一种鸡ace2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法
阅读说明：本技术 一种鸡ace2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法 (Construction, identification and expression method of chicken ACE2 eukaryotic expression recombinant plasmid vector ) 是由 纪晓霞 张源淑 王换换 李帅 李志强 曹西月 于 2020-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法,包括构建ACE2真核表达载体,转染CHO细胞,筛选稳定表达的pcDNA.3.1(+)-ACE2细胞株,获得具有生物学活性的ACE2蛋白并测定酶活。本发明具有：①快速：仅需要1小时②简单：无需酶切③高效：阳性率达95％以上④无缝：不引入额外序列等优点。ACE2具有抗炎、抗损伤、抗纤维化等机体保护功能,特别作为SARS-CoV和SARS-CoV-2主要功能性受体,具有保护肺损伤功能。目前缺乏生物活性的鸡ACE2蛋白,限制了其生物学功能的研究。本发明为深入研究鸡ACE2作为病毒受体在禽冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制,开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。所以本发明无论是从基础研究还是临床运用的意义都是十分重大的。(The invention discloses a construction, identification and expression method of chicken ACE2 eukaryotic expression recombinant plasmid vector, which comprises the steps of constructing ACE2 eukaryotic expression vector, transfecting CHO cells, screening pcDNA.3.1(+) -ACE2 cell strain with stable expression, obtaining ACE2 protein with biological activity and determining enzyme activity. The present invention has: the method is characterized by comprising the following steps: only 1 hour is needed, simple: does not need enzyme digestion and has high efficiency: the positive rate is more than 95 percent, and the method is seamless: no extra sequence is introduced, and the like. ACE2 has anti-inflammatory, anti-injury, and anti-fibrosis effects, and can be used as main functional receptor of SARS-CoV and SARS-CoV-2 for protecting lung injury. The lack of bioactivity of chicken ACE2 protein limits the research of its biological function. The invention lays a foundation for deeply researching the biological function and the molecular mechanism of the chicken ACE2 which is taken as a virus receptor and is exerted in the infection of the avian coronavirus and developing a medicine for targeted therapy of the coronavirus by taking the ACE2 as the virus receptor. Therefore, the significance of the invention is very important from both basic research and clinical application.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鸡ACE2(Angiotensin converting enzyme2)真核表达重组质粒载体的构建、鉴定并获得稳定过表达ACE2基因的细胞株方法。
背景技术
血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000 年首次报道的一种单羧肽酶，作为肾素-血管紧张素系统系统的重要一员，在调节心血管、肾脏功能及肠道功能中发挥重要作用。2003年，研究发现 ACE2是急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)的主要功能性受体，具有介导SARS-CoV入侵和细胞融合等作用，研究证实ACE2基因的表达水平与SARS-CoV的进入及疾病的严重程度密切相关。2019年研究发现SARS-CoV-2可以使用除小鼠ACE2外的所有ACE2作为受体进入细胞内，与SARS-CoV一样，以细胞受体ACE2来入侵感染细胞。
根据病毒溯源研究证明，SARS-CoV、SARS-CoV-2等冠状病毒均以动物作为自然宿主或中间宿主，因此，对动物ACE2受体功能的研究有助于阐明该病毒的跨种感染机制。但目前，ACE2的研究主要集中在人、小鼠、大鼠、斑马鱼等多种哺乳动物及水生动物，包括家禽在内的其他动物的 ACE2生物学功能目前尚不清楚。
在本发明研究中，拟以白羽肉鸡为研究对象，应用RT-PCR和基因克隆技术从白羽肉鸡空肠组织扩增ACE2基因，以同源重组方式连接到真核表达载体pcDNA.3.1(+)，在CHO细胞中通过G418和单克隆筛选获得稳定表达pcDNA.3.1(+)-ACE2的细胞株，以获得具有生物学活性的ACE2蛋白，为深入研究鸡ACE2作为病毒受体在禽冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体 pcDNA3.1(+)-ACE2构建、鉴定与表达方法，目的在于：①用它作为运载工具，将目的基因ACE2转移到宿主细胞中去；②利用它在宿主细胞内对目的基因ACE2进行大量的复制(称为克隆)，为深入研究鸡ACE2作为病毒受体在禽冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。其具体技术方案为：
一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：
S1、21日龄白羽肉鸡，颈部放血处死后取心脏、肝脏、肺脏、肾脏、回肠、盲肠、空肠等，经生理盐水漂洗后迅速放入液氮速冻。提取基因组 RNA，反转录为cDNA。设计ACE2的上下游引物用于ACE2全长基因扩增，并在ACE2基因片段两侧分别加入pcDNA3.1(+)载体同源臂及EcoRI 酶切位点，以cDNA为模板，扩增获得ACE2基因全长。EcoRI酶切 pcDNA3.1(+)载体和ACE2 PCR产物，切胶回收目的片段，以同源重组方式将pcDNA3.1(+)载体和ACE2进行连接。经菌液PCR、酶切、测序验证获得质粒pcDNA3.1(+)-ACE2。
S2、设定G418致死浓度为0、500ug/mL、600ug/mL、700ug/mL、 800ug/mL、900ug/mL、1000ug/mL。将CHO细胞以30％密度接种于6孔板中，每孔加入2mL DMEM/F12培养基，分别加入不同浓度的G418，混合均匀。培养14天，以最低浓度细胞全部死亡为基准。
S3、将CHO细胞分为空白组、转染空质粒pcDNA3.1(+)组以及转染 pcDNA3.1(+)-ACE2组，吸取转染混合液加入6孔板里，空白组不作任何处理，培养6h后弃转染混合液，PBS洗涤。再分别加入2mL DMEM/F12(含 10％FBS)液，继续培养。
S4、经G418初步筛选和单克隆进一步筛选出稳定过表达ACE2蛋白的细胞株。
S5、RT-PCR、免疫荧光和Western blot鉴定pcDNA3.1(+)-ACE2重组体表达情况。
S6、将分别转染了空质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-ACE2CHO细胞以及空白对照细胞提取细胞蛋白，双抗体夹心法测定ACE2活性蛋白酶活性。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明在PCR上游引物起始密码子ATG前加入pcDNA3.1(+) 同源臂和EcoRI酶切位点，这样得到的PCR产物含有pcDNA3.1(+) 的同源臂，即可与pcDNA3.1(+)载体DNA重组，这种克隆方法效率较高，并可通过测序有效地鉴定PCR产物。
(2)本发明选用的pcDNA3.1(+)载体包含以下成分：含有高效增强子猴空泡病毒(SV40)，能促进基因转染活性；具有人巨细胞病毒早期启动子(PCMV)，进行目的基因的高水平稳定表达；含有T7多克隆位点(MCS)，便于便外源基因插入；有便于筛选稳定细胞株的新霉素(neo)磷酸转移酶抗性基因，可以用来筛选含此载体的靶细胞。
(3)CHO细胞作为最常用的哺乳动物细胞表达宿主，具有以下优点：1)具有明确的遗传背景和稳定的生理代谢能力；2)亲缘关系最接近于人，具有准确的外源蛋白修饰能力；3)具有完善的基因转移和载体表达系统；4)耐受剪切力，适用于大规模培养；5)由于CHO 细胞的永生性性和许多其他优点，CHO细胞生产了70％以上的重组蛋白，被美国FDA认定为安全的基因工程受体细胞。
(4)本发明采用同源重组方式进行载体和目的片段的重组，不受传统克隆方法的限制，无论载体类型或插入片段组成如何，针对各种克隆应用都能保持出色的准确性，无需传统连接方法的亚克隆操作。甚至插入片段大小或片段数量增加，克隆成功率仍然很高，且比传统连接酶的方法速度快。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实例中利用RT-PCR方法扩增ACE2基因鉴定结果 (2444bp)；其中，M：DNA Maker；泳道1-7：从白羽肉鸡空肠组织通过RT-PCR 扩增得到ACE2片段；
图2为真核表达质粒pcDNA3.1(+)的酶切结果图；其中，M：DL5000；泳道1-8：pcDNA3.1(+)质粒
图3A为菌液PCR扩增ACE2基因产物结果图；其中，M：DNA Maker 泳道1：阴性对照；泳道2-7：pcDNA3.1(+)-ACE2-阳性菌落1-6；
图3B为pcDNA3.1(+)-ACE2重组质粒酶切鉴定结果图；其中，M：DNA Maker；泳道1：pcDNA3.1(+)-ACE2重组质粒；泳道2：pcDNA3.1(+)-ACE2 重组质粒单酶切；
图4为G418筛选第6d CHO细胞死亡情况图；其中，con：空白对照组； A-F：G418终浓度为500ug/mL、600ug/mL、700ug/mL、800ug/mL、900ug/mL、 1000ug/mL；
图5为pcDNA3.1(+)-ACE2重组质粒转染CHO细胞筛选结果图；其中 A：转染前CHO细胞；B：pcDNA3.1(+)-ACE2转染48h后的CHO细胞； C：pcDNA3.1(+)-ACE2转染后，G418筛选7d后CHO细胞；D：pcDNA3.1 (+)-ACE2转染后，G418筛选14d后CHO细胞；
图6为RT-PCR鉴定pcDNA3.1(+)-ACE2重组体的表达结果图；其中， M：DL5000；泳道1：空白对照组；泳道2：pcDNA3.1(+)空质粒组；泳道3： pcDNA3.1(+)-ACE2重组体；
图7为免疫荧光鉴定pcDNA3.1(+)-ACE2重组体的表达结果图；
图8为Western Blot鉴定转染48h的pcDNA3.1(+)-ACE2重组体表达结果图；其中，泳道1、2：空白对照组；泳道3、4：pcDNA3.1(+)空质粒组；泳道5、6：pcDNA3.1(+)-ACE2；
图9为Western blot鉴定单克隆筛选的pcDNA3.1(+)-ACE2重组体表达结果图；其中，泳道1-3：pcDNA3.1(+)空质粒组；泳道4-12： pcDNA3.1(+)-ACE2组；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
实施例1 ACE2目的片段的获得
引物设计根据GenBank中的鸡ACE2基因序列(MK560199)设计，上下游引物分别插入pcDNA3.1(+)同源臂和EcoRI酶切位点，由南京擎科生物科技有限公司合成引物。将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系：cDNA模板2uL，反应条件：95℃5min；95℃20s， 59℃20s，72℃1min15s，40个循环；72℃10min。PCR扩增结果如图1，有单一条带出现(见泳道1-7)，条带大小2000-3000bp之间，与预期(2444bp) 大小一致。
实施例2 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ACE2的构建与鉴定
将得到的EcoRI单酶切ACE2 PCR纯化产物和pcDNA3.1(+)质粒连接并回收。以同源重组方式连接ACE2基因片段到pcDNA3.1(+)真核表达载体。连接体系(20uL)：包括4uLpcDNA3.1(+)载体，1uL目的序列，1uL 同源重组酶，4uL5×Buffer，三蒸水10uL于200uLEP管中，混匀后，50℃，连接10min。连接产物转化到DH5α感受态细胞，经菌液PCR及EcoRI酶切鉴定得到阳性重组表达载体pcDNA3.1(+)-ACE2，送上海英俊生物技术有限公司测序，测序结果与MK560199的序列完全一致。说明 pcDNA3.1(+)-ACE2构建成功。真核表达质粒pcDNA3.1(+)的酶切结果如图 2，在5438bp处有单一目的条带(泳道1-8)，与pcDNA3.1(+)质粒大小(5438bp) 一致，证明酶切成功。菌落PCR验证结果如图3A，2000-3000bp之间有单一条带(泳道2-3)。PCR鉴定插入载体的片段大小与PCR扩增片段一致。提示阳性菌落中目的片段插入成功。酶切验证结果如图3B所示：EcoRI单酶切后发现有1条约8000bp的条带，大小与pcDNA3.1(+)载体(5428bp)和目的基因(2444bp)总和一致(泳道2)。此结果证实已成功构建pcDNA3.1(+)-ACE2重组载体。
引物序列(SEQ ID NO.1)如下：
ACE2-F：
ACE2-R：
测序获得的基因片段(SEQ ID NO.2)：
实施例3 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ACE2的转染与表达
1、CHO细胞培养
采用培养基为DMEM/F12培养基，培养条件为37℃，5％培养箱。
2、G418最低致死浓度的确定
1)设定G418致死浓度为0、500ug/mL、600ug/mL、700ug/mL、800ug/mL、 900ug/mL、1000ug/mL。
2)将CHO细胞以30％密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，弃液， PBS洗涤，每孔加入2mL DMEM/F12培养基，加入不同浓度的G418，混合均匀。
3)3天更换一次培养基，培养10-14天，每天观察细胞状态，以最低浓度细胞全部死亡为基准。
G418筛选第6d时，CHO细胞的死亡情况如图4。G418筛选第6d时，空白对照组的CHO细胞形态为成纤维细胞样，生长旺盛；加G418的细胞形态变圆，且有不同程度的死亡。随着G418浓度及天数的增加，CHO细胞死亡加剧。
3、脂质体转染CHO细胞
将CHO细胞分为空白组、转染空质粒pcDNA3.1(+)组以及转染 pcDNA3.1(+)-ACE2组，具体操作按Lipofectamne3000试剂盒使用说明书进行：
首先配制转染混合液中的A液、B液。然后A液与B液1∶1混合，轻轻吹打混合均匀，37℃孵育10min。吸取转染混合液加入6孔板里，空白组不作任何处理，37℃，5％CO2培养6h后弃转染混合液，PBS洗涤。再分别加入2mL DMEM/F12(含10％FBS)液，继续培养。
4、pcDNA3.1-ACE2重组质粒在CHO细胞中的稳定表达
1)G418初步筛选
细胞生长密度达70％-80％时，加入G418进行筛选，使其终浓度达到上步筛选的最低致死浓度。观察细胞生长状态，48h换液一次，并维持G418 浓度。pcDNA3.1(+)-ACE2重组质粒转染CHO细胞，加G418筛选14d后结果如图5，转染质粒组有细胞存活，可见细胞成簇状分布，有抗性单克隆出现。而空白组细胞全部死亡，说明转染成功。
2)单克隆筛选稳定细胞系
用倒置显微镜找到单个细胞团，用marker笔在培养皿底部标记。用无菌镊子将克隆环放在选定的克隆之上，显微镜下确认后，加胰酶(0.25％) 消化克隆环里的细胞，然后终止消化。将细胞悬液转移充分吹打，使成单个存在，吸取100uL至96孔板，充分吹打混匀，重复操作稀释至每孔只含有1个细胞，置于37℃，5％CO2培养，直到细胞长满。随后扩大培养至6 孔板/培养皿中，最后检测表达情况。
实施例4 pcDNA3.1(+)-ACE2重组体表达的鉴定
1、RT-PCR鉴定
收获约2×107个/孔细胞移入EP管，加入Trizol彻底匀浆后，参照Trizol Reagent操作步骤提取细胞总RNA，二步法反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件：95℃5min；95℃20s，59℃20s，72℃1 min15s，40个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图6所示，pcDNA3.1(+)-ACE2重组体有单一条带出现(泳道3)，条带大小2000-3000bp之间，与预期(2444bp)大小一致。说明 pcDNA3.1(+)-ACE2质粒已成功转染至CHO细胞中。
2、免疫荧光鉴定
将转染筛选48h后的细胞接种于12孔板内的玻片上，细胞密度为1×105个/孔，在5％CO2，37℃培养细胞生长融合度为80-90％，弃培养液，PBS 洗涤，4％多聚甲醛室温固定10min，PBS洗涤，后加入1％的Triton X-100，室温放置5min，使细胞膜通透。弃上清液，PBS洗涤后，5％BSA室温封闭后，加入自制的1∶400稀释的自制鸡ACE2多克隆抗体，4℃孵育过夜；洗涤后加入FITC标记羊抗鼠IgG(1∶1000稀释)，室温避光孵育；加入DAPI 染液，避光染色，PBS洗涤。将细胞爬片轻轻放置于载玻片上，并用抗荧光衰减封片剂封片。在LSM 510型激光共聚焦显微镜下，对细胞进行扫描观察。DAPI激发光波长358nm，发射光波长461nm；FITC激发光波长 495nm，发射光波长520-530nm。结果如图7所示，pcDNA3.1(+)-ACE2在 CHO细胞中有表达，并均匀分布在细胞膜上。pcDNA3.1(+)-ACE2重组质粒组荧光强度(绿色荧光)明显高于空白对照组和pcDNA3.1(+)空质粒组，表明pcDNA3.1(+)-ACE2重组质粒成功转染至CHO细胞中，有较高转染效率。
3、Western Blot鉴定
细胞蛋白提取：将筛选单克隆细胞的6孔板，PBS洗涤两次，加入蛋白裂解液，裂解15min，用细胞刮板将细胞刮进EP管。4℃，12000g/min 离心20min，上清液即为所提取的蛋白溶液。BCA法测蛋白浓度，并统一蛋白浓度至4mg/mL。将细胞蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜上，转印条件为恒流100V，90min。用5％脱脂乳室温封闭2h，用PBST 洗涤3次；使用鼠抗鸡ACE2多抗(1∶3000)作为一抗，室温孵育2h，PBST 洗涤三次，每次10min；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG作为二抗 (1∶5000)，常温孵育1h，PBST洗涤三次，每次10min，最后用ECL发光液曝光。转染48h，Western Blot鉴定转染效率结果如图8所示，在105kDa 左右呈现显著条带(泳道5、6)，与ACE2预期大小一致；而空白对照与阴性对照有较浅ACE2条带(泳道1-4)，表达量明显较低。说明 pcDNA3.1(+)-ACE2质粒已成功转染至CHO细胞中，且ACE2基因已整合进细胞染色体中，ACE2蛋白得到表达。挑选单克隆后，将稳定转染 pcDNA3.1(+)-ACE2质粒的CHO细胞提取蛋白，经Western Blot检测，单克隆筛选结果如图9，发现4株细胞在近105kDa出现显著条带(泳道4、5、 7、8)，将这4株细胞分别命名为pcDNA3.1(+)-ACE2-A、pcDNA3.1(+)-ACE2-B、pcDNA3.1(+)-ACE2-C和pcDNA3.1(+)-ACE2-D。
实施例5 ACE2活性蛋白酶活性测定
将分别转染了空质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-ACE2CHO细胞以及空白对照细胞提取细胞蛋白，双抗体夹心法测定ACE2活性蛋白酶活性。具体操作按照试剂盒说明书操作。以空白孔调零，450nm波长测量各孔吸光度值，根据标准品得出标准曲线及回归方程，计算ACE2活性蛋白的酶活性。单位：U/L。双抗体夹心法测定ACE2活性蛋白酶活性。结果如表1，细胞株pcDNA3.1(+)-ACE2-A的ACE2活性蛋白的酶活性达601.77U/L，极显著高于空白对照组，表明获得的ACE2活性蛋白的酶活性较高，可用于后续研究。
表1 ACE2酶活性测定结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。