一类格尔德霉素衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
阅读说明：本技术 一类格尔德霉素衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用 (Geldanamycin derivatives, preparation method thereof and application thereof in preparing antitumor drugs ) 是由 王俊锋 王军舰 黄小龙 刘永宏 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类格尔德霉素衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。格尔德霉素类化合物,其结构如式(Ⅰ)所示的任一化合物。本发明从海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561中分离得到1个结构新颖的含有环戊烯酮片段的格尔德霉素衍生物-化合物1,以及化合物2-5,化合物1-5具有显著的抗前列腺癌和小细胞肺癌活性,可用于开发抗肿瘤药物,因此本发明为海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561提供了新的应用,为开发新的抗肿瘤药物提供了备选化合物,对开发中国海洋药物资源研究具有重要的意义。(The invention discloses geldanamycin derivatives, a preparation method thereof and application thereof in preparing antitumor drugs. The geldanamycin compound has any compound shown in a structural formula (I). The invention separates 1 geldanamycin derivative-compound 1 containing cyclopentenone fragment with novel structure from Streptomyces maritima sp.HNM0561, and compounds 2-5, wherein the compounds 1-5 have significant activity of resisting prostate cancer and small cell lung cancer, and can be used for developing antitumor drugs, therefore, the invention is Streptomyces maritima sp.HNM0561 provides new application, provides alternative compound for developing new antineoplastic medicine, and has important significance for developing Chinese marine medicine resource research.)
技术领域：
本发明属于海洋天然产物领域，具体涉及格尔德霉素衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
癌症是一类严重影响人类健康的疾病，手术治疗、化学治疗和放射治疗是肿瘤治疗的三大手段。化学治疗药物通过杀死肿瘤细胞增加患者寿命，然而化疗药物同时也会干扰人体的正常细胞的代谢，降低免疫力，对人体造成严重损伤。所以进一步挖掘新的药物，是提高化疗效果的关键，也是促进肿瘤治疗效果的一个重要方面。现有的抗肿瘤化学药物70％以上是植物或微生物来源的天然产物，或以天然产物为模板衍生而来。海洋链霉菌是产生新的抗肿瘤活性物质、生产新药的巨大宝库。因此，在海洋链霉菌中筛选发现具有抗肿瘤活性的天然产物对于抗肿瘤药物研发具有重要意义。
发明内容
：本发明的第一个目的是提供一类具有抗肿瘤活性的格尔德霉素类化合物。
本发明的格尔德霉素类化合物，其结构如式(Ⅰ)中的任一化合物所示：
本发明的第二个目的是提供上述格尔德霉素类化合物的任一化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物优选为抗人小细胞肺癌、人前列腺癌的药物。
进一步优选，是化合物3、4在制备抗人小细胞肺癌或人前列腺癌的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种上述格尔德霉素类化合物的制备方法，其是从链霉菌Streptomyces sp.HNM0561的发酵产物中制备分离得到的。
优选，具体步骤如下：
a、制备链霉菌Streptomyces sp.HNM0561的发酵产物；
b、将发酵产物分离得上清发酵液和沉淀菌丝体，上清发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩得发酵液浸膏；沉淀菌丝体用丙酮水溶液浸提，提取液经蒸馏后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩得菌丝体浸膏；
c、合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏，该浸膏用反相硅胶分离，采用甲醇：水从10:90,20:80,30:70,50:50,70:30,80:20,90:10,100:0,v/v梯度洗脱顺序得8个组分fr1-fr8，收集甲醇：水50：50v/v洗脱的组份fr4和甲醇：水70：30v/v洗脱的组份fr5；
组份fr4经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后，经薄层色谱检测合并，收集在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.72-0.85的馏分fr4-7和在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.6-0.7的馏分fr4-6；馏分fr4-7经高效液相纯化得到化合物1和4；馏分fr4-6经高效液相纯化得到化合物5；
组份fr5经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后，经薄层色谱检测合并，收集在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.55-0.65的馏分fr5-3和在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.7-0.8的馏分fr5-4；馏分fr5-3经高效液相纯化得到化合物2；馏分fr5-4经高效液相纯化得到化合物3。
所述的制备链霉菌Streptomyces sp.HNM0561的发酵产物是将链霉菌Streptomyces sp.HNM0561接种到发酵培养基中发酵，获得发酵产物，所述的发酵培养基是每1000mL含有：葡萄糖20g，酵母膏10g，牛肉膏3g，玉米浆3g，可溶性淀粉10g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙2g，余量为水。
进一步优选，是将链霉菌Streptomyces sp.HNM0561接种到发酵培养基中，28℃条件下摇床培养3天，得种子培养液，再将种子培养液按照1％的体积比接种到发酵培养基中，28℃条件下摇床培养11天，得到发酵产物。
本发明从海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561中分离得到1个结构新颖的含有环戊烯酮片段的格尔德霉素衍生物-化合物1，以及化合物2-5，化合物1-5具有显著的抗前列腺癌和小细胞肺癌活性，可用于开发抗肿瘤药物，因此本发明为海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561提供了新的应用，为开发新的抗肿瘤药物提供了备选化合物，对开发中国海洋药物资源研究具有重要的意义。
本发明的链霉菌Streptomyces sp.HNM0561于2020年06月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学，保藏编号：CCTCC No：M 2020255。
附图说明：
图1：化合物1主要的1H-1H COSY,HMBC和NOESY信息；
图2：化合物1的ECD图谱
图3：化合物2和3的单晶衍射图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：化合物1-5的制备及结构鉴定
1制备海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561的发酵产物。
每1000mL培养基是这样配制的：取葡萄糖20g，酵母膏10g，牛肉膏3g，玉米浆3g，可溶性淀粉10g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙2g，然后溶于适量的水中，用水定容至1000mL，121℃高温灭菌20min，备用。
将海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561接种到上述培养基中，28℃条件下摇床培养3天，得种子培养液，再将种子培养液按照1％的体积比接种到上述培养基中，28℃条件下摇床培养11天，得到海洋链霉菌Streptomyces sp.HNM0561的发酵产物。
2化合物1-5的分离纯化
上述发酵产物，以3600rpm离心，得上清发酵液和沉淀菌丝体。上清发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3次，乙酸乙酯萃取液在低于40℃减压浓缩得发酵液浸膏；沉淀菌丝体用85％的丙酮水溶液超声浸提，提取液经减压蒸馏后，再用乙酸乙酯反复萃取三次，乙酸乙酯萃取液在低于40℃下减压浓缩得菌丝体浸膏；合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏共计得约27.6g浸膏。该浸膏用反相硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用甲醇：水(10:90,20:80,30:70,50:50,70:30,80:20,90:10,100:0,v/v)梯度洗脱顺序得8个组分(fr1-fr8)。组分fr4(甲醇：水50：50v/v洗脱的组份)经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后，按照样品洗脱收集次序，经薄层色谱(TLC)检测合并，获得7个物质极性差异显著不同的馏分(fr4-1-fr.4-7)，馏分fr4-7(在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.72-0.85)以210和254nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以甲醇：水(49:51,v/v)进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，HPLC(YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm)，得到化合物1(1.9mg，保留时间tR 17.2min)和化合物4(5.1mg，保留时间tR 20.9min)；馏分fr4-6(在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.6-0.7)以210和254nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水(29:71,v/v)进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，HPLC(YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm)，得到化合物5(1.3mg，保留时间tR 12.7min)。组分fr5(甲醇：水70：30v/v洗脱的组份)经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后，获得5个馏分(fr5-1-fr5-5)，馏分fr5-3(在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.55-0.65)以210和254nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水(50:50,v/v)进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，HPLC(YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm)，得到化合物2(56.0mg，保留时间tR 17.2min)；馏分fr5-4(在TLC中，展开剂乙酸乙酯/甲醇＝10/1v/v里的RF值范围为0.7-0.8)210和254nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水(60:40,v/v)进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，HPLC(YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm)，得到化合物3(5.4mg，保留时间tR 18.7min)。
3.化合物1-5的结构鉴定
对获得的格尔德霉素类化合物进行核磁共振(NMR)、质谱(MS)、旋光(OR)、圆二色谱(CD)和单晶衍射(X-Ray)等数据测试，从而确定化合物的化学结构。
4.新化合物1结构鉴定：高分辨质谱m/z 631.2841[M+Na]+(calcd for 631.2837)建议其分子式为C30H44N2O11含有10个不饱和度，1H和13C NMR数据见表1，13C NMR结合DEPT-135谱提示其30个碳原子信号包括：8个甲基，2个sp3杂化亚甲基，7个sp3杂化和4个sp2杂化的次甲基，1个sp3杂化和4个sp2杂化的季碳，1个酮基，1个酯羰基碳，2个酰胺基碳。通过分析发现其含有一个与Mccrearamycin B(Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,2994–2998)类似的19元环的格尔德霉素衍生物母核，差异主要是化合物1多出了1个双键碳氢信号，(δH/C 6.51,t,J＝11.3Hz/126.8ppm；5.42,t,J＝10.6Hz/132.4ppm).1H-1H COSY(图1)确认了多出的两个烯氢与分子中其它氢的链接次序H-3/H-4/H-5/H-6/H-7，HMBC的相关信息(图1)(H-4与C-2,C-3,C-6,H-5与C-3,C-6,和C-7相关)进一步验证了该连接顺序，由二维谱图确认了化合物1是Mccrearamycin B 4位羟基脱水生产双键的产物，由此推测出化合物1的平面结构。化合物1中三个双键Δ2,3,Δ4,5,和Δ8,9的双键构型分别确定为E,Z和E,式，它们分别是通过NOESY和化学位移来确证，2D NOESY中可以观察到H-3与H-6的相关信号,H-4与H-5的相关信号，以及CH3-8的化学位移δC 14.8ppm.此外化合物1的绝对构型是通过ECD计算确定其构型为6S,7S,10S,11R,12S,14R,18S,20S(图2)。化合物1为崭新的结构，命名为MccrearamycinE。
表1 700MHz 1H(δinppm,JinHz)spectroscopic dataforcompounds 1–5.
表2. 175MHz 13C(δinppm)spectroscopic data for compounds 1–5.
通过与已报道的文献比对核磁数据(表1和2)，化合物2-5分别鉴定为17-O-demethyl-geldanamycin(2),geldanamycin(3),19-S-methylgeldanamycin(4)和autolytimycin(5)。此外，化合物2和3通过单晶衍射X-Ray的方法确定了其平面结构和立体结构。
实施例2：化合物1-5的抗肿瘤细胞的实验数据
采用国际通用的肿瘤细胞株，即：人小细胞肺腺癌(H446)，人前列腺癌细胞(C42B和22RV1)，分别以抗肿瘤药物顺铂(DDP)和恩杂鲁胺(Enz)为阳性对照，试验方法为国际通用的CCK-8法。
CCK-8实验步骤：
(1)取生长状态良好的肿瘤细胞22Rv1、C4-2B和H466，以每孔100μL培养基含有1500个细胞的密度种于96孔板中，96孔板周围一圈每孔加入200-250μL的PBS，防止培养基蒸发；
(2)置于37℃培养箱中培养24h；
(3)取出96孔板，每孔加入50μL含有相应药物浓度的新鲜培养基，每个药物浓度设置3个复孔，加完后再置于37℃培养箱中培养96h；
(4)取出96孔板，在避光下每孔直接加入10μL的CCK-8溶液，再置于37℃培养箱中培养1h；
(5)取出96孔板，观察培养基颜色变化，若无明显变化可适当延长反应时间；
(6)使用酶标仪检测各孔OD490的吸光值。
(7)细胞存活率(％)计算公式为：
化合物1-5对上述肿瘤细胞的抑制活性数据如表3所示。
表3.化合物1-5对三株肿瘤细胞的增殖抑制作用(IC50,μM)
注：RWPE1为人前列腺正常上皮细胞；Enz和DDP为抗肿瘤阳性药
上述实验结果表明，Mccrearamycin E(1)作为结构新颖的格尔德霉素衍生物具有一定的抗小细胞肺癌活性；化合物3和4显示出显著的抗肿瘤活性，体外抗三种肿瘤细胞活性IC50值均强于阳性药，尤其是化合物3体外抗人前列腺癌活性明显强于阳性药恩杂鲁胺，同时对人前列腺正常上皮细胞RWPE1毒性显示出良好的选择性，可以做为抗肿瘤药物开发的先导化合物。对我国海洋微生物药物资源的开发具有重要意义。
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