具体实施方式

1. 介绍

本文中所描述的流量芯片、系统和方法解决了目前可用的可重构微流体系统所提出的挑战，因为高气体压力需要施加足够的力来克服最初的静水和疏水屏障，以使流体通过通道，但是一旦通道排空，便没有足够的力来迫使空气通过目的地孔。流量芯片、系统和方法部分基于发现和利用狭窄的窗口来实现这种平衡，这种平衡可以通过调整诸如通道尺寸、流量芯片材料和流体组成等参数来调整。目前的流量芯片和系统适合于运行多步分析（例如诸如ELISA），这可以需要具有带有不同横截面积和长度的多个通道的流量芯片，并且包含带有不同物理特性的试剂（例如缓冲液、基质、终止液、阻滞剂等）。

在这里我们描述了控制无阀微流体流量芯片中的流体移动的方法，这些无阀微流体流量芯片在孔/通道接口（WCI）使用高压力设置、中间压力设置、低压力设置和真空压力设置以及表面张力引起的流体阻力来提高稳健性。另外，我们提供用于使用部分真空从流量芯片去除流体的系统和方法。进一步地，我们提供具有通道的流量芯片，这些通道具有结构流体流动屏障结构或配置，这些结构流体流动屏障结构或配置增加了疏水和静水屏障，而不会大幅影响整体流体流动。

2. 无阀微流体流量芯片

提供了无阀（例如毛细管力驱动的）微流体流量芯片。在一些实施例中，流量芯片包括由微流体通道连接的一个或多个微流体腔网络，其中，储器是各自仅连接到一个通道的腔，并且节点是各自连接到两个或两个以上的通道的腔；其中：i）第一多个通道各自仅连接两个腔；ii）第二多个通道包括流体流动屏障结构或配置；以及iii）多个腔包括气体压力端口。在一些实施例中，第一多个通道和第二多个通道可以是相同的、不同的或部分相同的（例如重叠）。“流体流动屏障结构或配置”指的是具有增加的流体流动阻力的微流体通道的结构特征。将流体从源孔通过通道推向目的地孔所需的压力被称为“突破压力”。通常，结构特征是与相邻的腔之间的直路径的高度非线性偏差、通道（不管是否是直的）的变窄或收缩、通道中引入几何结构的突然和实质性变化的空隙（例如密封腔），包括通道尺寸（高度和宽度）的增加、和/或通道的表面条件的变化（例如粗化）。增加的流体流动阻力可以是由于阻止流动的一个或多个力造成的，包括但不限于由静摩擦、表面能量、表面张力、流体密度和/或流体粘度产生的阻力。

目前所描述的流量芯片比本领域中所描述的无阀微流体流量芯片有改进，例如美国专利公开案第US2017/0021351号、第US2017/0021352号和第US2017/0021353（作为美国专利第9,733,239号发布），这些申请为了所有目的通过引用全部并入本文，因为当前流量芯片中的多个通道包括允许更精确地控制流体流动的流体流动屏障结构或配置，并且这些通道在中间正压力的情况下用于避免将气泡或空气间隙引入通道中。

流体流动屏障结构或配置可以位于沿微流体通道的长度的任何位置。在一些实施例中，流体流动屏障结构或配置位于腔与通道的接口处或附近。在一些实施例中，流体流动屏障结构或配置主要位于腔和微流体通道的接口处，例如距离腔约0 mm至约5 mm、6 mm、7mm、8 mm、9 mm或10 mm。在适当的情况下，微流体通道可以具有一个、两个或两个以上的流体流动屏障结构或配置。在具有两个或两个以上的流体流动屏障结构或配置的微流体通道中，流体流动屏障结构或配置可以是相同的或不同的。流体流动屏障结构或配置还可以包含增强疏水屏障。

在一些实施例中，流体流动屏障结构或配置将流体流动的通道阻力或移动流体所需的压力增加至少约20%，例如至少约25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多，例如与没有流体流动屏障结构或配置的通道（例如直的、不受约束的通道）相比。流体流动屏障结构或配置可以是微流体通道的任何结构配置，该微流体通道增加了流体流动阻力，例如与没有流体流动屏障结构或配置的线性的或基本上线性的和基本上不受约束的微流体通道相比，例如与具有恒定和全宽度和高度尺寸的线性微流体通道相比。在一些实施例中，流体流动屏障结构或配置包括通道、肋特征和/或具有明显非线性的路径的通道的收缩或变窄。在一些实施例中，非线性的特征是通道方向上的突然变化，例如这可以是从45度到135度，例如超过1个至5个通道宽度的长度。变化或方向中的转向的数量按顺序可以是从1到10或更多。在图7B中图示了作为通道的收缩或变窄的流体流动屏障结构或配置；在图11中图示了肋特征。在一些实施例中，流体流动屏障结构或配置包括选自由蛇形或S曲线几何结构、接合点、鱼骨或分离通道组成的组的几何结构。在图7A中图示了蛇形或S曲线流体流动屏障结构。在一些实施例中，流体流动屏障结构或配置包括位于与通道一致的位置的空隙（例如密封腔）。空隙流体流动屏障结构或配置在几何结构上引入突然和实质性变化，包括高度和宽度尺寸的增加，如图9A至图9B所示。在一些实施例中，腔中的一个或多个或复数个不是圆柱形的，并且包括位于腔与一个或多个通道的接合点处的凹曲度，使得腔形成从腔向一个或多个通道延伸的半岛（例如腔的形状是莲花垫）。参见例如图7C。在一些实施例中，密封腔或空隙被并入通道中，例如，如图9A至图9B所示。在一些实施例中，高度减小的区域（例如肋特征）被并入通道中，例如，如图11所示。在一些实施例中，通道可以具有多个流体流动屏障结构或配置，例如2个、3个、4个或更多个流体流动屏障。

在一些实施例中，腔中的一个或多个或复数个包括进入腔的一个或多个通道的直的且垂直的入口，使得在通道进入腔的情况下，导致几何机构急剧变化（例如90°），例如，如图14A至图14B所示。垂直包括直的通道区域与一小段弯曲表面的交叉点，如图14A至图14B所示。在一些实施例中，对节点进行配置，使得入口（输入、输送）通道和出口（输出、分析）通道接合点位于不同的竖直平面中，例如，如图15A至图15B所示。例如，输入（输送）通道可以在节点上面的空间的一个或多个入口点进入，并且输出（分析）通道可以在节点的底部的一个或多个出口点离开。输入通道位于腔的外直径处或在该外直径附近（例如在3 mm直径腔的外边缘的约1 mm内，例如在腔的直径的外1/3内），而输出通道位于腔的中心处或在该中心附近（例如在中心的约1 mm内，例如，在腔的直径的内1/3内）。在一些实施例中，在入口通道和出口通道之间的区域中的源腔中保留定义数量的流体。

类似于在美国专利公开案第US2017/0021351号、第US2017/0021352和第US2017/0021353号（作为美国专利第 9,733,239号发布）中所描述的微流体系统，本文中所描述的无阀微流体流量芯片是基于由可以是疏水的微流体通道连接的微流体腔网络。每个腔都可以被分类为储器或节点，并且包括压力端口，气体压力可能被施加到该压力端口。气体压力根据流体输送规则施加到储器和节点的顺序使流体能够从系统中的任何储器移动到任何其他储器。

无阀微流体流量芯片可以从储器、节点和通道的基本部件设计，以执行许多不同的微流体任务，包括例如同质分析和非同质分析以及微孔板接口连接。系统可扩展到任意数量的流体输入和输出，并且它们可以用于操纵用分析物对样品进行多重分析所必需的非常小的流体体积，以执行多个同时分析。

微流体腔是用于在微流体流量芯片中积累流体的内部体积。储器是仅连接到一个微流体通道的微流体腔。节点是连接到一个以上的微流体通道的微流体腔。最后，通道是节点或储器之间的微流体通路。当前的无阀微流体系统中的每个通道都连接至少两个腔。所设想的是流量芯片设计，其中，存在通道交叉点，并且流体流动由不同通道中的微分阻力控制。

节点设计为呈现比通道更低的流体流动阻力。腔或通道的流体流动阻力与其横截面积的平方成反比。因此，通道和储器之间或通道和节点之间的流动阻力差异可能通过不同的横截面积来设计。

储器储存流体，例如样品或试剂。另一方面，节点最初可以储存流体，并且在一系列的流体输送步骤中储存其他流体。可能提供用于将流体自动装载到储器或将流体从储器卸载的规定，其中，小塑料管从储器延伸到玻璃瓶，或其中，自动移液管站是示例。

只要提供了储器、节点、通道和压力端口，无阀微流体流量芯片便可以按照各种方式实施；并且通道中的流体流动阻力大于节点中的流体流动阻力。在一些实施例中，通道是疏水的，例如，以在通道两端的压力相等或接近相等时，防止流体流动。在当前的流量芯片中，通过微流体通道的流体流动由施加到腔（例如储器和节点）的气体压力差控制。通过疏水通道的流体流动表现出明显的阈值效应。首先，当从通道的一端到另一端的压力差增加时，没有流体流动。然而，一旦达到阈值压力差，通过通道的流体流动速率便会随着施加的压力差的增加而增加。通道的疏水性设置阈值压力差，并且系统中所使用的高压力和低压力之间的差被设计为大于输送阈值压力。当压力在源腔端是高的并且在目的地腔端是低的时，流体在通道中从源腔流到目的地腔。中间气体压力不足以克服疏水阈值，但是如果流体已经在流动（例如通过使源腔承受高气体压力），则中间气体压力足以允许流体流动，尽管处于降低的速率。如果流体已经在流动并且压力在通道的源腔端减小到中间气体压力并且在通道的目的地端保持很低，则流体继续在通道中从源腔流到目的地腔，但是空气没有被引入通道中。

疏水通道的疏水阈值压力防止节点和储器中的流体在没有施加压力差时泄露到通道中。阈值压力设计为足够大，以防止流体流动，该流体流动可能由储器或节点中的流体的重量所造成的疏水压力或在所施加的压力在高压力和低压力之间切换时可能存在的剩余压力差驱动。因此，“疏水通道”被定义为表现出压力阈值的通道，该压力阈值在通道的两端之间的压力差小于指定或阈值压力时防止流体泄露到通道中。在示例无阀微流体系统中，通道设计为具有约1 kPa疏水阈值压力。

无阀微流体流量芯片的一种实施方式包括基质层、疏水流体层和气动层。图2图示了在横截面中看到的无阀微流体流量芯片。在图2中，微流体流量芯片105包括基质层110、疏水流体层115和气动层120。在图2和图3A至图3F中，疏水流体层中的腔被标记为A、B和C。腔A和B由通道125连接，而腔B和C由通道130连接。腔A和C被分类为储器，因为它们各自仅连接到一个通道。腔B被分类为节点，因为它连接到一个以上的通道；B连接到通道125和通道130。

压力源135、140和145分别通过气体管150、155和160连接到储器A、节点B和储器C。三个压力源中的每一个都能够提供至少两种不同的压力：高气体压力和低气体压力。图2和图3A至图3F中的标记分别指的是压力源提供高压力、中间压力或低压力的能力。压力源145还能够提供小于大气压力的压力，例如部分真空。

制造与微流体流量芯片105一样的结构的几种不同的方式是可能的。作为第一示例，基质110可能由玻璃、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚对苯二甲酸乙二醇酯或塑料制成。疏水流体层115可能由PDMS制成。用于对PDMS进行铸造以定义疏水微流体通道的模具可能用可编程切割机来生产，该可编程切割机用于乙烯基贴花或在诸如SU-8的环氧基负性光刻胶中的定义光刻法。在图案化PDMS被固化和从模具去除之后，它可能被粘结到平整基板。气动层120还可能由PDMS制成。气体管可能由聚醚醚酮（PEEK）管子制成，该PEEK管子在插入PDMS中的大小适当的孔中时形成实用的密封。作为PDMS的合适的替代的疏水材料包括聚丙烯（PP）、环烯烃聚合物（COP）、环烯烃共聚物（COC）、氟化乙丙烯（FEP）和聚四氟乙烯（PTFE）。在表1中提供这些材料的公开的水接触角。

表1

在一些实施例中，可以通过使用添加剂、表面涂层或表面改性对聚合物进行改性，以提高其疏水性。

在示例微流体流量芯片，通道125和130的横截面尺寸可以是在约25 μm至约50 μm、约100 μm、约150 μm或约200 μm（高度）和约25 μm至约50 μm、约100 μm、约150 μm、约200μm、约250 μm、约300 μm、约350 μm、约400 μm、约450 μm或约500 μm（宽度）的范围内。储器A和C以及节点B的大小可以在直径约1 mm到约2 mm、约2.5 mm、约3 mm、约3.5 mm、约4 mm、约4.5 mm、约5 mm、约5.5 mm或约6 mm之间。储器A和节点B之间的距离可以在约5 mm到约25mm、约50 mm、约75 mm或约100 mm之间；节点B和储器C之间的距离可以在相同的范围内。典型流量芯片中的腔的横截面积比通道的横截面积大约100倍至400倍。因此，通道的流动阻力比腔的流动阻力大10,000倍至160,000倍。包括流体流动屏障结构或配置的通道和腔的替代设计导致这些通道的流动阻力比未更改的通道的流动阻力大约20%、约50%、约100%、约200%、约500%或约1000%。

制造与微粒体流量芯片105一样的结构的另一种方式包含对疏水热塑性聚合物（诸如聚丙烯（PP）或环烯烃聚合物/共聚物（COP/COC））进行热压花，然后进行溶剂辅助的层压，以形成封闭的疏水通道。制造与微粒体流量芯片105一样的结构的第三种方式是对诸如PP、COP或COC的疏水聚合物进行注塑成型。最后，例如，可能通过化学表面处理使在聚碳酸酯中形成的亲水微流体通道疏水。毫无疑问，还有其他方式来制造包含由疏水微流体通道连接的腔的结构。

在一些实施例中，腔中的一个或多个或复数个各自可以与多达4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个通道连接。在一些实施例中，一个或多个网络中的每个网络都包括输入/输出通道，该输入/输出通道具有比微流体通道的流体流动阻力更高的流体流动阻力。

3. 包括无阀微流体流量芯片的系统

进一步提供了包括无阀微流体流量芯片的系统，包括本领域中已知的无阀微流体流量芯片以及在上面和在这里所描述的无阀微流体流量芯片。另外，系统包括压力定序器，该压力定序器由气动传递通道连接到：（1）高气体压力气体源；（2）中间气体压力气体源；（3）低压力气体源；以及可选地（4）部分真空压力气体源；并且连接到流量芯片内的至少一个腔，例如至少两个腔。

在一些实施例中，压力定序器配置为根据压力顺序数据将高气体压力、中间气体压力、低气体压力和可选地部分真空压力施加到至少一个腔，其中，高气体压力大于中间气体压力，中间气体压力大于低气体压力，并且低气体压力大于部分真空气体压力，并且部分真空压力小于大气压力。在实施本系统时，流量芯片可以但不需要另外包括微流体通道，该微流体通道包括静水阻力屏障。在一些实施例中，压力定序器配置为将气体压力和部分真空的组合同时施加到至少一个腔。

腔之间（例如储器和节点之间）的流体输送是通过按照特定模式切换施加到系统的每个储器和节点上的压力来完成的。以下术语有助于讨论当前的无阀微流体系统的流体输送规则。起源或源腔是储器或节点，流体将被输送到该储器或该节点。目的地腔是储器或节点，流体将被输送到该储器或该节点。在当前系统的一些实施例中，使用至少三种气体压力：高气体压力、中间气体压力和低气体压力。在当前系统的一些实施例中，使用至少四种气体压力：高气体压力、中间气体压力、低气体压力和部分真空。

当前的无阀微流体系统的流体输送规则可能被归纳为以下步骤：

步骤0：将低压力施加到所有腔体。

步骤1：在时间t(l)内将高气体压力施加到起源或源腔和除目的地腔之外通过微流体通道连接到起源或源腔的任何腔，该时间t(l)是在将一定量的液体完全从源腔去除之前停止或结束的时段，例如，足以允许起源或源腔中的流体的总体积的至少约10%和多达约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%或约90%排放到将源腔与目的地腔连接的微流体通道中的时段。将低压力施加到目的地和连接到目的地而不是起源的任何腔。

步骤2：在时间t(2)内将中间气体压力施加到起源或源腔，该时间t(2)足以推动或排出源腔中的全部剩余流体，以排放到将源腔与目的地腔连接的微流体通道中。源腔上中间气体压力的施加是不足以迫使空气进入连接的微流体通道的压力。没有空气间隙被引入微流体通道中。

步骤3：（可选的）在足以将所有流体都从腔排出的时间t(3)内将部分真空施加到目的地腔。这可以在根据所需的流体去除量将压力施加到其他孔或不将压力施加到其他孔的情况下完成。

步骤4：返回步骤0，以准备接下来的流体输送操作。

如本文所述，流体输送规则可能由压力定序器执行，该压力定序器配置为执行所需的压力顺序，以完成任何所需的流体输送操作。压力定序器接收来自例如控制器的压力顺序数据和/或指令。这些数据或指令包括逐步指令，这些逐步指令指定哪些压力施加到装置中的每个储器和节点，以执行特定流体输送操作。可以通过重复流体输送规则的步骤将流体从可重构微流体系统中的任何储器移动到任何其他储器。

在一些实施方式中，控制器是本文中所描述的微流体系统的部分。这种系统可能与用于在通过压力定序器进行处理之前，期间和之后控制其操作的电子设备或其他处理逻辑集成。处理逻辑可能被称为“控制器”，该控制器可能控制一个或多个系统的各个部件或子零件。根据处理需求和/或系统的类型，控制器可能被编程以控制本文中所公开的任何过程，包括连接到特定微流体系统或与该特定微流体系统接口连接的气体传递、压力设置、真空设置、功率设置、流动速率设置、流体传递设置、体积设置、位置和操作设置。

控制器可能实施在接收指令、发布指令、控制操作、启用端点测量等的各种集成电路、逻辑、存储器和/或软件中的任何一种中。集成电路可能包括存储程序指令的存储器形式的芯片、数字信号处理器（DSP）、定义为专用集成电路（ASIC）的芯片和/或一个或多个微处理器或执行程序指令（例如软件）的微控制器。程序指令可能是以各种单独设置（或程序文件）的形式传递给控制器，以定义用于执行特定过程的运行参数的指令。控制器可能有权访问计算机可读介质，诸如存储介质、计算机存储介质或数据存储装置（可移除的和不可移除的），诸如例如磁盘、光盘或磁带。计算机存储介质可能包括实施在用于存储诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据的信息的任何方法或技术中的易失性和非易失性、可移除和不可移除的介质。计算机存储介质的示例包括RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器或其他存储器技术、CD-ROM、数字多用盘（DVD）或其他光学存储装置、磁带盒、磁带、磁盘存储装置或其他磁性存储装置、或可以用于存储信息并且可以通过应用、模块或两者访问的任何其他介质。任何这种计算机存储介质都可能是装置的部分或可连接到其。计算机存储介质可能位于远程，例如云存储，并且通过网络或互联网连接访问。本文中所描述的任何方法、应用或模块可能使用计算机可读/可执行指令来实施，这些指令可能由这种计算机可读介质存储或保存并且由一个或多个处理器执行。

在一些实施方式中，控制器可能是计算机的部分或耦合到计算机，该计算机与系统集成，耦合到系统，联网到系统或其组合。例如，控制器可能是在“云”或主控计算机系统的全部或部分中，这可以允许远程访问压力定序器。在一些实施例中，主控计算机系统和/或控制器可以连接到互联网（例如通过有线或无线连接）。计算机可能启用对系统的远程访问，以监测流体操作的当前进展，检查过去的压力定序操作的历史，从多个压力定序操作检查趋势或性能指标，改变当前处理的参数、设置处理步骤以遵循当前处理，或开始新的过程。在一些示例中，远程计算机（例如服务器）可以通过网络向系统提供压力定序方法，该网络可能包括本地网络或互联网。远程计算机可能包括用户界面，该用户界面实现参数和/或设置的输入或编程，然后这些参数和/或设置被从远程计算机传递给系统。在一些示例中，控制器接收数据形式的指令，该数据为要在一个或多个操作期间执行的处理步骤中的每一个都指定参数。应当理解，参数可能特定于要执行的过程和控制器配置为与之接口连接或对其进行控制的工具的类型。因此，如上所述，控制器可能被分配，诸如通过包括联网在一起并且朝着共同的目的（诸如本文中所描述的过程和控制）工作的一个或多个离散控制器。用于这种目的的分布式控制器的示例是与一个或多个压力定序器局部相关联的一个或多个集成电路，该压力定序器与远程定位的一个或多个集成电路（诸如远程计算机的部分）进行通信，这些集成电路结合以控制一个或多个压力顺序。

如上所述，根据要通过压力定序器执行的一个或多个过程步骤，控制器可能与按照顺序或以并行方式与一个或多个微流体芯片流体通信的其他压力定序器、主控计算机或另一个控制器中的一个或多个进行通信。

除了压力定序，控制器可能有助于分析参数（例如储器压力、储器体积、流体流动速率）的检测以及生物标志物检测（例如当执行免疫分析时）。在一些情况下，控制器可能托管用户可访问的平台，该用户可访问的平台用于调用服务，诸如报告和分析服务，并且用于提供计算资源，以在检测数据上影响机器学习技术。

在各个实施例中，压力定序器可以实施为一组电控气动阀，例如这些电控气动阀是使用例如在个人计算机、微控制器或微处理器上运行的软件（例如Lab VIEW（虚拟代器）、国家仪器公司、MATLAB、Mathworks（矩阵实验室）、Visual BASIC、C#、Python或Java）来编程的。在各个实施例中，将流体从可重构微流体装置中的一个储器移动到另一个储器所必需的压力顺序数据可以被手动编程或计算出来。在各个实施例中，可能编写图形软件程序，该图形软件程序允许用户选择起源和目的地储器，其中，程序然后通过重复应用流体输送规则生成适当的压力顺序数据。以这种方式，可能创建直观的系统，该系统允许用户执行任意的微流体实验，而不需要理解流体输送规则或其他系统操作细节。

本文中的示例说明了如何使用流体输送规则来执行常见的流体输送实验。

图3A至图3F图示了使用本文中所描述的系统和流量芯片将流体从源腔（A）通过连接通道输送到目的地腔（B）的实施方式。在时间t(l)内施加高气体压力（HP），以克服源腔（A）和连接的通道之间的静水和疏水屏障，并且开始使流体通过通道流到目的地腔（B）（参见例如图3A至图3C）。然后在时间t(2)内将源腔（A）上的压力切换为中间气体压力（IP），该中间气体压力将继续使流体移动通过通道并且排空源腔（A）（参见例如图3D至图3E）。当源腔（A）已经排空时，IP所施加的力小于克服通道/腔接口处的阻力或（多个）流体流动屏障所需的量，以免流体被向下推入通道。在这种输送过程中，目的地腔（B）保持低压力（LP、大气或环境）。在这种输送事件结束时，源腔（A）是空的，连接通道是满的，并且目的地腔（B）已经装满流体（参见例如图3F）。目的地腔（B）中的总体积是源腔（A）中的体积减去通道中的体积。对时间t(l)进行设置，使得源腔（A）中的流体的至少约10%、多达约70%、约75%、约80%、约85%或约90%（例如在约30%和约70%之间）已经被输送。将时间t(2)设置为比输送源腔（A）中的剩余流体所需的时间长的时段。

图4A至图4F图示了使用本文中所描述的系统和流量芯片将流体从源腔（B）通过连接通道输送到目的地腔（C）并且然后从目的地腔（C）排出或去除流体的实施方式。在时间t(l)内将高压力（HP）施加到腔A和B，以克服源腔（A）和连接到腔C的通道之间的流体流动屏障，并且开始使流体通过通道流到目的地腔（C）（参见例如图4A至图4B）。在这种情况下，流体将停留在腔A中。然后在时间t(2)内将腔A和B上的压力切换为中间压力（IP），该中间压力将继续使流体移动通过B-C通道并且排空源腔（B）（参见例如图4C）。当源腔（B）已经排空时，IP所施加的力小于克服通道/腔接口处的阻力或（多个）流体流动屏障所需的量，以免流体被向下推入通道。在这种输送过程中，目的地腔（C）保持低压力（LP、大气或环境）。在这种输送事件结束时，腔A仍然是满的，源腔（B）是空的，连接通道是满的，并且目的地腔（C）已经装满流体（参见例如图4C）。目的地腔（C）中的总体积是源腔（B）中的体积减去通道中的体积。对时间t(l)进行设置，使得源腔（B）中的流体的至少约10%、多达约70%、约75%、约80%、约85%或约90%（例如在约30%和约70%之间）已经被输送。将时间t(2)设置为比输送源腔（C）中的剩余流体所需的时间长的时段。然后在时间t(3)内将源腔（C）上的压力切换为部分真空（VAC），并且通过气体端口从源腔（C）和通道B-C去除流体。在该事件结束时，腔A仍然是满的，并且源腔（B）、通道B-C和目的地腔（C）是空的（参见例如图4F）。

使用单个气体端口将压力施加到腔并且从腔排出流体，都有一定的局限性。如果在排出步骤之后气体管路中仍然有残余流体，则当压力被施加和气体移动通过气体管路进入腔时，在后续步骤中可以将流体向下推到腔中。这可以产生不必要的影响，诸如交叉污染。此外，当需要同时处理压力和部分真空时，歧管和对流量芯片的密封的设计更复杂。这种系统在多个流体输送周期中更容易发生压力泄露，这可以导致流体输送误差。图5中所示的改进的系统具有用于将压力施加到腔和从腔排出流体的单独气体端口。第二歧管接口连接到流量芯片的底部。气体端口在一个或多个腔连接到这种歧管。腔到歧管的连接可以通过腔的底部密封中的预先形成的孔来完成，也可以通过在将流量芯片安装在底部歧管时穿透过流量芯片的底部密封（例如用空心针）来完成。底部歧管可以连接到用于顶部歧管的相同的压力和部分真空源或具有单独的压力和部分真空源。

图6A至图6F图示了使用本文中所描述的系统和流量芯片将流体从源腔（B）通过连接通道输送到目的地腔（C）并且然后从目的地腔（C）排出或去除流体的实施方式，其中，目的地腔（C）具有用于施加压力和排出流体的单独气体端口。在时间t(l)内将高压力（HP）施加到腔A和B，以克服源腔（B）和连接到腔C的通道之间的静水和疏水屏障，并且开始使流体通过通道流到目的地腔（C）（参见例如图6A至图6B）。在这种情况下，流体将停留在腔A中。然后在时间t(2)内将腔A和B上的压力切换为中间压力（IP），该中间压力将继续使流体移动通过B-C通道并且排空源腔（B）（参见例如图6C）。当源腔（B）已经排空时，IP所施加的力小于克服通道/腔接口处的阻力或（多个）流体流动屏障所需的量，以免流体被向下推入通道。在这种输送过程中，目的地腔（C）保持低压力（LP、大气或环境）。在这种输送事件结束时，腔A仍然是满的，源腔（B）是空的，连接通道是满的，并且目的地腔（C）已经装满流体（参见例如图6C）。然后将源腔（C）的底部气体端口切换为部分真空（VAC），同时在时间t(3)内保持顶部气体端口上的压力处于低压，并且通过底部气体端口从源腔（C）去除流体（参见例如图6D至图6E）。在该事件结束时，腔A仍然是满的，通道B-C仍然是满的，并且源腔（B）和目的地腔（C）是空的（参见例如图6F）。

因此，提供了一种用于将一定量的液体从源腔移动到目的地腔并且将流体从微流体腔网络中的目的地腔排出的系统，其中，源腔和目的地腔由无阀微流体通道分开，该无阀微流体通道的流体流动阻力大于源腔的流体流动阻力，方法包括：（i）容器，该容器用于容纳流量芯片并且与流量芯片接合，该流量芯片包括微流体腔网络；（ii）压力定序器，该压力定序器包括一组气体阀并且配置为连接到用于在微流体腔中产生高压力的第一气体源、用于在微流体腔中产生低压力的第二气体源和用于在微流体腔中产生中间压力的第三气体源，并且可选地连接到用于产生部分真空的第四源，其中，高压力大于低压力，中间压力小于高压力，但是大于低压力，并且当源腔基本上排空液体时，中间压力不够大，不足以克服微流体通道中的流体流动阻力或（多个）屏障，其中，压力定序器可以将任何压力状态施加到任何腔；以及（iii）控制器，该控制器配置为指导压力定序器：（a）将高压力施加到源腔和除目的地腔之外连接到源腔的所有其他腔，同时将低压力施加到目的地腔，以将一定量的液体的部分从源腔移动通过微流体通道，并且到达目的地腔，以及（b）在将一定量的液体完全从源腔去除之前，将中间压力施加到源腔，其中，中间压力足够大，以将（a）后剩余的一定量的液体的至少一些推到目的地腔，但是避免将气体引入微流体通道；以及（c）可选地施加部分真空，以将流体从一个或多个腔排出。虽然不希望受到任何理论的限制，但是要相信，微流体通道（与源腔相邻）入口的气液界面提供增加的流体流动阻力或（多个）屏障，当源腔首先排空（或基本上排空）液体时，这会阻止进一步的流体输送。因此，只要腔中有流体，中间压力便足以将流体推出源腔。当腔排空时，流体输送阻力增加，使得中间压力不再足以驱动流体通过通道。

在一些实施例中，压力定序器配置为应用或遵循流体输送规则，其中：（1）将高气体压力施加到起源或源腔，流体被从该起源或源腔输送，并且将低气体压力施加到目的地腔，流体被输送到该目的地腔，高压力在足以克服疏水和/或静水屏障并且开始从起源或源腔到微流体通道中的流体流动的时间t(l)内施加，该微流体通道将起源或源腔连接到目的地腔；（2）将中间压力施加到起源或源腔，并且将低压力施加到目的地腔，使得流体继续移动通过连接通道，中间压力在足以使起源或源腔排空流体但是有不足以将流体排出到通道之外的压力的时间内施加；因此，起源或源腔排空流体，并且将流体移动到通道和目的地腔中；以及（3）可选地，将部分真空施加到目的地通道，同时将低压力施加到源腔，使得流体通过气体端口从目的地腔排出。在一些实施例中，通过位于目的地腔220的底表面或压力端口的相对侧的单独端口或通道将部分真空施加到目的地腔，例如，使得较小的应力施加到歧管/流量芯片界面，并且将流体从腔的底部排出。在一些实施例中，将气体压力从流量芯片的顶表面上面的气体端口引入目的地腔中，以通过流量芯片下面的部分真空端口促进从目的地腔去除流体并且干燥目的地腔。如本文中所使用的，术语“上面”和“下面”是相对的，因为流量芯片可以保持竖直配置。将气体压力施加到目的地腔中的流体的弯月面上面，并且同时将部分真空施加到目的地腔中的流体下面，例如在目的地腔中的流体的相对侧，利于排出连续流动的流体。

虽然不希望受到任何理论的限制，但是要相信，微流体通道（与源腔相邻）入口的气液界面提供增加的流体流动阻力或（多个）屏障，当源腔首先排空（或基本上排空）液体时，这会阻止进一步的流体输送。因此，只要腔中有流体，中间气体压力便足以将流体推出源腔。当腔排空时，流体输送阻力增加，使得中间气体压力不再足以驱动流体通过通道。

在系统的一些实施例中，压力定序器配置为施加一种或多种压力模式，这些压力模式选自由恒定压力、脉动压力、增加的斜坡压力和减少的斜坡压力组成的组。在一些实施例中，压力定序器配置为通过施加脉动压力和使用脉冲宽度调制（PWM）来控制所施加的压力，这可能选择占空因数来提供所需的压力。例如，在操作期间，可以将占空因数调整为在约1%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的范围内。在一些实施例中，压力定序器配置为施加增加的和/或减小的斜坡压力，包括在约10毫秒至约20毫秒、50毫秒、100毫秒、250毫秒、500毫秒、750毫秒或1秒的范围内的上升和/或下降时间。

作为示例，高压力可以是在约5 kPa至约100 kPa的范围内，中间压力可以是在约1.0 kPa至约10 kPa的范围内，低压力可以为约0 kPa或大气或环境压力，并且部分真空压力可以小于大气压力，例如约－6 kPa或更低，其中，所有压力都是仪表压力。在一些实施例中，高压力是在约5 kPa至约60 kPa、约70 kPa、约80 kPa、约90 kPa或约100 kPa的范围内，例如在约10 kPa至约60 kPa的范围内。在一些实施例中，中间压力是在约1 kPa至约5 kPa、约6 kPa、约7 kPa、约8 kPa、约9 kPa或约10 kPa的范围内。在一些实施例中，部分真空压力是在约－5 kPa至约－10 kPa、约－20 kPa、约－30 kPa、约－40 kPa、约－50 kPa、约－60kPa、约－70 kPa、约－80 kPa、约－90 kPa或约－100 kPa的范围内。在一些实施例中，在高气体压力下通过第一多个微流体通道的流体流动速率为约0.1 μL/秒至约0.2 μL/秒、约0.3 μL/秒、约0.4 μL/秒、约0.5 μL/秒、约0.6 μL/秒、约0.7 μL/秒、约0.8 μL/秒、约0.9 μL/秒、约1.0 μL/秒、约2.0 μL/秒、约3.0 μL/秒、约4.0 μL/秒、约5.0 μL/秒、约6.0 μL/秒、约7.0 μL/秒、约8.0 μL/秒、约9.0 μL/秒或约10.0 μL/秒。在一些实施例中，在中间压力下通过第一多个微流体通道的流体流动速率为约0.01 μL/秒至约0.05 μL/秒、约0.1 μL/秒、约0.2 μL/秒、约0.3 μL/秒、约0.4 μL/秒、约0.5 μL/秒、约0.6 μL/秒、约0.7 μL/秒、约0.8μL/秒、约0.9 μL/秒或约1.0 μL/秒。在一些实施例中，多个微流体通道呈现对流体流动的疏水压力屏障，该疏水压力屏障小于高气体压力和低气体压力之间的压力差。

在一些实施例中，压力定序器配置为应用或遵循流体输送规则，其中：（1）将高气体压力施加到起源或源腔，流体被从该起源或源腔输送，并且将低气体压力施加到目的地腔，流体被输送到该目的地腔，高气体压力在足以克服疏水和/或静水屏障并且开始从起源或源腔到微流体通道中的流体流动的时间t(l)内施加，该微流体通道将起源或源腔连接到目的地腔；（2）将中间气体压力施加到起源或源腔，并且将低压力施加到目的地腔，使得流体继续移动通过连接通道，中间气体压力在足以使起源或源腔排空流体但是有不足以将流体排出到通道之外的压力的时间t(2)内施加；因此，起源或源腔排空流体，并且将流体移动到通道和目的地腔中。在一些实施例中，时间t(l)是在将一定量的液体完全从源腔去除之前停止或结束的时段，例如足以从起源或源腔排出流体体积的至少约10%和多达约90%的时段。在一些实施例中，通过位于目的地腔220的底表面或压力端口的相对侧的单独端口或通道将部分真空施加到目的地腔，例如，使得较小的应力施加到歧管/流量芯片界面，并且将流体从腔的底部排出。在一些实施例中，将气体压力从流量芯片的顶表面上面的气体端口引入目的地腔中，以通过流量芯片下面的部分真空端口促进从目的地腔去除流体并且干燥目的地腔。此外，术语“上面”和“下面”是相对的，因为流量芯片可以保持竖直配置。将气体压力施加到目的地腔中的流体的弯月面上面，并且同时将部分真空施加到目的地腔中的流体下面，例如在目的地腔中的流体的相对侧，利于排出连续流动的流体。

在一些实施例中，压力定序器进一步连接到非常高的气体压力源，并且压力定序器配置为施加非常高的气体压力，其中，非常高的气体压力大于高气体压力。在一些实施例中，非常高的气体压力为至少约100 kPa，例如至少约125 kPa、150 kPa、175 kPa、200 kPa或更高。

在一些实施例中，压力定序器配置为应用或遵循流体输送规则，其中，将部分真空气体压力施加到目的地腔，流体通过其输入/输出通道被吸入目的地腔，并且将低气体压力施加到任何其他腔，该腔通过通道连接到目的地腔。

在一些实施例中，一个或多个网络包括j行和k列的腔，j和k是正整数，每行或每列中的腔都串联连接。

4. 使用方法

在进一步的方面中，提供将一定量的液体从微流体腔的网络中的源腔移动到目的地腔的方法。方法适用于无阀微流体流量芯片并且应用本文中所描述的微流体系统以及目前可用的无阀微流体流量芯片和系统。在一些实施例中，方法使用微流体流量芯片，该微流体流量芯片具有源腔和目的地腔，该源腔和该目的地腔由无阀微流体通道分开，该无阀微流体通道的流体流动阻力大于源腔的流体流动阻力。在一些实施例中，方法包括：（a）将高气体压力施加到源腔和除目的地腔之外连接到源腔的所有其他腔，同时将低压力施加到目的地腔，以将一定量的液体的部分从源腔移动通过微流体通道，并且到达目的地腔，其中，高气体压力大于低压力；以及（b）在将一定量的液体从源腔完全去除之前将中间气体压力施加到源腔，其中，中间气体压力低于高气体压力，但是高于低压力，以及其中，中间气体压力足够大，以将（a）后剩余的一定量的液体的至少一些推到目的地腔，但是不够大，不足以克服微流体通道中的流体流动阻力，并且因此避免将气体引入微流体通道中。在一些实施例中，微流体通道中的一个或多个是疏水的或包括疏水涂层。在一些实施例中，中间气体压力不够大，不足以将气体引入微流体通道中，即使当所有的一定量的液体都已经从源腔去除时。在一些实施例中，在施加中间气体压力之前，从源腔去除少于90%的液体。在一些实施例中，在入口通道和出口通道之间的区域中的源腔中保留定义数量的流体。在一些实施例中，使用在上面和在这里所描述的系统来执行方法。

在进一步的方面中，提供用于在微孔板中安排流体的方法。在一些实施例中，方法包括：根据一组压力顺序数据操作在上面和在这里所描述的无阀微流体系统，该压力顺序数据使流体从微孔板的起源或源腔吸入到系统中，并且排出到微孔板的目的地腔中，其中，空气不会被引入起源或源腔下游的微流体通道中。

在进一步的方面中，提供用j个样品和k种试剂执行同质分析的方法。在一些实施例中，方法包括：使用压力顺序数据操作在上面和在这里所描述的无阀微流体系统，该压力顺序数据使j个样品中的每一个都暴露于k种试剂，从而产生j种输出溶液，其中，空气没有被引入起源或源腔下游的微流体通道中。

在进一步的方面中，提供执行多重免疫分析的方法。在一些实施例中，方法包括：操作在上面和在这里所描述的无阀微流体系统，其中，系统包括两个或两个以上的网络，系统根据压力顺序数据操作，使得压力定序器对系统中的流体流动进行指向，该流体流动导致不同种类的样品-分析-捕获-分析反应在不同的网络中发生，但是导致相同种类的检测试剂反应在多个网络中发生，其中，空气不会被引入起源或源腔下游的微流体通道中。在一些实施例中，免疫分析流体包括：缓冲液，该缓冲液具有在6至11的范围内的pH，例如在6至9的范围内的pH，例如在约7至约9的范围内的pH或在9至11的范围内的pH、一种或多种阻滞剂或蛋白质溶液和一种或多种表面活性剂。在具体实施例中，免疫分析流体包括磷酸盐缓冲盐水（PBS）、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）或磷酸氢盐缓冲液、白蛋白（例如牛血清白蛋白（BSA））、吐温20、吐温X或其他表面活性剂和可选地包括甘油。

在一些实施例中，方法可以与美国专利公开案第US2017/0021351号、第US2017/0021352号和第US2017/0021353号中所描述的方法类似地执行，改进是压力定序器配置为在一定量的液体完全从源腔移除之前从高气体压力模式切换为中间气体压力模式，从而避免气泡引入微流体通道中，该微流体通道将起源腔与目的地腔连接。

示例

提供以下示例是为了说明，而不是限制所要求的发明。

示例1

用于改进的流体控制的方法和无阀微流体流量芯片

该示例说明通过连接通道将流体从源腔输送到目的地腔的实施方式。在图3A至图3F中示出了这个过程的示意图。在时间t(l)内施加高气体压力（HP）（例如在约5 kPa或10kPa至约60 kPa或100 kPa的范围内），以克服源腔和连接的通道之间的疏水和静水屏障，并且开始使流体通过通道流到目的地腔（图3A至图3C）。然后在时间(2)内将源腔上的压力切换到第二中间气体压力（IP）（例如在约0.5 kPa或1.0 kPa至约5 kPa或10 kPa的范围内），该第二中间气体压力将继续使流体移动通过通道并且排空源腔（图3D至图3E）。当源腔已经排空时，中间气体压力（IP）所施加的力小于克服通道/腔接口处的阻力或（多个）流体流动屏障所需的量，以免流体被向下推入通道。在这种输送过程中，目的地腔保持低压力（LP，例如大气的）。在这种输送事件结束时，源腔是空的，连接通道是满的，并且目的地腔已经装满流体（图3F）。目的地腔中的总体积是源腔中的体积减去通道中的体积。对时间t(l)进行设置，使得源腔中的流体的10%至90%已经被输送。对时间t(2)进行设置，使得其比输送源腔中的剩余流体所需的时间长得多的时段。

在使用具有通道尺寸200 μm×50 μm×25 μm（W×H×L）的聚丙烯（PP）流量芯片的一种实施方式中，HP=30 kPa，并且IP=1.5 kPa，其分别给出了约2 μl/秒和约0.1 μl/秒的通过通道的流动速率。对于20 μl的输送，t(l)=7秒并且t(2)=120秒。名义上地，14 μl的流体由HP输送，并且6 μl的流体由IP输送。流体应在约60秒后在IP步骤中被完全去除。过量的IP时间适应由通道尺寸变化、通道中存在人工制品或污染物、通道中存在气泡或其他影响引起的流体输送速率的变化。对时间t(l)和t(2)进行设置，使得在HP步骤中不会排空源腔，并且最小化总输送时间。多个通道和多个流量芯片上的所测量的流动速率变化为约12%，这给出了2.72 μl/秒的“3-σ”最大HP流动速率。在上述情况下，在HP期间输送的最大流体量将是19 μl，因此，源腔将不会排空。“3-σ”最小HP流动速率为1.28 μl/秒，使得预期输送的最小流体量为9 μl。这意味着，11 μl将以IP速率输送，这将花费比t(2)少的110 秒。这种方法确保了所有流体都将被输送到源腔外，但是空气不会被迫通过通道并且进入目的地腔。如果需要适应IP流动速率的变化，则时间t(2)可以增加。WCI处的阻力是表面和流体特性以及通道尺寸的函数。矩形横截面流体阻力公式是：

。

在这个公式中，μ：流体粘度；L：通道长度；ω：通道宽度；以及H：通道高度。可以优化流体粘度，以增加这种阻力，并且允许在过程中使用值更高的IP。已经将诸如甘油的添加剂和其他粘度较高的流体混合成分析试剂，以增加这种阻力。这些流体将在更高的IP值下从通道中排出。对由聚丙烯（PP）制成的流量芯片有用的“分析缓冲液”包含PBS + 0.1% BSA+ 0.001%吐温20。对由环烯烃共聚物（COC）制成的流量芯片有用的“分析缓冲液”包含PBS +0.1% BSA + 0.001%吐温20+10%甘油。

另外，可以修改通道几何结构，以增加静水屏障（HSB），例如，通过在WCI处或在WCI附近引入“颈部”或“蛇形”结构。在图7A至图7C中示出了这些结构的示例。为具有这些几何结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置测量HSB压力，并且在下面的表2中给出了结果，并且也在图8中描绘了结果。

表2

HPB——疏水屏障

HSB——静水屏障。

对静水阻力或流体流动屏障结构进行设计，使得疏水屏障（HPB）（其与液体从腔移动到通道中的阻力有关）和静水屏障（HSB）（其与液体从通道移动的阻力有关）两者都增加。然而，保持足够的流动速率也是至关重要的，这样才能在合理的时间内执行流体输送。这对于免疫分析中对时间敏感的步骤（如底物培养时间）尤其重要。针对在不同的施加压力下的三种结构测量分析缓冲液的流动速率，并且在图8中示出结果。观察到流动速率有一些降低，但是在可接受的范围内。

另外，可以将通道几何结构修改为沿两个规则腔之间的通道的长度包括密封腔或空隙。在图9A至图9B中示出了这样的示例。空隙的特征是其直径和高度，并且通道中存在空隙，会导致通道的突破压力（BP）增加。BP被定义为将流体从源腔移动到目的地腔所需的压力。测量具有250 μm和500 μm的空隙直径以及90 μm和250 μm的空隙高度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置的BP，并且在图10中给出结果。在这些情况下，通道宽度和高度是50 μm。

另外，可以将通道几何结构修改为沿两个腔之间的通道的长度包括高度减小的区域（在这里被称为肋或肋特征）。在图11 A至图11B中示出了这样的示例。肋的特征是其长度、宽度和高度，并且通道中存在肋，会导致通道的突破压力（BP）和毛细管压力增加。测量具有50 μm的通道宽度和从22 μm到50 μm的通道高度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置的BP，并且在图12中给出结果。也将BP与各种肋几何结构的计算的毛细管压力进行比较，并且在图13A中给出那些结果。观察到BP和毛细管压力之间有良好的相关性（R2＝0.927）。

用于注塑成型的微流体装置的模具通常是通过将两侧：A侧和B侧夹在一起形成的。标准方法是使A侧包含流体通道特征，而使B侧包含腔和支撑特征。腔通常由圆柱销形成，并且在腔和通道之间形成接合点，在这些接合点处，这些销的端部被压在凸起的特征或降落点上，这些降落点位于A侧，限定出腔和通道连接的底部。对A侧或B侧的对齐的限制要求降落点比销的端部长，使得那些项之间始终有完整的连接（即表明之间的完全接触）。在图14A中示出了这样的示例。图14A中的左侧图像示出了销与具有单个通道连接的降落点之间的接合点的底视图；中间图像示出了该区域的横截面视图；右侧图像示出了该区域的三维顶视图。这种装配方法的结果是形成边沿，该边沿在腔的底部创建微流体“环”，该“环”在名义上与连接通道的高度相同（例如50 μm）。流体可以在微毛细管力的作用下通过这个环吸入，并且如果两个或两个以上的通道连接到相同的腔（例如节点），则环可以在那些通道之间形成微流体连接，该微流体连接避开在腔与通道之间建立的疏水屏障。另外，连接几何结构向外展开由用于创建模具的机床定义的曲率半径（参见图14A右侧）。通道接合点的这种平滑可以减少WCI处的流体流动屏障。

在图14B中示出了改进的装置。在这种情况下，B侧销比A侧降落点大。这为两个模具侧的对准提供了必要的公差，同时消除腔底部由那些项形成的边沿。这会去除与同一腔有接合点的两个或两个以上的通道之间的微流体连接。另外的改进是，通道现在直接进入腔，使得通道和腔之间的几何结构发生急剧变化，因为通道与腔的接合点是垂直的。这会增加腔内外的流体流动屏障，并且改进控制流体输送的能力。

图14B中的设计在腔底部的一个平面中具有所有WCI。通道之间没有微流体降落点间隙连接，减少了潜在的灯芯效应，但是在两个或两个以上的通道之间仍然可以形成流体连接，这些流体连接会对分析性能产生不利影响（例如交叉污染）。在图15A至图15B中示出了这类接合点的进一步的改进。图15A示出了具有接近腔底部的入口端口的腔的三维顶视图。图15B示出了通道和它们与腔的接合点的三维底视图。图15C示出了输送通道入口端口和到分析通道的出口接合点的横截面视图。该装置的特征是，输送通道在腔的底部上面的平面中进入腔。然后流体离开腔，进入腔底部的分析通道。这在接合点之间提供了竖直分离，并且进一步降低了输送通道和分析通道之间的流体连接的可能性。在图14B中的装置的情况下，入口端口的几何结构还使得其形成更锐利的边缘。这将进一步增加这些通道内外的流体流动屏障，并且提高装置控制流体输送的能力。

由图15中所示的腔特征提供的流体控制改进是通过观察高表面活性剂流体从腔到连接通道中的被动泄露来测量的。在图16A和图16B中示出了这种研究的图像。将具有0.1%吐温20和荧光素染料（用于可视化）的水溶液装入流量芯片的不同腔中，并且让其静置60分钟。腔的底部是使用荧光显微镜（来自加州卡尔斯巴德Etaluma的具有4×物镜、490 激发、530 nm发射的Lumascope）来成像的。如果观察到流体进入通道超过1 mm，则确定被动泄露的肯定结果。表现出被动泄露的通道的百分比被用来测量流量芯片的性能。对于图14B中所示的具有原生COC表面的装置，观察到通道的约50%有被动泄露。疏水表面涂层的添加将这种被动泄露降低到17%以下。图15中所示的具有原生COC表面的装置没有表现出被动泄露。

该示例中所描述的方法可以扩展为使用n种不同的HP设置，其中，n＞2。这可以允许对流体移动进行更精细的控制，以便在具有各种腔和通道尺寸以及多种流体类型的流量芯片中进行分析。例如，如果同时需要低表面张力流体和高表面张力流体来执行分析，则可以使用多个较低的HP值。在另一个示例中，如果流量芯片中存在不同的疏水屏障，则可以使用多个较高的HP值。在一种实施方式中，可以使用非常高的疏水和/或静水屏障（或其他屏障）将流体保持在腔中，以便长期储存和/或运输。可以使用更高的HP（例如＞100 kPa）来打破这个屏障。然后，在约30 kPa的高HP的情况下，可以正常进行分析。真空在过程中也可以用于将流体从腔和通道排出，以恢复疏水和/或静水屏障，并且减少通道中的剩余流体的潜在混合。

示例2

多参数免疫分析结果

炎症是细胞对各种内源性和外源性刺激做出反应的复杂事件。诸如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和干扰素γ（IFN-γ）的因子激活信号通路，导致促进免疫细胞与血管结合的细胞表面抗原的表达。监测诸如具有内皮细胞的细胞因子MCP-1、IL-8、IL-6的分子的上调的能力为基于细胞的炎症模型提供了重要的生理读出。我们呈现了基于人类细胞的多参数初级分析的结果，该分析使用分泌细胞因子的免疫分析来评估不同的中介物对炎性反应的影响。用炎症细胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-1β）刺激的原发性人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的炎症标志物的表达由基于微流体的ELISA量化。

微流体流量芯片设计为包含容纳执行ELISA分析所需的试剂的多个储器和节点。在图1A中示出了通道布局。分析通道（从孔3到孔8）具有50 μm×200 μm的横截面，而其他输送通道具有50 μm×50 μm的横截面 流量芯片是用注塑成型由COC制成的，并且底表面是用COC薄膜密封的。每个储器都具有~30 μl的容量，并且充满20 μl的适当的分析试剂。分析是使用指定为第一半部和第二半部的两个单独的协议来执行的。在第一半部中，以下试剂被装在图17A中所示的孔中：捕获抗体（W3）、封闭液（W5）、样品（W2）、一级抗体（W1）、洗涤液1（W4）和洗涤液2（W7）。在第二半部中，以下试剂被装在图17B中所示的孔中：洗涤剂3（W3）、链霉亲和素（SA）HRP（W5）、洗涤剂4（W1）、洗涤剂5（W7）、基质（W2）和停止液（W6）。在第一半部和第二半部之间，流量芯片被完全排出和干燥，以减少污染物，并且在每个储器的入口和出口都重新建立疏水屏障。

捕获抗体和一级抗体特定于每种免疫分析，并且MCP-1、IL-8和IL-6的匹配抗体对是从商业源（加州圣地亚哥的Biolegend）获得的。缓冲液和停止液对所有三种分析都是通用的，并且是使用从Sigma-Aldrich获得的材料制作的。SA-HRP（加州圣地亚哥的BectonDickenson）和基质（马萨诸塞州剑桥的Abeam）对每种分析也都是通用的。捕获抗体是在10μg/ml的浓度下使用的，并且通过在含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的涂层缓冲溶液中稀释储备抗体来制作。一级抗体是在1 μg/ml的浓度下使用的，并且通过在含有PBS、牛血清白蛋白（BSA）和吐温20的分析缓冲溶液中稀释储备抗体来制作。封闭液由在PBS中稀释的BSA组成。SA- HRP也在分析缓冲液中稀释，并且在200 ng/ml的浓度下使用。基质溶液是按照所提供的方式使用的。在表3中列出用于第一半部和第二半部分析的协议中的流体输送步骤。括号（S-D）中给出了每个步骤的源（S）和目的地（D）孔数。

在一些步骤中，如括号中两组数字所示，发生两次输送。从源孔到目的地孔的每个流体输送步骤都遵循流体输送规则，该流体输送规则包括用于使大部分流体移动通过给定通道的HP部分，之后是用于在不排空之前所描述的通道的情况下排空源孔的较长LP部分。HP部分通常是在5秒到20秒之间，而LP部分通常是在30秒到300秒之间。分析通道中的培养是使用不同的流体输送规则来完成的，该流体输送规则包括连续的短HP输送，之后是允许试剂与分析通道壁相互作用的输送之间的延迟。延迟时间通常是在5秒到60秒之间，其中，在培养步骤中使用总共15个和30个周期。总培养时间（周期数×延迟时间）取决于所需的分析和灵敏度：较长的培养时间通常提供较高的灵敏度。LP部分在培养步骤的HP周期之后使用，以便排空源孔。去除步骤是通过将真空施加到废液储器和封闭孔9来完成的。从孔8去除20 μl所花的时间通常是在15秒到30秒之间。第一半部协议的总时间为约90分钟，并且第二半部协议的总时间为约45分钟。在第二半部协议结束时，将流量芯片从系统去除，放置在平板阅读器（瑞士帝肯）中，并且使用预定义协议通过孔6读取450 nm处的吸光度。

在用已知的炎性细胞因子刺激20小时之后，对原发性人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的多参数炎症反应进行表征。将HUVEC细胞在96孔多孔板（MWP）中培养48小时，然后分别在5ng/孔、1 ng/孔和100 ng/孔的最大浓度下用TNF-α、IFN-γ和IL-1β的混合物来培养。在刺激之后，去除细胞上清液，并且使用微流体ELISA系统在上清液中测量IL-6、IL-8和MCP-1的数量。上清液在分析缓冲液中稀释4倍，并且用标准曲线来定量细胞因子的数量。在图18中示出了IL-6、IL-8和MCP-1的标准曲线和拟合参数。在图19中示出了根据相对细胞因子混合物浓度对IL-6、IL-8和MCP-1进行的上调。发现，在37°下培养20小时之后，所有的三种反应细胞因子在最高的炎性细胞因子混合物浓度下均被上调。

测量抗炎化合物AG126、SB202190和MG132对炎症反应的浓度依赖效应。在炎性细胞因子混合前1小时，将化合物添加到在96孔MWP中培养的96孔MWP，并且然后用抗炎化合物和炎症混合物在37℃培养细胞20小时。在图20A至图20C中示出了这些化合物的反应曲线。每个反应曲线都与4参数函数拟合，并且测量EC₅₀值（图20D）。在与报道的化合物的作用机制一致的化合物之间看到细胞因子表达的明显差异。例如，IL-8表达在相似的浓度下被作为两种激酶抑制剂的SB202190和AG- 126分解。然而，在MG-132所研究的浓度范围内，IL-8不受影响，MG-132是已经报道的用于刺激IL-8的蛋白酶体抑制剂。这种新型的微流体ELISA系统提供有效的多参数分析方法，该方法可以用于测试抗炎化合物的有效性，并且还通过选择性地抑制由不同的信令路径引发的标志物为了解作用机制提供重要依据。

示例3

THP-1细胞因子分泌分析结果

巨噬细胞来源于离开血液循环以分化成各种组织的血液单核细胞。巨噬细胞参与细菌和受损细胞的检测和吞噬。另外，巨噬细胞通过释放激活血管细胞的细胞因子来引发炎症，并且促进细胞因子粘附到血管并且迁移到组织中。在研究炎性反应中的巨噬细胞参与时，分化的THP-1细胞已被广泛用作巨噬细胞的体外模型。人类单核细胞株THP-1可以被佛波醇12-豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）分化成巨噬细胞，并且被LPS激活。激活的THP-1细胞改变形态并且分泌炎性细胞因子。监测细胞因子的表达水平是基于细胞的炎症模型的重要生理读出。在这里呈现了基于细胞的多参数分析的结果，这种分析使用微流体流量芯片对分泌细胞因子进行ELISA，以评估药物化合物对炎性反应的影响。用PMA和LPS刺激THP-1细胞48小时。在THP-1细胞的PMA和LPS激活时，增加IL-8、IL-1b和TNF-a。为了评估抗炎化合物，细胞在激活前用激酶抑制剂SB202190和PDTC以及抗生素莫西沙星处理。然后，通过对细胞因子分泌进行定量，测量那些抗炎化合物对炎症反应的抑制作用。与报道的作用机制一致的化合物SB202190、PDTC和莫西沙星的细胞因子表达的浓度依赖性下降。

微流体流量芯片设计为包含容纳执行ELISA分析所需的试剂的多个储器和节点。在图21A中示出了通道布局。分析通道（从孔3到孔9）具有50 μm×300 μm的横截面和25 mm的长度，而其他输送通道具有50 μm×50 μm的横截面。图21B示出了一个微流体网络的放大区域，包括输送通道中的空隙和肋特征。流量芯片是用注塑成型由COC制成的，并且底表面是用COC薄膜密封的。每个储器都具有~30 μl的容量，并且充满20 μl的适当的分析试剂。分析是使用按照以下顺序执行的图22所示的所有试剂的单一协议来执行的：捕获抗体（W3）、封闭液（W2）、样品（W1）、一级抗体（W4）、Avidin-HRP（W5）、清洗缓冲液（Wash）、基质（W7）和停止液（W6）。

捕获抗体和一级抗体特定于每种免疫分析，并且IL-8、IL-1β和TNFα分析的匹配抗体对是从商业源（加州圣地亚哥的Biolegend）获得的。缓冲液和停止液对所有三种分析都是通用的，并且是使用从Sigma-Aldrich获得的材料制作的。Avidin-HRP（加州圣地亚哥的Biolegend）和基质（马萨诸塞州剑桥的Abeam）对每种分析也都是通用的。捕获抗体是在10μg/ml的浓度下使用的，并且通过在含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的涂层缓冲溶液中稀释储备抗体来制作。一级抗体是在1 μg/ml的浓度下使用的，并且通过在含有PBS、牛血清白蛋白（BSA）和吐温20的分析缓冲溶液中稀释储备抗体来制作。封闭液由在PBS中稀释的BSA组成。Avidin- HRP也在分析缓冲液中稀释，并且在200 ng/ml的浓度下使用。基质溶液是按照所提供的方式使用的。

在表4中列出用于完整的分析协议中的流体输送步骤。括号（S-D）中给出了每个步骤的源（S）和目的地（D）孔数。

在一些步骤中，如括号中两组数字所示，发生两次输送。从源孔到目的地孔的每个流体输送步骤都遵循流体输送规则，该流体输送规则包括用于使大部分流体移动通过给定通道的HP部分，之后是用于在不排空之前所描述的通道的情况下排空源孔的较长LP部分。HP部分通常是在5秒到20秒之间，而LP部分通常是在30秒到300秒之间。分析通道中的培养是使用不同的流体输送规则来完成的，该流体输送规则包括连续的短HP输送，之后是允许试剂与分析通道壁相互作用的输送之间的延迟。延迟时间通常是在5秒到60秒之间，其中，在培养步骤中使用总共15个和30个周期。总培养时间（周期数×延迟时间）取决于所需的分析和灵敏度：较长的培养时间通常提供较高的灵敏度。LP部分在培养步骤的HP周期之后使用，以便排空源孔。去除步骤是通过将真空施加到废液端口来完成的。从孔9去除20 μl所花的时间通常是在15秒到30秒之间。完整分析协议的总时间为约150分钟。在协议结束时，将流量芯片从系统去除，放置在平板阅读器（瑞士帝肯）中，并且使用预定义协议通过孔6读取450 nm处的吸光度。包含与表面积更大的分析通道耦合的空隙、肋和通道收缩的改进的流量芯片设计导致分析性能提高。与使用表4中的协议（FC-2）从图21中的流量装置进行的IL-6分析的标准曲线相比，图23A示出了使用图1所示流量芯片装置和使用表3中的协议（FC-1）进行的IL-6分析的标准曲线。在图23B中给出了通过分析窗口（高锥信号/空白信号）、信号标准偏差和检测极限（LOD）衡量的分析性能的改进。

在用PMA进行分化和用LPS进行刺激之后，对THP-1的炎症反应进行表征。在刺激之后，分化的THP-1细胞会粘附到板，并且分泌上调细胞因子。THP-1细胞在96孔板中的每孔镀20,000个细胞，并且被培养48小时。接下来，用PMA & LPS的混合物（0 pg/mL至5 pg/mL的PMA和0 pg/mL至100 pg/mL的LPS）刺激它们24小时。在细胞因子刺激前的2小时添加抗炎化合物。在培养之后，采用60 μl的上清液从每个孔进行ELISA分析。样品在－70℃下被新鲜分析或储存，以供后续分析使用。上清液以3:1稀释在分析缓冲液中，并且使用PU·MA系统流量芯片和试剂（所有抗体对都来自BioLegend）针对IL-8、TNFα和IL-1β被分析。在图24A至图24B中示出了IL8和IL-1β的细胞因子分泌因为PMA和LPS的刺激而产生的增加。

炎症是通过用细胞因子激活受体引发的，从而导致一系列信号事件。激酶激活对粘附分子和细胞因子（标志物）进行上调的转录因子。不同的标志物受到不同路径和转录因子的控制。我们研究了影响炎症路径的不同部分的三种已知的化合物。1-SB202190，即p38MAPK抑制剂，作用于JAK/STAT和NFkB路径。2-PDTC，抗氧化剂，抑制NFkB的激活。3-莫西沙星抑制酶细菌DNA旋转酶，并且在细菌生长繁殖过程中防止细菌DNA的复制。根据那些化合物的浓度测量IL-8、INFα和IL-1β的反应。在图25A中示出了IL-8的反应曲线。每个反应曲线都与4参数函数拟合，并且测量EC₅₀值。在图25B中给出了所有的三种细胞因子的结果。

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