Cxcr4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 Cxcr4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 (CXCR4 gene humanized non-human animal and construction method and application thereof ) 是由 李惠琳 张赞 赵磊 于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种CXCR4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用。本发明还提供了包含CXCR4基因修饰的多基因修饰的非人动物的构建方法,以及制备获得的CXCR4基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物在靶向人CXCR4信号通路药物的筛选、药效评价中的应用。(The invention provides a CXCR4 gene humanized non-human animal and a construction method and application thereof. The invention also provides a construction method of the polygene modified non-human animal containing CXCR4 gene modification, and application of the prepared CXCR4 gene humanized non-human animal or polygene modified non-human animal in screening and drug effect evaluation of a medicine targeting a human CXCR4 signal pathway.)
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CXCR4基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
CXCR4（C-C chemokine receptor type 4）是趋化因子受体家族中的一员，由352个氨基酸组成的GPCR（G蛋白偶联受体），具有7次穿膜结构，基质细胞衍生因子-1（SDF-1/CXCL12）为CXCR4已知的唯一配体，也被称为HIV的T细胞共受体。CXCR4主要表达在淋巴细胞（T/B）、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）和树突状细胞，在内皮细胞和上皮细胞中有少量的表达。CXCL12/CXCR4通过激活PI3K/Akt信号途径来上调VEGF，肿瘤细胞通过增加CXCR4的表达使肿瘤细胞高表达CXCL12的淋巴细胞或组织转移；CXCL12/CXCR4促进血管内皮生长因子VEGF的增加，从而导致肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞增殖。靶向CXCR4的单抗药物主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤，转移性乳腺癌、转移性胰腺癌等恶性肿瘤。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因（即遗传因子）的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战（Scheer N, Snaith M, Wolf CR, Seibler J. Generation and utility ofgenetically humanized mouse models, Drug Discov Today; 18(23-24):1200-11,2013）。
鉴于CXCR4在肿瘤等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化CXCR4信号通路相关的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种CXCR4基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包括人CXCR4基因的全部或部分。优选的，包含人CXCR4基因的1号外显子和/或2号外显子。进一步优选还包含1-2号内含子。
在本发明的一个具体实施中，所述的非人动物的基因组中包含人1号外显子的部分和2号外显子的部分，其中1号外显子的部分至少包含1号外显子中编码CXCR4蛋白的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含号外显子中编码CXCR4蛋白的核苷酸序列。
在本发明的一个
具体实施方式
中，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化CXCR4蛋白。进一步优选的，所述的人源化CXCR4蛋白包含人CXCR4蛋白的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化CXCR4蛋白包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CXCR4蛋白包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物的内源CXCR4蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化CXCR4基因。进一步优选的，所述的人源化CXCR4基因包含人CXCR4基因的全部或部分。更进一步优选的，包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子。再进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CXCR4基因转录的mRNA包含SEQID NO：8所示的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸，或者，包含具有SEQID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明所述的构建方法包括用包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子插入或替换至非人动物CXCR4基因座。优选的，插入或替换的序列还包含1-2号内含子。优选的，所述的替换为相应位置的替换。所述的相应位置即为人和鼠相比，发挥相同功能的氨基酸或者核苷酸序列。
本发明所述的构建方法包括用包含编码人或人源化CXCR4蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物CXCR4基因座。
本发明所述的构建方法包括用包含人CXCR4基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物CXCR4基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，包括用包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列替换至非人动物CXCR4基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列替换至非人动物CXCR4基因座。
优选的，所述的替换至非人动物CXCR4基因座为替换非人动物CXCR4基因中编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
优选的，所述的替换至非人动物CXCR4基因座为替换非人动物与NCBI登录号为NC_000067.7的第128516580-128519946所示序列相同的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
优选的，所述的插入位点位于CXCR4基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的人CXCR4基因、人源化CXCR4基因、人源化CXCR4蛋白或者编码人CXCR4蛋白的核苷酸序列通过CXCR4内源性调控元件调控。
本发明使用基因编辑技术进行CXCR4基因人源化的非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体进行非人动物的构建。
所述的靶向载体包含人CXCR4基因的全部或部分。优选包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选还包含1-2号内含子。
所述的靶向载体包含编码人CXCR4蛋白的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
其中，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000067.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为3000-4000bp。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000067.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为5000-6000bp。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CXCR4基因的1号至2号外显子上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CXCR4基因人源化的非人动物。
优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向CXCR4基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物CXCR4基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CXCR4基因上的靶序列上。优选的，所述的sgRNA的靶位点位于CXCR4基因的1号至2号外显子上。
本发明的第二方面，提供了上述构建方法获得的CXCR4基因人源化的非人动物。
本发明的第三方面，提供了一种CXCR4基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括敲除内源CXCR4基因的1号和/或2号外显子。
本发明的第四方面，提供了一种上述构建方法获得的CXCR4基因缺失的非人动物。
本发明的第五方面，提供了一种CXCR4基因缺失的细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官采用上述CXCR45基因缺失的非人动物的构建方法获得或者所述的细胞、组织或器官来源于上述构建的CXCR4基因缺失的非人动物。
本发明的第六方面，提供了一种CXCR4基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人CXCR4基因的全部或部分。优选包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选还包含1-2号内含子。
所述的靶向载体包含编码人CXCR4蛋白的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
其中，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000067.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为3000-4000bp。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000067.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为5000-6000bp。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CXCR4基因的1号至2号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含可选择的基因标记。
优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因（DTA）。
优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
本发明的第八方面，提供了上述靶向载体或上述的细胞在CXCR4基因修饰中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种人源化CXCR4基因，所述的人源化CXCR4基因包含人CXCR4基因的全部或部分。进一步优选的，包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子。再进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CXCR4基因转录的mRNA包含SEQID NO：8所示的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸，或者，包含具有SEQID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明的第十方面，提供了一种人源化CXCR4蛋白，所述的人源化CXCR4蛋白包含人CXCR4蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CXCR4蛋白包含人CXCR4基因的1号和/或2号外显子编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CXCR4蛋白包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CXCR4蛋白由上述人源化CXCR4基因编码。
本发明的第十一方面，提供了一种包含上述人源化CXCR4基因的构建体。优选的，所述的构建体表达上述的人源化CXCR4蛋白。
本发明的第十二方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第十三方面，提供了包含上述细胞的组织。
本发明的第十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括：
（a）应用上述的构建方法制备获得非人动物；
（b）将步骤（a）制备获得的非人动物与除CXCR4外的其他基因修饰的动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述多基因修饰的非人动物为双基因修饰非人动物、三基因修饰非人动物、四基因修饰非人动物、五基因修饰非人动物、六基因修饰非人动物、七基因修饰非人动物、八基因修饰非人动物或九基因修饰非人动物。
优选的，所述的除CXCR4外的其他基因修饰的动物选自基因PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73等修饰的动物中的一种或两种以上的组合。
本发明的第十五方面，提供了一种荷瘤动物模型，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法制备非人动物的步骤。
优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的非人动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第十六方面，提供了一种CXCR4基因修饰的细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官采用上述CXCR4基因人源化的非人动物的构建方法或多基因修饰的非人动物的构建方法获得，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述构建的CXCR4基因人源化的非人动物或者上述构建的多基因修饰的非人动物，或者上述的荷瘤动物模型。
本发明的第十七方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或上述的人源化CXCR4基因的应用，所述的应用为非疾病诊断、非疾病治疗目的，所述的应用包括：
A）涉及人类细胞的与CXCR4相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CXCR4相关的模型系统中的应用；
C）涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CXCR4相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D）在体内研究人CXCR4信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E）研究CXCR4基因功能，研究针对人CXCR4靶位点的药物、药效，研究与CXCR4相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的第十八方面，提供了一种上述的构建方法获得的CXCR4基因人源化的非人动物、上述构建方法获得的CXCR4基因缺失的非人动物、上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的荷瘤动物模型在制备动物模型中的应用。
本发明的第十九方面，提供了一种上述的构建方法获得的CXCR4基因人源化的非人动物、上述构建方法获得的CXCR4基因缺失的非人动物、上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的荷瘤动物模型在制备治疗或预防肿瘤、免疫相关疾病、心脑血管疾病、神经系统类疾病或炎症中的应用。
本发明的第二十方面，提供了一种人CXCR4特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测调节效果；其中，所述的个体选自上的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，上述的疾病模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物；优选的，所述的药物为抗体。优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、转移性乳腺癌、转移性胰腺癌。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“炎症”包括但不限于急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。
本发明所述的“心脑血管疾病”包括但不限于高血压、高血脂、脑卒中、心肌炎、心律失常、心肌梗塞、心力衰竭、动脉硬化、冠心病、心绞痛或先天性心脏病等。
本发明所述的“神经系统类疾病”包括但不限于脑血管疾病、神经系统变性病、中枢神经系统感染、中枢神经系统脱髓鞘疾病、运动障碍性疾病、癫痫、脊髓疾病、周围神经病、自主神经系统疾病、神经肌肉接头及肌肉疾病、神经系统遗传性疾病、神经系统发育异常性疾病、其他有睡眠障碍如失眠症、发作性睡病、不安腿综合征以及头痛等疾病。
本发明所述的“细胞”可以为任何来源于动物或人的细胞，包括但不限于淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞或者肿瘤细胞。
本发明所述的“人源化CXCR4蛋白”，包含来源于人CXCR4蛋白的部分和非人动物CXCR4蛋白的部分。
本发明所述的“人源化CXCR4蛋白”包含来源于人CXCR4基因的部分和非人动物CXCR4基因的部分。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CXCR4基因座”表示CXCR4基因上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CXCR4基因座可以是CXCR4基因1号外显子至2号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物，优选啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols. 154and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″ (D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；HandbookOf Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：人和小鼠CXCR4基因结构对比示意图（非按比例）；
图2：小鼠CXCR4基因人源化改造示意图（非按比例），其中，UTR区域来源于鼠；
图3：CXCR4基因打靶策略及靶向载体设计示意图（非按比例）；
图4：重组后ES细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；
图5：CXCR4基因人源化的小鼠FRT重组过程示意图（非按比例）；
图6：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照；
图7：C57BL/6野生型小鼠（WT）和CXCR4基因人源化纯合子小鼠（H/H）在CD4+T 细胞中的表达情况，其中，Iso为同型对照，mCXCR4为鼠CXCR4蛋白，hCXCR4为人CXCR4蛋白。
图8A：C57BL/6野生型小鼠（WT）和CXCR4基因人源化纯合子小鼠（H/H）在B细胞中的表达情况，其中，Iso为同型对照，mCXCR4为鼠CXCR4蛋白，hCXCR4为人CXCR4蛋白。
图8B：C57BL/6野生型小鼠（WT）和CXCR4基因人源化纯合子小鼠（H/H）在T细胞中的表达情况，其中，Iso为同型对照，mCXCR4为鼠CXCR4蛋白，hCXCR4为人CXCR4蛋白。
图9：RT-PCR检测CXCR4基因人源化小鼠体内CXCR4蛋白的表达情况，其中，+/+为野生型，H/H为CXCR4基因人源化纯合子，H2O为水对照，GAPDH为内参。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Brilliant Violet 510™ anti-mouse CD45 Antibody，来源于Biolegend，货号103138；
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCR β chain Antibody，来源于Biolegend，货号109228；
Brilliant Violet 421™ anti-mouse CD4 Antibody，来源于Biolegend，货号100438；
Brilliant Violet 711™ anti-mouse CD8a Antibody，来源于Biolegend，货号100759；
PE anti-mouse CD184 (CXCR4) Antibody，来源于Biolegend，货号146505；
PE Rat IgG2b, k isotype Ctrl Antibody，来源于Biolegend，货号400608；
Zombie NIR™ Fixable Viability Kit，来源于Biolegend，货号423106。
实施例1 CXCR4基因人源化小鼠的制备
本实施例对非人动物（如小鼠）进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化CXCR4蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化CXCR4蛋白。小鼠CXCR4基因（NCBI Gene ID：12767，Primary source：MGI: 109563，UniProt ID：G3XA59，位于1号染色体NC_000067.7的第128515936至128520036位，基于转录本NM_009911.3及其编码蛋白NP_034041.2（SEQ ID NO：1））和人CXCR4基因（NCBI Gene ID：7852，Primary source：HGNC: 2561，UniProt ID：P61073，位于2号染色体NC_000002.12的第136114349-136118149位，基于转录本NM_003467.3及其编码蛋白NP_003458.1（SEQ ID NO：2））。对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CXCR4基因座引入编码人CXCR4蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化CXCR4蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源CXCR4基因座上用人CXCR4基因的核苷酸序列（例如基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列等）替换小鼠相应序列，如将至少包含小鼠CXCR4基因的起始密码子ATG至终止密码子TGA的序列用对应的人基因组DNA序列替换，得到人源化CXCR4基因座，在一些实施例里，如图2所示，从外显子1的起始密码子至外显子2的终止密码子用对应的人基因组DNA序列替换，实现对小鼠CXCR4基因的人源化改造。
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图3中显示了靶向载体上含有小鼠CXCR4基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CXCR4序列的A片段。其中，上游同源臂序列（5’同源臂，SEQ ID NO：3）与NCBI登录号为NC_000067.7第128519947至128523767位核苷酸序列相同，下游同源臂序列（3’同源臂，SEQ ID NO：4）与NCBI登录号为NC_000067.7第128510022至128515618位核苷酸序列相同；人CXCR4序列（SEQ ID NO：5）与NCBI登录号为NC_000002.12的第136114869至136118060位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒（Neo cassette）。其中，Neo盒5’端与鼠的连接设计为5’-CTTCCTCGCCAGAGCTGAGTGAGATT AAGATCTGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAG -3’ （SEQ ID NO：6），其中，序列“GATTA”的最后一个“A”是鼠的最后一个核苷酸，序列“AGATC”的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠的连接设计为5’-AGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCAGTACTGATATCAAGCATATACCACGATGCCCAGCTTTTTATGAGCAT -3’（SEQ ID NO：7）内，其中序列“GATATC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“AAGCAT”的第一个“A”是鼠的第一个核苷酸。5’同源臂与人的连接设计为5’-CGTTTGGTGCTCCGGTAACCACCACGGCTGTAGAGCGAGTGTTGCCatggaggggatcagtgtaagtccagtttcaacctgctttgtca-3’（SEQ ID NO：36），其中，“TGTTGCC”的最后一个“C”为5’同源臂的最后一个核苷酸，“atggag”的第一个“A”为人的第一个核苷酸；人CXCR4的3’端与鼠的连接设计为5’-tttccactgagtctgagtcttcaagttttcactccagctaaCACTTATGCAAAGACATATATAATATATATATATATATATATGATAAAGAACTTTTTTA-3’（SEQ ID NO：37），其中，“agctaa”的最后一个“A”为人的最后一个核苷酸，“CACTTA”的第一个“C”为鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因（白喉毒素A亚基的编码基因（DTA））。改造后的人源化小鼠CXCR4的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQID NO：2所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR（PCR引物详见表1）和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot（分别用BglII或ScaI或EcoRV消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表2所示）检测，Southern Blot检测结果如图4所示，表明1个经PCR验证为阳性的胚胎干细胞（ES-01）为阳性的克隆，且无随机插入。
表1 PCR检测引物序列及目的片段长度
表2 Southern Blot酶和探针表
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针（5’Probe）：
5’Probe-F：5’- CAGGGTGACTCTAAACCCTTTCTGT -3’（SEQ ID NO：13），
5’Probe-R：5’-AGGGCTATCAAATGTCAAGTAGGGA-3’ （SEQ ID NO：14）；
3’探针（3’Probe）：
3’Probe-F：5’- GGGAAGCTGGTCATGCCTTGAAGAT -3’ （SEQ ID NO：15），
3’Probe-R：5’- ACAGCAGAGGTTAGCCAACAGCATT -3’ （SEQ ID NO：16）；
Neo探针（Neo Probe）：
Neo Probe-F：5’- GGATCGGCCATTGAACAAGAT -3’ （SEQ ID NO：17），
Neo Probe-R：5’- CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC -3’ （SEQ ID NO：18）。
将筛选出的正确阳性克隆细胞（黑色鼠）按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中（白色鼠），得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠（白色鼠）的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠（黑白相间）。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因（该过程示意图见图5）后，再通过互相交配即可得到人源化CXCR4基因纯合子小鼠。例性的F1代小鼠鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01至F1-07的小鼠均为阳性杂合小鼠，PCR测定引物如表3所示。
表3 PCR检测引物序列及目的片段长度
进一步采用流式细胞术检测CXCR4基因人源化小鼠体内CXCR4蛋白的表达情况。选取9周龄野生型C57BL/6小鼠和CXCR4基因人源化纯合子小鼠各1只，腹腔注射给予小鼠Anti-mCD3（7.5μg/只），24小时后，取脾脏细胞，用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510™anti-mouse CD45、鼠源T细胞表面抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCR β chain、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 421™ anti-mouse CD4、抗鼠CD8a抗体Brilliant Violet 711™anti-mouse CD8a、小鼠抗体anti-mouse CD184 (CXCR4) Antibody，PE，Biolegend™（mCXCR4-PE）(以PE大鼠抗体IgG2b K同型对照抗体Rat IgG2b, k isotype Ctrl, PE,Biolegend™ （IgG 2b）抗体作同型对照)，抗人CD184抗体anti-human CD184 (CXCR4)Antibody，APC，Biolegend™（hCXCR4-APC）(以鼠抗体Mouse IgG2a, κ Isotype CtrlAntibody，APC，Biolegend ™作同型对照)进行染色，然后进行流式检测，检测结果如图7、8A和8B所示，C57BL/6小鼠脾的CD4+T细胞、T细胞和B细胞均只表达鼠CXCR4蛋白，而CXCR4基因人源化纯合子小鼠脾的CD4+T细胞、B细胞和T细胞均只表达人CXCR4蛋白。以上表明本实施例成功构建出可表达人CXCR4蛋白的CXCR4基因人源化小鼠。
进一步采用RT-PCR检测CXCR4基因人源化小鼠体内CXCR4蛋白的表达情况。提取野生型C57BL/6小鼠和人源化CXCR4纯合子小鼠脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，引物序列如表4所示。
表4 RT-PCR检测引物序列及目的片段长度
实验结果显示（见图9），野生型C57BL/6小鼠细胞中可检测到鼠CXCR4的mRNA表达，人源化CXCR4纯合子小鼠细胞中可检测到人CXCR4的mRNA表达。
实施例2 体内药效验证
利用本方法制得的CXCR4人源化小鼠可以用于评估靶向人CXCR4的调节剂的药效。例如，取CXCR4人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人CXCR4的药物等，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
实施例3 双基因或多基因人源化小鼠
利用本方法或制得的CXCR4基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CXCR4小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CXCR4与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CXCR4小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到CXCR4基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CXCR4和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司
<120> CXCR4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
<130> 1
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 359
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
Met Glu Pro Ile Ser Val Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Glu Val Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Asn Lys Glu Pro Cys Phe Arg
20 25 30
Asp Glu Asn Val His Phe Asn Arg Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Phe
35 40 45
Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val
50 55 60
Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu
65 70 75 80
His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp
85 90 95
Ala Val Asp Ala Met Ala Asp Trp Tyr Phe Gly Lys Phe Leu Cys Lys
100 105 110
Ala Val His Ile Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile
115 120 125
Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr
130 135 140
Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Ala Val Tyr Val
145 150 155 160
Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe
165 170 175
Ala Asp Val Ser Gln Gly Asp Ile Ser Gln Gly Asp Asp Arg Tyr Ile
180 185 190
Cys Asp Arg Leu Tyr Pro Asp Ser Leu Trp Met Val Val Phe Gln Phe
195 200 205
Gln His Ile Met Val Gly Leu Val Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser
210 215 220
Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln
225 230 235 240
Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe
245 250 255
Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Val Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile
260 265 270
Leu Leu Gly Val Ile Lys Gln Gly Cys Asp Phe Glu Ser Ile Val His
275 280 285
Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu
290 295 300
Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Ser Ser Ala
305 310 315 320
Gln His Ala Leu Asn Ser Met Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu
325 330 335
Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu
340 345 350
Ser Ser Ser Phe His Ser Ser
355
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met
1 5 10 15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu
20 25 30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile
35 40 45
Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly
50 55 60
Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu
65 70 75 80
Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val
85 90 95
Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val
100 105 110
His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala
115 120 125
Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser
130 135 140
Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val
145 150 155 160
Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn
165 170 175
Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn
180 185 190
Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu
195 200 205
Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser
210 215 220
Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr
225 230 235 240
Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr
245 250 255
Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln
260 265 270
Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu
275 280 285
Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe
290 295 300
Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val
305 310 315 320
Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly
325 330 335
His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser
340 345 350
<210> 3
<211> 3821
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatagattc tgggagaccg agttctacaa agcaagcact aactaagtca tctctgaacc 60
cttcattaaa tcggccttta atgccgatgc ctcctgccat gtaccatcaa gataaaggac 120
tgtgcataag ctttctcccc gactaacttg gagcctgttt tggacagagc agagctttct 180
atcgcatacc cagggacggg cgaattaacc agctgcagtg taagcaacag gaggatgctt 240
gcccctgtgc cactggcttt ggaagtatcc cccacaaact gtggccaaaa ctagttattc 300
cctgggctaa agccatcctt agaacttggg gacactgcca aagccctgac agcccctgag 360
cctggccttt gttgccagag ccccagggga aagctgttaa ttctttaaat gaaggttcag 420
taaacaacca aggagcttgg ttcgctcagc ggtgggctag ataggaaaac tgctatctgt 480
gcactgtctt ccaggagctt ggactgtttg ggagagagga gtaaggcaca tttgctttaa 540
aaaaaaaaaa aagttgaatc acgagagatg tcactcaaag cagtatgtaa gtaaatgtgg 600
aggaagaagc actcagaggg ttcattgcaa ggatcagaaa aagacagtca tggtaatgga 660
gtggagagag cctgggctct ggagccaggc agactaggtg ggcacagatc cttaagtgaa 720
tacaaggagg ggagctagct cctccccctc agcaaacttc agcttccttg tcctgaaaaa 780
cagacctgcc tagtgagggg cttatcccag gttggatgca tgcgtggaac aagctttcag 840
gagacgtttg caatgttttt tctgatgtgc atcacaaagc tggggctgca actaagtagg 900
cagaccgccc atctcatgtg tacataaccc tgagttcaat cctagcacca cataaactgg 960
gcacggtgtt ggagacagga gcaccagaga ttcaaaaatg aactcagctc cacggggaac 1020
ttgaggccag accgggatac aggaaaccca ctgccagtgg agtaaagcaa gagcttccag 1080
caagctgggc aagcactctt accaacggag ctacgctact agtcctcggc atatccaggc 1140
acgactgaga tcatagacta acacagtttt cattcccacc ctgtgcagtt tctttcctaa 1200
gtatttcccc ttagtaataa caactcttca caaacactta ccacatccat attcactccg 1260
ttcgcagatg tactaaatca tctcaactag tctgctcatg gcggacactt agggctactc 1320
agctattact aactattcta ttattaacac tattgtcagc agcagccccg tgaagagctt 1380
tgtagcatga ctgcagtttc ctggggctac atcatgaaag gtagaattac taatctcaaa 1440
aggttctggc tgcatacaaa atacttttca ctgaagctgt tcaaacacca cacacacaca 1500
cacacacaca cacacacaca cacacactcc tgctactgac aagcgagaga cagctggtct 1560
tttccaatcc agaagccaaa tattatcttt gaaaggggga aaaaatccct ctcttttttt 1620
ttctctaatt ctatagtcac caaatagcat gtcattgttg ttttatctgc tttcctccag 1680
caaagagact tcacaggagc taaagagacc tgtgcagaag ctttcttttg tccaccaata 1740
atcaacaaat attaattatg caaatcattt tactcagatt gtactctctg tcgttcaggg 1800
acaggttcgc aagattccct ttctcccatt ttagcctttg ggaatgcagg aatttggagg 1860
ctagacacag ctcaccatcc tgctgctacc gatcttgaac accagcgctc ttttaatggg 1920
tctgatattc cggtccacgg gctcttctgt ctgtcctaac tagtttatgg aaatatgagc 1980
ctatgtttta gtaatgattg gatataatta aaagtgcttg tggaagttct tggcttttaa 2040
cttagcagtt tttgagggtc gcacttccta atttcatcct tagcttttct ggatcacata 2100
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ggaagatgga gagagacgag ttcccaggct gtaaaacagc tccccagcac ttccaaccga 2220
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tagcctacac aaagctctga tttaagccct atcagcacga aaattgggcg tggtggcaca 2340
caactgtaat cccagtacta ggcaggtgac aaacgggatc atcagaaatt catggtcatc 2400
cttaactaca tacggagcct gagtccagcc tgtactacat aaaactgcct caaacaaaac 2460
aaacaaacaa acaaacaaac aaacaaaaaa ggaacgggag aagtggggcg gggatggagt 2520
tgagggcgca gtctgggcct gcctatcctt tggtccattc caggaggggg tgggggcggt 2580
atctgggttg catagcaacc caggctcctg ctgccggatg tctcaccacc cccagtgccc 2640
ccggcattgg atcccgcggt ctctggctgg aggtctggtt ggttctgacc ccaccctttt 2700
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ccagctggga ctctgtaatt atctgttaac tagatgcatc cccctatgtg cttatgaaat 3060
gaaaatgaac cagtgtttct gtgcggattt cttaggatgt gattacacaa agtcctcgcc 3120
gctcaattct ttataataaa gcacatttca atcattttac atacacacac acccaaatct 3180
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cctggcggag gttccaacat tgccgcctac tggttaggca ggctccaagt cacacacccc 3420
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gtgggtaagg atggatgcgc gacccgcaga aacaccctgg ctggcatcct gctttcccca 3540
actctgagaa cattatccgg ccaggctctg gacccatact gacttaaaac acaacagcag 3600
tggctcttgg acttctgttt gcccgcgccc tgcgccccgc ccccgccagt ctcctcccgc 3660
cccgtccgag ctgcgcatgc gccgccccgg gagcgtgttt ttataaaagt ccggttcggg 3720
ccagaaactt caattttgtt gcctggtgca gcaggtagca gtgaaacctc tgaggcgttt 3780
ggtgctccgg taaccaccac ggctgtagag cgagtgttgc c 3821
<210> 4
<211> 5597
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcatatac cacgatgccc agctttttat gagcattgtg gaagtcagac ctaagttttc 60
acgcttacaa cagcaagcac tcaaagaacc aagccatctc cccagcccct gtcttaagtc 120
ctgtgtattt acttaagctt taccttaaga ggcagacttt ctgcttctac cactaaggga 180
gcccaggagc agaaagttta agaaactgca ttaaagatga gggacagcaa cagccagtat 240
ttcaaagcct gtgtggagag aagttgaagc ccttacactt tcaactcctc gtggaaggtg 300
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aaacttaaca ctgttgatcc atcttaccca gtattgccac cccaaaacac ctggtcagat 540
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catgcccaaa ataccctcct tgcaatatca cccatgcaaa tctcagcacc tttaccctga 660
ctcttattac aacatctagt gtctcctgaa gggctcaact aaatctgtta aagattaatg 720
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tttaagagtt gaaagctcta ctgaagcaag ctcttcattt tgcacaagat ttgagagcct 840
tatgtaataa cccagagcta tttacactaa cattgtgcaa gccgcaaact cttgagtaaa 900
ttgcaggtcc ggtctcctgg agaccggaga agataacttc tcatccatac tggtttgccc 960
cttggaacat atacagggtg ctgtaggcac acacccaggc agtaagtgat atataattaa 1020
ggcaatattt ggtcttttag taattgtttc tggcacagaa aatccgtttg ggaaggaaaa 1080
attgcaaggc cttatctttc ttaggcaaat cacatttgtt caagacaaat tatagatcct 1140
gtgaagggaa ataacttaat tacttaaaat aaaatctaat ttagctgtag gtttttgcag 1200
cagcctatgg atctggggta cttcatgccg gtgttcctat tccacttgag gacacaatta 1260
gattttcagt aggaaattat cttgagattt cttgccttcc tctggggagt cttaattgga 1320
tcacgcttag acatactttt cgtagttttc gatgtgcaca ctggaaggct tggtctcgaa 1380
gctgtggcca ttgtggcagg cttcactcgg aatctgctct ataaatattt attcgcaggg 1440
agacaatagg agaaaacctt gggaggaatt ctttctcttt tctcatcttg gcttgaaacc 1500
tcctcacccc agattcctct cctttgcctt ggacccccaa caaaaggaac ttagtctaaa 1560
ccaaattccc agcactgtca gtctccatgg caattgcagc ctccctggga acaaaggcag 1620
atagctcctt ctctaaaaaa gaaaagaatt tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagtc 1680
tttactccct ccctcctcca aaaggagact ccccagagtc attctctgtc ccaactctct 1740
catgacaaac tcctccaaag ccttccctgt gtcctggttg gtctggcaat gtgaggaaac 1800
ccagtctgct tgccagccct cacatgaagc aactgattgt tccttgggct cctcccccat 1860
gaatggggct cttgaaggtc agtaatgtag ctacaatcgt ataatggaag ctaaaatatt 1920
taaattgtat gcatgctgcc aataatggcg tgaacatgac atctgactta caagtgatgt 1980
caggtctcta actgggcagg aacttgaaat gccactaggt gatctatctt tcaggcccat 2040
gggcttccca gcctcctttc atggttatat ttgtatgaac acatccattc cagggtgctc 2100
ttttagaaga aaatgggctt tgttttagta attgaaccaa gtatctatag tttttctccc 2160
atctgatatt cagatgctaa ataaaagctc cacaaacagt tgggcattat tgttccgtgt 2220
gatgctcatt taggagaacc aaggacccct ggagacaaaa ttcaaattac tacagaaagc 2280
agcccagcat ccccacaatg ctatgcttag aaatgtgctc ttacaaccta gcatcataag 2340
agtgcacaca actatcatgg gtagcctctt ttgttagtca ctgctaaaga acttccctag 2400
aagccataac aacattccca agagtacaac ctcagaggaa cagtagtgtt ctggggccaa 2460
aagtaaagaa aatgaattct ttaaatgaaa tggtcctgga gccatattgc cctccaggtc 2520
acatactgat agcttctgga catcttctga gtgatcctat tgaagagagc aggaaactgg 2580
agctagaggc cagacacatt acttcatatc ctataatgtt cacaaaacta tctgcctcaa 2640
agaactacct gacccagaat atcaattgta ttccaacttc agaaaagcct ttttaagggc 2700
agtaactcta tcagtaaatc actcacaggg gagggggtgg agacagactg aaccacagca 2760
cttgatgggc agatgtcttg gttagggttt tactgctgtg aacagacacc atgaccaagg 2820
cagcatttat aaggacaaca tttaattggg gctggcttac aggttcagag gttcagtcta 2880
ttatcatcaa ggtgagaaca tggcagcgtc caggcagtca tggtacagga ggagttgaga 2940
gttctacatc ttcatactga cttctagaca ggtaggatga gggtcttaag gtccacaccc 3000
acaatgacac acctactcca acaaggccac acctcctaat agtgccactc cctgggacaa 3060
gcatatataa accagcatag cagccatttc ctacttggtg ggttcaggac taggagagac 3120
cctttctcaa aataaacaac aaaaaaatgt agatggcatc tgaagaatga cagccatggt 3180
tgtcttctgt cttacacaca cacacacaca cacacacaca cacacgtgca cacatgaata 3240
cacatacaga cacctgcaca gtcatgcaca aatgctcaca cacaaacaca tgcatgcaca 3300
cacacactca cataaagaat cccttttaga gttatggtgc ttatgaaaat aaagatatat 3360
ataaccagta taatctgtgt ttatataaat aagtttattc tagtgtgtgt gtgtgtgtgt 3420
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagtac catcgctcga 3480
atgtggaatt cagaagacaa cttaaaggag ttgattgtct cctttcaaca tgtgggcccc 3540
tgggatgaaa ctcaagcttg ccagctaggc tacaagtgcc tttacccact cagccatgtt 3600
gtcagcccca aaccagaata attccacaaa ataacatgaa tccatgaagg ctcttgaatg 3660
atttgctcaa ccaaaatcca gaatttgaaa tcctaccacc ttaaggggat ggctttgaag 3720
tgagacctct gggaagaggc aggtcataga attcctgatc cagagcagga gcggtgccct 3780
aggaacctag ctagcctcgt agatcacaga ggactcagct caaagcccat catctgtgaa 3840
ccacaacgca ggcccttgcc acataccgaa tctgctagtg ccttaatctc cactttccca 3900
gcctcctgag aaagacgttt ctgttgttgc taaggaatcc aacctagtat acatgagagt 3960
ttctgttatg gattccaact tcttcctcta gccttggcta ttgggtttca ttccagggca 4020
ctgtgctccc tccctggcat tcccttctca cacaggccta gctgtccatc ctaacacttt 4080
gcaacacgtc ctggttttct tcttttaaga ctagctggga atgatgaggg gccagcccat 4140
tcttccacca actgccatcc atcgattcag agtcttttaa accaaccctg ttaagtcaga 4200
caattaaaat cttgtaaacc ttccagaggg gaggggtggg gacttcaact gtaaatgcct 4260
gctagctaca gactaacttg agcgatctgc tctgccaaga ggccacataa ggggaaagaa 4320
ttttttaaaa ccaaacaaac aaaaggtgtt caaccaaact aggccaggtg ctcagtgttt 4380
atctgcgtga ttaagttgat ttacatactg cagttcaact aaccagaacc cagctcatca 4440
acactcttca ttaaagaaaa ttacttcctc atatgcgact ctgtcaagaa gaaagtcaca 4500
catgctgaca gccactgaat cctaggcact cttactcagg atacaagagt cccaccagat 4560
agatgtccct atctctgtct tcaggagagg acactgcaaa cgaaattaaa caacaaatga 4620
aaggccattg ctttcccact ccatacagta aagatggcat tgaaactgaa cctctaagtt 4680
ctgagacata gtctcaagtt cttataattg tgtgtgtatg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 4740
tgtgtgtgtg tgtgtgatat gttctgtgtc tctgtttgtc tctatttgtc tgtctgtctg 4800
tctgtctctc tgtctctgtc tctgtctctg tctctgtctc tctctctctc tctctctctc 4860
tctcacacac acacacacac acacacacac acacacacac ttgtatgttt tgagataggt 4920
tctcatgtag cccagtctag cctcaagcag ccaaggctaa gctctccctc ttaaataatg 4980
gaattgtatc tttgaaccat aatgcccctt gtaatgtgtg ctgggaacca tacccaggct 5040
tttgtgcata ctaggcaagc actgtcctga ctgaatcaca ccctagcctt attaatccaa 5100
gttaatttac catttctttc cagttctagt tgatggcatt aatggttacc accacttacc 5160
agtgacatac accaacgact ttgattattt catctttata gatgaaatcc ctccacacag 5220
taggtattat taccgttgta tagacagaga agcagaatca tagaacgctg tctaaagctg 5280
acccaaagtc acatacttaa tacatgctaa aacctggagt tagacaaggc agtctaacct 5340
gtagcaagcc tctcttcact ttggggtctg gttaattcct ttgtgtcatt cagtattcaa 5400
agaactggcc atgaggtcaa ataggtattt tgtatgactg gggggtgtgg tgttgagagg 5460
ggcaaaagga ttgggtgttc gagaccagtc tgtactacac aagattactg cctcaaaata 5520
ataaaaacac ccaaaaggtc atccattctc ttttttattt ttcaggttta aacaatagac 5580
atttacctgg tcctatt 5597
<210> 5
<211> 3801
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tggaggggat cagtgtaagt ccagtttcaa 120
cctgctttgt cataaatgta caaacgtttg aacttagagc gcagcccctc tccgagcggg 180
cagaagcggc caggacattg gaggtacccg tactccaaaa aagggtcacc gaaaggagtt 240
ttcttgacca tgcctatata gtgcgggtgg gtgggggggg agcaggattg gaatcttttt 300
ctctgtgagt cgaggagaaa cgactggaaa gagcgttcca gtggctgcat gtgtctcccc 360
cttgagtccc gccgcgcgcg gcggcttgca cgctgtttgc aaacgtaaga acattctgtg 420
cacaagtgca gagaaggcgt gcgcgctgcc tcgggactca gaccaccggt ctcttccttg 480
gggaagcggg gatgtcttgg agcgagttac attgtctgaa tttagaggcg gagggcggcg 540
tgcctgggct gagttcccag gaggagattg cgcccgcttt aacttcgggg ttaagcgcct 600
ggtgactgtt cttgacactg ggtgcgtgtt tgttaaactc tgtgcggccg acggagctgt 660
gccagtctcc cagcacagta ggcagagggc gggagaggcg ggtggaccca ccgcgccgat 720
cctctgaggg gatcgagtgg tggcagcagc taggagttga tccgcccgcg cgctttgggt 780
ttgaggggga aaaccttccc gccgtccgaa gcgcgcctct tccccacggc cgcgagtggg 840
tcctgcagtt cgagagtttg gggtcgtgca gaggtcagcg gagtggtttg acctcccctt 900
tgacaccgcg cagctgccag ccctgagatt tgcgctccgg ggataggagc gggtacgggg 960
tgaggggcgg gggcggttaa gaccgcacct gggctgccag gtcgccgccg cgaagactgg 1020
caggtgcaag tggggaaacc gtttggctct ctccgagtcc agttgtgatg tttaaccgtc 1080
ggtggtttcc agaaaccttt tgaaaccctc ttgctaggga gtttttggtt tcctgcagcg 1140
gcgcgcaatt caaagacgct cgcggcggag ccgcccagtc gctccccagc accctgtggg 1200
acagagcctg gcgtgtcgcc cagcggagcc cctgcagcgc tgcttgcggg cggttggcgt 1260
gggtgtagtg ggcagccgcg gcggcccggg gctggacgac ccggcccccc gcgtgcccac 1320
cgcctggagg cttccagctg cccacctccg gccgggttaa ctggatcagt ggcggggtaa 1380
tgggaagcca cccgggagag tgaggaaatg aaacttgggg cgaggaccac gggtgcagac 1440
cccgttacct tctccaccca ggaaaatgcc ccgctcccta acgtcccaaa cgcgccaagt 1500
gataaacacg aggatggcaa gagacccaca caccggagga gcgcccgctt gggggaggag 1560
gtgccgtttg ttcattttct gacactcccg cccaatatac cccaagcacc gaagggcctt 1620
cgttttaaga ccgcattctc tttacccact acaagttgct tgaagcccag aatggtttgt 1680
atttaggcag gcgtgggaaa attaagtttt tgcgctttag gagaatgagt ctttgcaacg 1740
cccccgccct ccccccgtga tcctcccttc tcccctcttc cctccctggg cgaaaaactt 1800
cttacaaaaa gttaatcact gcccctccta gcagcaccca ccccaccccc cacgccgcct 1860
gggagtggcc tctttgtgtg tatttttttt ttcctcctaa ggaaggtttt ttttcttccc 1920
tctagtgggc ggggcagagg agttagccaa gatgtgactt tgaaaccctc agcgtctcag 1980
tgcccttttg ttctaaacaa agaattttgt aattggttct accaaagaag gatataatga 2040
agtcactatg ggaaaagatg gggaggagag ttgtaggatt ctacattaat tctcttgtgc 2100
ccttagccca ctacttcaga atttcctgaa gaaagcaagc ctgaattggt tttttaaatt 2160
gctttaaaaa ttttttttaa ctgggttaat gcttgctgaa ttggaagtga atgtccattc 2220
ctttgcctct tttgcagata tacacttcag ataactacac cgaggaaatg ggctcagggg 2280
actatgactc catgaaggaa ccctgtttcc gtgaagaaaa tgctaatttc aataaaatct 2340
tcctgcccac catctactcc atcatcttct taactggcat tgtgggcaat ggattggtca 2400
tcctggtcat gggttaccag aagaaactga gaagcatgac ggacaagtac aggctgcacc 2460
tgtcagtggc cgacctcctc tttgtcatca cgcttccctt ctgggcagtt gatgccgtgg 2520
caaactggta ctttgggaac ttcctatgca aggcagtcca tgtcatctac acagtcaacc 2580
tctacagcag tgtcctcatc ctggccttca tcagtctgga ccgctacctg gccatcgtcc 2640
acgccaccaa cagtcagagg ccaaggaagc tgttggctga aaaggtggtc tatgttggcg 2700
tctggatccc tgccctcctg ctgactattc ccgacttcat ctttgccaac gtcagtgagg 2760
cagatgacag atatatctgt gaccgcttct accccaatga cttgtgggtg gttgtgttcc 2820
agtttcagca catcatggtt ggccttatcc tgcctggtat tgtcatcctg tcctgctatt 2880
gcattatcat ctccaagctg tcacactcca agggccacca gaagcgcaag gccctcaaga 2940
ccacagtcat cctcatcctg gctttcttcg cctgttggct gccttactac attgggatca 3000
gcatcgactc cttcatcctc ctggaaatca tcaagcaagg gtgtgagttt gagaacactg 3060
tgcacaagtg gatttccatc accgaggccc tagctttctt ccactgttgt ctgaacccca 3120
tcctctatgc tttccttgga gccaaattta aaacctctgc ccagcacgca ctcacctctg 3180
tgagcagagg gtccagcctc aagatcctct ccaaaggaaa gcgaggtgga cattcatctg 3240
tttccactga gtctgagtct tcaagttttc actccagcta acacagatgt aaaagacttt 3300
tttttatacg ataaataact tttttttaag ttacacattt ttcagatata aaagactgac 3360
caatattgta cagtttttat tgcttgttgg atttttgtct tgtgtttctt tagtttttgt 3420
gaagtttaat tgacttattt atataaattt tttttgtttc atattgatgt gtgtctaggc 3480
aggacctgtg gccaagttct tagttgctgt atgtctcgtg gtaggactgt agaaaaggga 3540
actgaacatt ccagagcgtg tagtgaatca cgtaaagcta gaaatgatcc ccagctgttt 3600
atgcatagat aatctctcca ttcccgtgga acgtttttcc tgttcttaag acgtgatttt 3660
gctgtagaag atggcactta taaccaaagc ccaaagtggt atagaaatgc tggtttttca 3720
gttttcagga gtgggttgat ttcagcacct acagtgtaca gtcttgtatt aagttgttaa 3780
taaaagtaca tgttaaactt a 3801
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttcctcgcc agagctgagt gagattaaga tctgaattcc gaagttccta ttctctag 58
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaacttca tcagtcaggt acataatggt ggatccagta ctgatatcaa gcatatacca 60
cgatgcccag ctttttatga gcat 84
<210> 8
<211> 1800
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattttgttg cctggtgcag caggtagcag tgaaacctct gaggcgtttg gtgctccggt 60
aaccaccacg gctgtagagc gagtgttgcc atggagggga tcagtatata cacttcagat 120
aactacaccg aggaaatggg ctcaggggac tatgactcca tgaaggaacc ctgtttccgt 180
gaagaaaatg ctaatttcaa taaaatcttc ctgcccacca tctactccat catcttctta 240
actggcattg tgggcaatgg attggtcatc ctggtcatgg gttaccagaa gaaactgaga 300
agcatgacgg acaagtacag gctgcacctg tcagtggccg acctcctctt tgtcatcacg 360
cttcccttct gggcagttga tgccgtggca aactggtact ttgggaactt cctatgcaag 420
gcagtccatg tcatctacac agtcaacctc tacagcagtg tcctcatcct ggccttcatc 480
agtctggacc gctacctggc catcgtccac gccaccaaca gtcagaggcc aaggaagctg 540
ttggctgaaa aggtggtcta tgttggcgtc tggatccctg ccctcctgct gactattccc 600
gacttcatct ttgccaacgt cagtgaggca gatgacagat atatctgtga ccgcttctac 660
cccaatgact tgtgggtggt tgtgttccag tttcagcaca tcatggttgg ccttatcctg 720
cctggtattg tcatcctgtc ctgctattgc attatcatct ccaagctgtc acactccaag 780
ggccaccaga agcgcaaggc cctcaagacc acagtcatcc tcatcctggc tttcttcgcc 840
tgttggctgc cttactacat tgggatcagc atcgactcct tcatcctcct ggaaatcatc 900
aagcaagggt gtgagtttga gaacactgtg cacaagtgga tttccatcac cgaggcccta 960
gctttcttcc actgttgtct gaaccccatc ctctatgctt tccttggagc caaatttaaa 1020
acctctgccc agcacgcact cacctctgtg agcagagggt ccagcctcaa gatcctctcc 1080
aaaggaaagc gaggtggaca ttcatctgtt tccactgagt ctgagtcttc aagttttcac 1140
tccagctaac acttatgcaa agacatatat aatatatata tatatatata tgataaagaa 1200
cttttttatg ttacacattt tccagatata agagactgac cagtcttgta cagttttttt 1260
tttttattga ctgttgggag tttatgttcc tctagttttt gtgaggtttg acttaattta 1320
tataaatact tttttttgtt tgtttgtttc atgtgaatga gtgtctaggc aggacctgtg 1380
gccaagttct tagtagctgt ttatctgtgt gtaggactgt agaactgtag aggaagaaac 1440
tgaacattcc agaatgtgtg gtaaattgaa taaagctagc cgtgatcctc agctgttgct 1500
gcataatctc ttcattccga ggagcacccc acccccaccc ccacccccac cccattctta 1560
aattgtttgg ttatgctgtg tgatggtttg tttggttttt ttttttgttg tttttgtttt 1620
tgtttttttt ctgtaaaaga tggcacttaa aaccaaagcc tgaaatggtg gtagaaatgc 1680
tgggggtttt tttgtttgtt tgttttttca gttttcaaga gtagattgat ttcactccct 1740
acaaatgtac agtcttgtat tacattgtta ataaaagtca atgataaact taaaaaaaaa 1800
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggacatag cgttggctac 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctctaaacg ttctgctttg ttgct 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctctccagtg gtggcattgc aagta 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcggatcaa ctcctagctg c 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagggtgact ctaaaccctt tctgt 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agggctatca aatgtcaagt aggga 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggaagctgg tcatgccttg aagat 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acagcagagg ttagccaaca gcatt 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatcggcca ttgaacaaga t 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagaagaact cgtcaagaag gc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cggttcgggc cagaaacttc aa 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
actcctgttt tcaggaggac cag 23
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaaggccatg ccagtgagct t 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccgcactata taggcatggt caag 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccaatgatc tagctgtctt cctc 24
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaaagtctgc ctcttaaggt aaagc 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
taggatcttc ctgcccacca 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agggcctctg tgatggagat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cttgactggc atagtcggca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacagtggaa gaaggcgagg 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cttcctatgc aaggcagtcc a 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agatgaatgt ccacctcgct 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aggaaccctg tttccgtgaa g 21
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaagctagg gcctcggtg 19
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcaccatctt ccaggagcga ga 22
<210> 36
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cgtttggtgc tccggtaacc accacggctg tagagcgagt gttgccatgg aggggatcag 60
tgtaagtcca gtttcaacct gctttgtca 89
<210> 37
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tttccactga gtctgagtct tcaagttttc actccagcta acacttatgc aaagacatat 60
ataatatata tatatatata tatgataaag aactttttta 100