KQ-19B-T与Raji、MM.1s、三株靶点过表达的K562共孵育组的细胞因子分泌量相比与靶点阴性的K562共孵育组显著增加，说明KQ-19B-T对靶细胞的杀伤是靶点特异性的。T细胞与所有靶细胞共孵育组的细胞因子分泌均较低，这提示CAR元件介导了KQ-19B-T对靶细胞的杀伤。总之，通过对细胞因子的检测验证了KQ-19B-T细胞功能，细胞因子分泌结果与体外杀伤的结果具一致性。
3.KQ-19B-T细胞脱颗粒功能检测：CD107a位于胞内的细胞毒颗粒表面，只有当效应细胞杀伤肿瘤靶细胞时细胞毒颗粒与效应细胞膜融合并释放穿孔素、颗粒酶等，CD107a才可存在于细胞膜表面。因此CD107a分子是细胞毒性T淋巴细胞脱粒功能的敏感标志，与细胞毒活性直接相关。运用这一特点，把效应细胞和肿瘤细胞共孵育后加入含有莫能菌素的蛋白转运抑制剂(GolgiStop)，以抑制CD107a分子内吞，同时将要标记的CD107a和CD3等抗体加入共孵育后进行流式检测。接下来即可分析培养后的T细胞活化情况，这些活化的T细胞是具肿瘤杀伤能力的，CD107a阳性细胞占CD8阳性细胞比例越高杀伤肿瘤的能力越强。共设置Raji、MM.1s、三株靶点过表达的K562和野生型K562六个靶细胞实验组，同时将KQ-19B-T细胞和T细胞作为效应细胞孵育4小时，流式检测CD107a阳性细胞占CD8阳性细胞比例。
结果如图8左所示，KQ-19B-T细胞与Raji、MM.1s、三株靶点过表达的K562孵育均能高表达CD107a，脱粒功能良好提示了KQ-19B-T细胞具良好的肿瘤杀伤能力。值得注意的是，与三株靶点过表达的K562孵育的各组KQ-19B-T细胞CD107a表达水平具显著差异，KQ-19B-T细胞对CD19和BCMA双阳性靶细胞的杀伤能力相较于CD19或BCMA单阳靶细胞更强。这个结果可能得益于本发明创新的双靶点设计，针对CD19和BCMA靶点的毒理CAR结构分别包含了41BB-CD3ζ和CD28-CD3ζ共刺激域，因此双靶点同时出现时三个共刺激信号将共同激活并提高KQ-19B-T细胞的杀伤能力。此外如图8右所示，在另一次独立的实验中，KQ-19B-T与Raji、8266和H929细胞共孵育均能能高表达CD107a。
实施例5
本实施例研究KQ-19B-T的动物体内药效学，具体探索静脉移植人H929-luc细胞的NSG小鼠单次静脉注射给予抗人KQ-19B-T细胞注射液后药效学。主要评估以下几个部分内容：1、观察小鼠生存期；2、通过活体成像仪检测肿瘤负荷；3、以体重为指标初步鉴定KQ-19B-T是否对小鼠存在毒性。
试验方案：NSG小鼠20只随机分两组，每组10只。每组小鼠于3D尾静脉注射3E6个H929-luc，3D后(OD)分别给予CART与NT细胞(CAR阳性细胞为5E6)，单次静脉给药，给药容量为200μl/只。其后对小鼠进行每周两次的活体成像以观察肿瘤负荷并测量体重。如图9，在D0时，对已造模的22只小鼠进行活体成像，根据体重与活体成像信号分成两组。
如图10所示，D3至D10两组小鼠通过活体成像仪检测的肿瘤负荷情况。回输NT细胞的对照组小鼠，随着时间变化肿瘤负荷显著增加，在D10时该组有一只小鼠死亡，在D28时该组有三只小鼠死亡；回输CAR-T细胞的实验组小鼠在每个时间点的肿瘤负荷均小于对照组。两组小鼠在各时间点的体重数据均稳定，提示了CAR-T的安全性，随时间小鼠体重情况如图11所示。至40天观察结束时，回输NT细胞的对照组小鼠只有两只小鼠存活，回输CAR-T细胞的实验组小鼠仅死亡一只，生存曲线如图12所示。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海科棋药业科技有限公司
<120> 一种同时靶向CD19和BCMA的双靶点嵌合抗原受体及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人CD8信号肽的编码序列(artificial sequence)
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> FMC63的编码序列(artificial sequence)
<400> 2
gacattcaga tgactcagac cacaagcagc ctcagtgcga gcctggggga cagggtgact 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatttcc aagtacctga attggtacca gcagaagccc 120
gatggtactg tgaaactcct gatatatcat acttctaggc tccattccgg ggttccaagc 180
cgattcagtg gctccggttc cggtacagat tattccctga ccattagcaa cttggaacag 240
gaggacattg caacgtattt ctgtcagcaa ggcaacacat tgccctacac attcgggggc 300
gggactaaac tcgaaataac tggcggcggg ggttctggtg gcggcggcag cggcggtgga 360
ggatcagaag tgaagctgca ggaaagtggc cccgggctgg tagccccaag tcagtccctg 420
agtgtaacct gtacagtgag tggagtgtct cttcctgact acggggtaag ttggattcgg 480
caacctccac gcaagggcct ggagtggctc ggcgtgattt ggggatctga gacaacttac 540
tacaattccg ccctgaagag caggctgacc atcattaagg acaatagcaa gtcacaggtg 600
tttctgaaga tgaactcact gcagaccgac gacaccgcca tctattactg cgccaaacat 660
tattattatg gcgggagtta tgctatggac tactggggcc agggcactag cgtcaccgtc 720
agcagt 726
<210> 3
<211> 141
<212> DNA
<213> 人CD8铰链区的编码序列(artificial sequence)
<400> 3
actacaactc cagcacccag accccctaca cctgctccaa ctatcgcaag tcagcccctg 60
tcactgcgcc ctgaagcctg tcgccctgct gccgggggag ctgtgcatac tcggggactg 120
gactttgcct gtgatatcta c 141
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人CD8跨膜区的编码序列(artificial sequence)
<400> 4
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60
tactgc 66
<210> 5
<211> 144
<212> DNA
<213> 人41BB胞内区的编码序列(artificial sequence)
<400> 5
aggttcagtg tcgtgaagag aggccggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc 60
atgaggcccg tgcagactac ccaggaggaa gatggatgca gctgtagatt ccctgaagag 120
gaggaaggag gctgtgagct gaga 144
<210> 6
<211> 333
<212> DNA
<213> 人CD3ζ胞内区的编码序列(artificial sequence)
<400> 6
gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 60
aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 120
gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 180
ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 240
agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 300
gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca aga 333
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> T2A自切割肽的编码序列(artificial sequence)
<400> 7
agagccaagc ggggctctgg cgagggcaga ggctctctgc tgacctgcgg agatgtggaa 60
gaaaatcccg gccct 75
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人GMCSFR信号肽的编码序列(artificial sequence)
<400> 8
atgttgctcc ttgtgacgag cctcctgctc tgcgagctgc cccatccagc cttcctcctc 60
atcccg 66
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> B1的编码序列(artificial sequence)
<400> 9
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ccggggggtc actgagactc 60
tcctgtacag cctctggaag catcctcagt atctatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccggggaagc agcgcgagtt ggtcgctgct attaatatca gtagtaacac attctaccga 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccgagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgt ggcgccttgg 300
ggcgactatg acgtgaaaac tgactttggt ggctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcg 366
<210> 10
<211> 366
<212> DNA
<213> B65的编码序列(artificial sequence)
<400> 10
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactt 60
tcctgtgcag cctctggaag catcagcggt atctatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgccggtt ggtcgcagct attactagtg gtggtgacac gttccatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac aatgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgt ggcgccttgg 300
ggcgactatg acgtgagggc tgactttggt tcctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcg 366
<210> 11
<211> 729
<212> DNA
<213> C11D5.3的编码序列(artificial sequence)
<400> 11
gacatcgttt tgacacaatc tcctgcgtca ttggccatga gtctcgggaa gcgcgcaaca 60
atatcctgtc gcgccagtga atctgtgtct gtgataggag cgcacttgat ccattggtat 120
cagcagaaac ctggacaacc tcccaagctg ctcatctacc tcgccagtaa ccttgaaaca 180
ggagtacctg ctcggttttc aggttccggg tcagggacgg atttcacttt gactatcgac 240
ccagttgagg aagacgacgt agccatatat agctgcctgc agtctcggat cttcccgcgc 300
acgttcgggg gaggaactaa gctggagatt aagggcggcg ggggttctgg tggcggcggc 360
agcggcggtg gaggatcaca aatccaactg gttcagtccg gtccagaact gaaaaagccg 420
ggggagacgg tgaaaatctc ctgtaaggcc tcaggttata ccttcaccga ttacagcatc 480
aattgggtaa agcgggctcc agggaaaggt ctgaaatgga tgggttggat caacacagaa 540
acccgagaac cagcctatgc ttacgacttt cgaggtcgat tcgctttttc cttggaaact 600
tccgcaagca cagcctatct gcaaatcaac aatctcaagt acgaagatac ggccacgtat 660
ttttgtgccc tggattacag ctatgcaatg gattactggg gtcaggggac gtctgttaca 720
gtttctagt 729
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> B6的编码序列(artificial sequence)
<400> 12
gaggtgcagc ttcaggcaag cgggggtggg ctggctcaac cgggtggttc cttgagactt 60
agttgtgcgg cgtctggacg aacattttcc acgtatttca tggcatggtt tagacaacct 120
ccgggtaagg gactggaata tgttggcggt ataaggtggt cagatggagt gcctcactat 180
gcggatagcg ttaaaggacg atttaccatt tctagggaca atgcgaaaaa tactgtatat 240
ttgcagatga atagtctccg cgcagaggac acagccgtat atttttgcgc gtcacggggt 300
attgcagacg ggtccgactt cggatcctat gggcaaggga cacaagtcac cgtcagctcc 360
<210> 13
<211> 117
<212> DNA
<213> 人CD28铰链区的编码序列(artificial sequence)
<400> 13
atcgaggtga tgtaccctcc tccatacctg gacaacgaaa aaagcaacgg caccatcatc 60
cacgtgaagg gcaagcacct gtgccccagc cctctgttcc ccggaccttc taagcct 117
<210> 14
<211> 81
<212> DNA
<213> 人CD28跨膜区的编码序列(artificial sequence)
<400> 14
ttctgggtgc tggtcgtggt cggaggggtg ctggcctgtt atagcctgct ggtgactgtc 60
gccttcatta tcttctgggt g 81
<210> 15
<211> 123
<212> DNA
<213> 人CD28胞内区的编码序列(artificial sequence)
<400> 15
cggagcaaga ggtctcgcgg tgggcattcc gactacatgt tcatgacccc tagaaggcct 60
ggcccaacca gaaagcacta ccagccatac gcccctccca gagatttcgc cgcttatcga 120
agc 123
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人CD8信号肽(artificial sequence)
<400> 16
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 17
<211> 242
<212> PRT
<213> FMC63 (artificial sequence)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 18
<211> 47
<212> PRT
<213> 人CD8铰链区 (artificial sequence)
<400> 18
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人CD8跨膜区 (artificial sequence)
<400> 19
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 20
<211> 48
<212> PRT
<213> 人41BB胞内区 (artificial sequence)
<400> 20
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
35 40 45
<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> 人CD3ζ胞内区 (artificial sequence)
<400> 21
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
1 5 10 15
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
20 25 30
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
35 40 45
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
50 55 60
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> T2A自切割肽 (artificial sequence)
<400> 22
Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 23
<211> 22
<212> PRT
<213> 人GMCSFR信号肽 (artificial sequence)
<400> 23
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 24
<211> 122
<212> PRT
<213> B1 (artificial sequence)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Leu Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ile Ser Ser Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Asp Val Lys Thr Asp Phe Gly Gly Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 122
<212> PRT
<213> B65 (artificial sequence)
<400> 25
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Arg Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr Phe His Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Ala Asp Phe Gly Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 243
<212> PRT
<213> C11D5.3 (artificial sequence)
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly
180 185 190
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu
210 215 220
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> B6 (artificial sequence)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Gly Gly Ile Arg Trp Ser Asp Gly Val Pro His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Gly Ile Ala Asp Gly Ser Asp Phe Gly Ser Tyr Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 39
<212> PRT
<213> 人CD28铰链区 (artificial sequence)
<400> 28
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 29
<211> 27
<212> PRT
<213> 人CD28跨膜区 (artificial sequence)
<400> 29
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 30
<211> 41
<212> PRT
<213> 人CD28胞内区 (artificial sequence)
<400> 30
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Phe Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40