制备屈昔多巴的酶法
阅读说明：本技术 制备屈昔多巴的酶法 (Enzymatic method for preparing droxidopa ) 是由 斯特凡诺·福加尔 保罗·斯塔比莱 彼埃雷之·帕多万 马蒂奥·德波利 安杰洛·雷斯特利 于 2019-06-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种通过式(II)化合物的改进的酶还原来制备屈昔多巴的方法,其中R~1、R~2独立地是氢、乙酰基,R~3是氢、直链或支链的C_1-C_4烷基且R~4是氢或胺保护基。(The present invention relates to a process for the preparation of droxidopa by improved enzymatic reduction of a compound of formula (II), wherein R 1 、R 2 Independently hydrogen, acetyl, R 3 Is hydrogen, straight-chain or branched C 1 ‑C 4 Alkyl radical andR 4 is hydrogen or an amine protecting group.)
技术领域
本发明涉及通过酶还原来制备屈昔多巴(Droxidopa)的方法。
背景技术
屈昔多巴在化学上被称作(2S,3R)-2-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)-3-羟基丙酸且它在结构上由以下式(I)表示。它也被称作L-苏式-二羟基苯基丝氨酸、L-苏式-DOPS、L-DOPS。屈昔多巴以市售，作为用于口服施用的剂量为100mg、200mg和300mg的胶囊。
屈昔多巴是有口服活性的合成去甲肾上腺素前体，其最初于1989年在日本推出，用于口服治疗与帕金森症相关的僵化步态或头晕，以及用于治疗与Shy-Drager综合征和家族性淀粉样多发性神经病相关的直立性低血压、晕厥或头晕。
在2011年，所述产品在美国申请批准且在2014年被批准用于治疗在有神经源性直立性低血压症状的成年病人中的直立性头晕、头昏眼花、或“将要晕厥的感觉”，所述神经源性直立性低血压症状由原发性自主神经衰竭、多巴胺β-羟化酶缺乏症和非糖尿病性自主神经病引起。
屈昔多巴补充耗尽的去甲肾上腺素，允许去甲肾上腺素再吸收到周围神经系统神经元中。所述再吸收从而刺激受体远端血管收缩，为有神经源性直立性低血压症状的病人提供生理改善。
它在其他疾病例如抑郁症中也显示出功效。
屈昔多巴是合成的氨基酸类似物，其被广泛分布于全身的多巴脱羧酶直接代谢成去甲肾上腺素。
它的化学制备通常包含多步合成。
屈昔多巴公开于美国专利3920728中(下文中称作美国的728专利)。所述美国的728专利也提供了制备屈昔多巴的方法，所述方法包含步骤：(i)3,4-二苄氧基苯甲醛与甘氨酸的反应，随后用三水合乙酸钠和二乙胺处理以获得外消旋-苏式/赤式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-丝氨酸；(ii)用苄氧甲酰氯处理步骤(i)中获得的化合物以获得外消旋-苏式/赤式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸；(iii)用二环己胺处理步骤(ii)中获得的化合物以获得外消旋-苏式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸二环己胺盐，其在乙酸乙酯的存在下用HCl气体处理以产生外消旋-苏式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸；(iv)用(+)-麻黄碱处理步骤(iii)中获得的化合物以产生L-苏式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸的(+)-麻黄碱盐；(v)水解步骤(iv)中获得的化合物以产生L-苏式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸以及(vi)用Pd/C还原步骤(v)中获得的化合物以产生L-苏式-3-(3,4-二苄氧基苯基)-丝氨酸。公开于美国的728专利的所述方法对于商业制造而言是复杂和冗长的方法。并且，为了获得苏式/赤式异构体的手性拆分导致50％非所需异构体的损失，这影响了所述方法的整体产率。
通常，所述合成中的一个或多个必需步骤需要除了反应目标位点之外的反应性位点被暂时保护。
因此，屈昔多巴的合成通常包含至少一个保护和与之相关的去保护步骤。例如，根据合成途径和在制备屈昔多巴中所用的试剂，儿茶酚组成部分、胺基组成部分和/或羧基组成部分可需要保护和后续的去保护。
文献中已经描述了一些屈昔多巴的合成方法和酶方法。
它们中的大部分需要方便地被保护的3,4-二羟基苯甲醛与甘氨酸之间的偶联以产生苏式-DOPS的非对映异构体富集的混合物。
此方法已经在专利申请JP 2007190009(A)中描述，并需要在苏氨酸醛缩酶存在下甘氨酸或其盐与3,4-二羟基苯甲醛的偶联以形成相应的对映异构体富集的氨基酸衍生物。
在专利申请EP0112606A1中描述了另一种方案，其不是立体选择性的并依赖分步结晶以分离苏式/赤式混合物。
如专利US 4319040和US 4480109中分别详述的，通过光学上拆分苏式-2-(3,4-亚甲基二氧苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸或苏式-2-(3,4-二苄氧基-苯基)-N-羰基苄氧基丝氨酸的外消旋混合物，被保护的苏式-DOPS的非对映异构体富集的混合物可以被转化成光学活性的D-和L-苏式-DOPS。这些消旋混合物的光学拆分以生成所需的L-对映异构体之后，所述亚甲基二氧基或苄基必须从儿茶酚组成部分中移除且羰基苄氧基(Cbz)必须从胺基中移除以生成屈昔多巴。
美国专利4562263公开了制备屈昔多巴的方法，所述方法包含用选自马钱子碱、辛可尼定、L-去甲麻黄碱、S-2-氨基-1,1-二苯基-异丙醇和L-3-羟基-3-(4-硝基苯基)-2-氨基-异丙醇的光学活性的胺光学拆分N-邻苯二甲酰基-3-(3,4-亚甲基二氧苯基)丝氨酸以产生L-N-邻苯二甲酰基-3-(3,4-亚甲基二氧苯基)丝氨酸，将得到的化合物与路易斯酸反应以形成N-邻苯二甲酰基-3-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸；其随后通过用肼移除邻苯二甲酰基去保护以产生L-苏式-3-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸。所述方法包含用络合剂分离异构体，其产生<50％的所需异构体。并且，所述用于邻苯二甲酰基去保护的肼已知是基因毒性的并因此需要从终产物中去除痕量的肼。
根据描述于专利申请EP 201039 A1的另一种方法，通过用L-氨基酰基转移酶处理可以将苏式-2-(3,4-二苄氧基-苯基)-N-乙酰基丝氨酸的外消旋混合物转化成L-苏式-2-(3,4-二苄氧基-苯基)-丝氨酸。
与上文引用的所有合成途径相关的缺点是在用对映异构体选择性酶或光学活性的胺转化外消旋的起始材料时，可达到纯对映异构体终产物的最大产率的50％。
拆分剂的使用使该方法变得昂贵。所述拆分剂的部分回收是可行的但是这样的回收是昂贵的，因为它需要额外的加工并且也与废物生成相关。非所需对映异构体不能被回收并被丢弃。
该产率可由于高手性纯度(>95％对映异构体过量)的需求而进一步降低。
屈昔多巴的立体选择性制备的另一种程序描述于专利申请EP375554A1中。根据后者，两个立体中心与有动态动力学分辨率(AH-DKR)的Noyori型非对称氢化反应同时引入。
所述方法特别有趣，因为它是通过在非对称氢化反应中应用的最廉价的过渡金属(钌)和手性膦类化合物(联萘二苯膦)所催化。
然而，所提出的条件对屈昔多巴的工业化生产在方便性上是不适合的，因为：100bar的氢气压力超出了正常工业管道的范围；所报道的反应时间是不实际的(几乎1周)；最佳溶剂是二氯甲烷(出于环境考虑其应当被避免)；且亚甲基二氧组成部分的去保护需要大量过量的AlCl3或AlBr3。
因此，所述现有技术的方法对于商业制造而言是有缺陷的，由于基因毒性试剂的使用带来的反应方法的不可行性和由于所述方法复杂和冗长的性质，这些方法提供了低产率的所需异构体。
因此，有明确的需求去开发更好的合成途径，其会以有效且更加具体的方式提供所需L-苏式异构体。
因此，有需求去开发制备屈昔多巴的方法，其避免了包括手性拆分的合成方法来获得所需L-苏式异构体，从而使得本发明的方法变成简单、有效、有成本效益并且是工业上可行的方法。
发明内容
因此，由本发明解决的问题是提供了一种更好的方法，所述方法通过对映异构体选择性的方法以制备由式(I)表示的化合物屈昔多巴的L-苏式异构体。
该问题通过如所附权利要求中概述的屈昔多巴的制备方法解决，所述权利要求中的定义是本说明书不可缺少的部分。
具体地，本发明提供了一种通过式(II)化合物的酶还原来产生活性成分屈昔多巴的方法：
其中R1、R2独立地是氢、乙酰基，R3是氢、直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基。
优选地，所述酶还原通过名为130的酮还原酶进行。
在另一方面，本发明提供了酮还原酶在式(II)化合物的酶还原中的用途。
本发明的目的是提供制备屈昔多巴或在其合成中有用的中间体的化学酶法，其特征在于高产率和高水平的立体控制，以避免危险试剂的使用并提供了有用于制药的适合纯度的所需化合物。
具体实施方式
本发明的目的是制备式(I)的屈昔多巴或其盐的方法：
包含以下步骤：
A)通过酮还原酶进行的式(II)化合物的酶还原以生成式(III)化合物：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢或者直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基；
其中R1、R2、R3、R4具有上文相同的含义；
B)将步骤a)中获得的式(III)化合物转化成式(I)的屈昔多巴。
根据本发明，所述方法提供了式(I)的L-苏式-3,4-二羟基苯基丝氨酸：
式(I)化合物在两个立体异构源性的碳原子(即键合至羟基的C和键合至氨基的C)上分别有R和S的构型。因此名为(2S,3R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-氨基-3-羟基丙酸。
在式(II)和式(III)化合物的另一实施方式中，R1和R2可以独立地是甲基、苄基或结合形成环的C1-C4烷基。
根据优选的实施方式，在式(II)和式(III)化合物中，所述R3是乙基或甲基。更优选地，R3是乙基。
因此，直链或支链的C1-C4烷基的定义也包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
R4可以是氢或胺保护基，其可以选自苄基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、苯磺酰基、甲苯磺酰基、甲基磺酰基、(CO)OR5或(CO)R5，其中R5是直链或支链的C1-C5烷基或R5是芳基-C0-4烷基或C0-4烷基-(未取代或取代的芳基)。
R5的直链或支链的C1-C5烷基也可以是未取代的，或者是被一个、两个或三个选自羟基和C1-5烷氧基的取代基取代的。
因此，直链或支链的C1-C5烷基的定义也可以包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基。
优选的R4基是新戊酰基、叔丁氧基羰基(同义：Boc、氨基甲酸叔丁酯)、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯或苄氧基羰基(Z或Cbz)。更优选的R4基是氨基甲酸叔丁酯、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯或苄氧基羰基(Z或Cbz)。
根据优选的实施方式，在式(II)和式(III)化合物中所述R3是乙基且R4是氨基甲酸叔丁酯。
事实上，令人惊讶地发现，通过酮还原酶(缩写为KRED)可以进行酮基的酶还原并同时在侧碳上生成立体中心。
事实上且令人惊讶地，所述酶在对映异构体选择性的还原外，在键合至氨基的相邻碳上诱导对映异构体选择。
在本发明的一个实施方式中，所述式(II)化合物优选地使用手性还原剂例如还原酶、优选地酮还原酶(KRED)或羰基还原酶还原成式(III)化合物。优选地，所述手性还原剂是KRED酶。
属于EC 1.1.1.184类的KRED酶用于从相应的立体异构酮底物前体并通过相应的外消旋酮底物的立体特异性还原以合成光学活性的醇。
KRED酶通常将酮底物转化成相应的醇产物，但也可以催化逆向反应，氧化醇底物成相应的酮产物。通过酶(例如KRED)的酮的还原和醇的氧化通常需要辅助因子。
通常，所述还原步骤在酮还原的辅助因子和任选地辅助因子再生系统的存在下通过将酮还原酶与式(II)化合物的反应而进行。
酮还原酶是可商购的，例如，从Codexis，Inc(美国)。
可以在大范围的细菌和酵母中找到KRED，见综述：Kraus和Waldman,有机合成中的酶催化(Enzyme'catalysis in organic synthesis),卷1和卷2.VCH Weinheim 1995；Faber,K.,有机化学中的生物转化(Biotransformations in organic chemistry),第四版.Springer,Berlin。
Heidelberg New York.2000；Hummel和Kuia,1989,Eur.J.Biochem.184:1-13。一些KRED基因和酶序列已经被报道，例如木兰假丝酵母(Candida magnoliae)(Genbank登记号JC7338；GL 1 1360538)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(Genbank登记号BAA24528.I；Gl:2815409)、赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)(Genbank登记号AF160799；GL653973)。
所述KRED可以是野生型或变体酶。野生型或变体KRED酶的序列提供于W02005/017135，其通过引用并入本文。KRED酶是可商购的，例如由Codexis供应。这些的实例包括但不限于KRED-101、KRED-119、KRED-130、KRED-NADH-101KRED.NAbff:.110、KRED-PI-A04、KRED-PI-B02、KRED-PI-BOS、KRED-PI-B05、KRED-PI-B10、KRED-PI-B12、KRED-PI-COI、KRED-PI-H08、KRED-PI-HIO、KRED-P2-B02、KRED-P2-C02、KRED-P2-CI 1、KRED-P2-D03、KRED-P2-DI 1、KRED-P2-D12、KRED-P2-G03、KRED-P2-H07、KRED-P3-B03、KRED-P3-G09、KRED-P3-H12和其组合。最优选地，所述酶是KRED 130。
在一个优选的实施方式中，所述KRED是130。
根据优选的实施方式，本发明的酶还原可以通过酮还原酶130进行，且在式(II)化合物中R3是乙基且R4是氨基甲酸叔丁酯。
优选地，所述酮还原酶是分离的。所述酮还原酶可以从任何宿主(例如哺乳类、丝状真菌、酵母和细菌)中分离。NADH依赖的酮还原酶的分离、纯化和表征描述于例如Kosjek等人，适用于偶合的氧化还原反应的化学耐受性醇脱氢酶的纯化和表征(Purificationand Characterization of a Chemotolerant Alcohol Dehydrogenase Applicable toCoupled Redox Reactions)，Biotechnology and Bioengineering，86：55-62(2004)。
优选地，所述酮还原酶是合成的。所述酮还原酶可以化学合成或用重组的方法合成。酮还原酶的化学生产和重组生产描述于例如EP0918090(A2)。优选地，所述酮还原酶用重组的方法在大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)中合成。优选地，所述酮还原酶是纯化的，优选地有约90％或更高的纯度，更优选地有约95％或更高的纯度。优选地，所述酮还原酶基本上不含细胞。
如本文所用，术语“辅助因子”指与酮还原酶联合作用的非蛋白化合物。适合与酮还原酶一起使用的辅助因子包括但不限于：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。通常将还原形式的辅助因子加入反应混合物中。
KRED酶通常可以使用磷酸化或非磷酸化的辅助因子。
KRED酶可以替代化学程序用于将不同的酮化合物转化成手性醇产物。这些生物催化转化可以用表达用于生物催化酮还原的酮还原酶的全细胞，或者是纯化的酶，特别是在那些其中全细胞中多种酮还原酶的存在会负面影响对映异构体纯度和所需产物的产率的情况下。对于体外应用，通常和酮还原酶一起使用辅助因子(NADH或NADPH)再生酶(例如葡萄糖脱氢酶(GDH)和甲酸脱氢酶)。
说明在生物催化方法中使用天然存在或工程化的KRED酶以生成有用的化学化合物的实例包括4-氯乙酰乙酸酯的非对称还原(Zhou,J.Am.Chem.Soc.1983 105:5925-5926；Santaniello,J.Chem.Res.(S)1984:132-133；美国专利第5559030号；美国专利第5700670号和美国专利第5891685号)、二氧代羧酸的还原(例如美国专利6399339号)、(S)-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(例如美国专利6645746号和WO 01/40450)、吡咯三嗪基的化合物的还原(例如美国申请第2006/0286646号)；取代的乙酰苯的还原(例如美国专利第6800477号)；和酮噻吩烷(ketothiolanes)的还原(WO 2005/054491)。
一些KRED基因和酶序列已经被报道，包括：木兰假丝酵母(Candida magnoliae)(Genbank登记号JC7338；GL 1 1360538)；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(Genbank登记号BAA24528.I；Gl:2815409)；赭色掷孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor)(Genbank登记号AF160799；GL653973)；高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)(Genbank登记号AAP94029.1；Gl:33112056)；短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(Genbank登记号1NXQ_A；Gl:30749782)；乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)(Genbank登记号BAD32703.1)和布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)(Genbank登记号P14941；Gl:1771790)。
KRED催化的化合物(II)还原成化合物(III)需要溶液中存在电子供体。通常，辅助因子被用作KRED还原反应中的电子供体。在此方法中，所述辅助因子与KRED和/或葡萄糖脱氢酶(缩写为GDH)联合作用。适合的辅助因子包括但不限于：NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADPH(NADP+的还原形式)、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADH(NAD+的还原形式)。通常，将还原形式的辅助因子加入反应混合物中。因此，本公开的方法在其中有选自NADPH辅助因子或NADH辅助因子的电子供体存在下进行。在特定实施方式中，所述方法可以在其中反应条件包含浓度为约0.03-0.5g/L、约0.05-0.3g/L、约0.1-0.2g/L、约0.5g/L、约0.1g/L或约0.2g/L的NADH或NADPH辅助因子下进行。
在所述方法的一些实施方式中，使用了辅助因子循环系统以从反应中产生的NADP+/NAD+中再生辅助因子NADPH/NADH。辅助因子循环系统指一系列反应物，所述反应物还原所述辅助因子(例如NADP+到NADPH)的氧化形式从而允许KRED催化继续。
所述辅助因子循环系统还可以包含次级底物和催化剂，例如底物葡萄糖和酶GDH，其通过还原剂催化氧化形式的辅助因子的还原。
从NAD+或NADP+分别再生NADH或NADPH的辅助因子循环系统是本领域已知的，并可以用于本文所述的方法中。适合的示例性可以用的辅助因子循环系统包括但不限于：葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸和甲酸脱氢酶(FDH)、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇和仲醇脱氢酶、亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶、氢分子和脱氢酶等。
适合的仲醇包括低级仲醇和芳基-烷基甲醇。低级仲醇的实例包括异丙醇、2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-戊醇、3-戊醇、3,3-二甲基-2-丁醇等。在特别优选的实施方案中，所述仲醇是异丙醇(IPA)。适合的芳基-烷基甲醇包括未取代的和取代的1-芳基乙醇。
这些系统可以与NADP+/NADPH或NAD+/NADH组合使用作为辅助因子。
使用脱氢酶的电化学再生也可以被用作辅助因子再生系统。见例如美国专利第5538867号和第6495023号，两者都通过引用并入本文。
包含金属催化剂和还原剂(例如氢分子或甲酸)的化学辅助因子再生系统也可以与NADP+/NADPH或NAD+/NADH组合使用作为辅助因子。见例如PCT公开WO 2000/053731，其通过引入并入本文。
在本公开的一些实施方式中，所述辅助因子循环系统可以包含葡萄糖脱氢酶(GDH)，其是催化D-葡萄糖(右旋糖)和NAD+或NADP+分别转化成葡萄糖酸和NADH或NADPH的NAD+或NADP+依赖的酶。适合用于本文所述的方法的实践的GDH酶包括天然存在的GDH以及非天然存在的GDH两者。编码天然存在的葡萄糖脱氢酶的基因已经在文献中有报道，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)61297GDH基因、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)ATCC 14579和巨大芽胞杆菌(B.megaterium)。用例如突变、定向进化等生成非天然存在的GDH并提供于PCT公开WO 2005/018579、以及US公开号2005/0095619和2005/0153417。
在一些实施方式中，所述辅助因子循环系统可以包含甲酸脱氢酶(FDH)，其是催化甲酸盐(formate)和NAD+或NADP+分别转化成二氧化碳和NADH或NADPH的NAD+或NADP+依赖的酶。
如本文所用，术语“甲酸盐”指甲酸盐阴离子(HCOO-)、甲酸(HCOOH)和其混合物。
适合在本文描述的KRED催化反应中用作辅助因子再生系统的FDH包括天然存在的和非天然存在的甲酸脱氢酶。适合的甲酸脱氢酶描述于PCT公开WO 2005/018579。
甲酸盐可以以盐通常是碱金属盐或胺盐(例如HCO2Na、KHCO2、NH4HCO2等)的形式、以甲酸通常是甲酸水溶液或其混合物的形式提供。可以用碱或缓冲液来提供所需的pH。
在一些实施方式中，所述辅助因子再生系统可以包含催化化合物(II)还原成化合物(III)的相同的KRED酶。在这样的实施方式中，催化化合物(II)还原成化合物(III)的相同的KRED也催化仲醇的氧化(例如，异丙醇氧化成丙酮)并从而同时将NAD+或NADP+还原成NADH或NADPH。因此，在一些实施方式中，可以在仲醇(例如IPA)存在且溶液中不存在任何回收NADPH或NADH辅助因子的辅酶(例如GDH)下进行KRED催化的化合物(II)到化合物(III)的转化。在这样的实施方式中，适合的反应条件可以包含浓度约为55-75％(v/v)的IPA、载量约为0.03-0.5g/L的NADPH或NADH辅助因子，且其中不存在除了KRED本身以外的辅助因子循环酶。
在一个实施方式中，用与辅助因子循环系统和NADPH辅助因子偶联的KRED酶还原(II)以获得化合物(III)。KRED催化的(II)还原成化合物(III)的适合的反应条件提供在下文和实施例中。
所述酶还原步骤在水性溶剂中进行。
所述酶还原步骤优选地在水性溶剂和共溶剂中进行。
所述共溶剂帮助增强有低水溶性的化合物的可溶性，从而增加反应的整体速率。适合的共溶剂包含有机溶剂例如甲醇、IPA、1-辛醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、庚烷、辛烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、2-甲基四氢呋喃(Me-THF)、甲苯等(包括其混合物)和离子液体例如1-乙基-4-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐等。
在一些实施方式中，可以用水性溶剂包括水和水性共溶剂系统。
在共溶剂系统中水与有机溶剂的比通常在从约90:10至约95:05(v/v)的水比有机溶剂的范围内。优选地所述溶剂不超过反应溶液总体积的5％。
所述水性溶剂(水或水性共溶剂系统)可以是pH缓冲的或未缓冲的。通常，所述还原可以在pH约为10或以下、通常在从约5至约10的范围内进行。在一些实施方式中，所述还原在pH约为9或以下、通常在从约5至约9的范围内进行。在一些实施方式中，所述还原在pH约为8或以下、通常在从约5至约8的范围内且通常在从约6至约8的范围内进行。所述还原也可以在pH约为7.8或以下或者7.5或以下进行。在优选的实施方式中，所述还原在中性pH即约7进行。
在所述还原反应的过程中，反应混合物的pH可变化。可以通过在反应过程中添加酸或碱将反应混合物的pH维持在所需的pH或在所需的pH的范围内。另外，可以通过使用包含缓冲液的水性溶剂来控制pH。
本领域已知的适合用来维持所需pH范围的缓冲液包括例如磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液等。也可以使用缓冲和酸或碱的添加的组合。
根据优选的实施方式，本发明的方法可以在pH为7的磷酸盐缓冲液的存在下进行。
其他可以用来进行例如上述反应的缓冲溶液是，例如，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
适合用于中和的碱是有机碱，例如胺、醇盐等，以及无机碱；例如，氢氧化物盐(例如NaOH)、碳酸氢盐(例如NaHCO3)、碳酸盐(例如K2CO3)、碱性磷酸盐(例如K2HPO4、Na3PO4)等。
适合在反应过程中添加以维持pH的酸包括有机酸例如羧酸、磺酸、磷酸等，无机酸例如氢卤酸(例如盐酸)、硫酸、磷酸等，酸性盐例如磷酸二氢盐(例如KH2PO4)、硫酸氢盐(例如NaHSO4)等。一些实施方式利用甲酸，由此维持溶液的甲酸盐浓度和pH两者。
所述还原步骤通常在从约0℃至约75℃范围内的温度进行。优选地，所述还原步骤在从约10℃至约55℃范围内的温度进行。在其他实施方式中，其在从约20℃至约45℃范围内的温度进行。在特别优选的实施方式中，所述反应在环境条件或室温下进行。
根据本发明的方法的步骤B)可以包含将R1和/或R2从乙酰基转化成氢的步骤b-1)。
在另一个实施方式中，根据本发明的方法的步骤B)可以包含将R1和/或R2从甲基或苄基或相连成环的C1-C4烷基转化成氢的步骤b-1)。
根据本发明的方法的步骤B)可以包含将R1从乙酰基、甲基、苄基、相连成环的C1-C4烷基转化成氢的步骤b-1a)；
即获得式(IV)化合物：
根据本发明的方法的步骤B)可以包含将R2从乙酰基、甲基、苄基、相连成环的C1-C4烷基转化成氢的步骤b-1b)；
即获得式(V)化合物：
根据本发明的方法的步骤B)可以包含同时将R1和R2从乙酰基、甲基、苄基、相连成环的C1-C4烷基转化成氢的步骤b-1)；
即获得式(VI)化合物：
根据本发明的方法的步骤b-1)可以是当R1和R2是乙酰基时水解酯类基团的步骤。
根据本发明的方法的步骤b-1)可以是将R1和R2转化成氢的步骤，可以根据R1和R2的性质，使用技术人员的公知常识不同地进行，其证据可以在Theodora W Greene标题为“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)”(第三版1999)的书中或者在Anthony J.Pearson标题为“有机合成试剂手册-活化试剂和保护基(Handbook ofReagents for Organic Synthesis-Activating Agents and Protecting Groups)”的书中找到。
根据本发明的方法的步骤B)可以包含将R3从直链或支链的C1-C4烷基转化成氢的步骤b-2)；
即获得式(VII)化合物：
根据本发明的方法的步骤b-2)可以是将R3转化成氢的步骤(即脂类基团的水解)，可以根据R3的性质，使用技术人员的公知常识不同地进行，其证据可以在Theodora WGreene标题为“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)”的书中或者在Anthony J.Pearson标题为“有机合成试剂手册-活化试剂和保护基(Handbook ofReagents for Organic Synthesis-Activating Agents and Protecting Groups)”的书中找到。
当R3是直链或支链的C1-C4烷基时，适合的移除R3(即将R3转化成氢)的方法是水解。该方法需要在水或醇类溶剂或其混合物中用碱溶液(例如NaOH、KOH、LiOH)处理式(III)化合物。
根据本发明的方法的步骤B)可以包含将R4从胺保护基转化成氢的步骤b-3)；
即获得式(VIII)化合物：
根据本发明的方法的步骤b-3)可以是将胺保护基裂解的步骤。
根据本发明的方法的步骤b-3)可以包含将R4转化成氢的步骤(即胺保护基的裂解)，可以根据R4的性质，使用技术人员的公知常识不同地进行，其证据可以在Theodora WGreene标题为“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)”(第三版1999)的书中或者在Anthony J.Pearson标题为“有机合成试剂手册-活化试剂和保护基(Handbook of Reagents for Organic Synthesis-Activating Agents and ProtectingGroups)”(1999)的书中找到。
根据优选的实施方式，所述步骤b-1)、b-2)和b-3)可以以任意顺序的组合完成。
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)可以包含同时将脂类基团水解和胺保护基裂解的步骤。
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)可以包含同时将将R3从直链或支链的C1-C4烷基转化成氢和将R4从胺保护基转化成氢的步骤；
即获得式(IX)化合物：
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)其特征在于同时：
·将R1和R2从乙酰基、甲基、苄基、相连成环的C1-C4烷基转化成氢；
·将R3从直链或支链的C1-C4烷基转化成氢；
即获得式(X)化合物：
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)其特征在于同时：
·将R1和R2从乙酰基、甲基、苄基、相连成环的C1-C4烷基转化成氢；
·将R4从胺保护基转化成氢；
即获得式(XI)化合物：
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)其特征在于同时：
·将R1和R2从乙酰基转化成氢；
·将R3从直链或支链的C1-C4烷基转化成氢；即获得式(X)化合物。
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)其特征在于同时：
·将R1和R2从乙酰基转化成氢；
·将R4从胺保护基转化成氢；即获得式(XI)化合物。
根据优选的实施方式，本发明的方法的步骤B)其特征在于同时：
·将R1和R2从乙酰基转化成氢；
·将R3从直链或支链的C1-C4烷基转化成氢；
·将R4从胺保护基转化成氢；
即获得式(I)化合物：
根据本发明的方法的步骤B)可以包含一步或多步通过结晶纯化或拆分的步骤。
根据优选的实施方式，所述步骤B)可以包含将式(III)或(IV)或(V)或(VI)或(VII)或(VIII)或(IX)或(X)或(XI)的化合物纯化或拆分的步骤b-4)；其允许有效清除非所需的异构体，以获得对映异构体过量的有效富集。
因此，在步骤B)的最后，本发明的方法提供了有高光学纯度的屈昔多巴，即有通常高于99.0％(e.e.)光学纯度的屈昔多巴，即高于表示为HPLC A/A％的99.5％的光学纯度的屈昔多巴。
优选地，本发明的方法提供了有高光学纯度的屈昔多巴，即有通常高于99.4％(e.e.)光学纯度的屈昔多巴，即高于99.7％HPLC A/A％的光学纯度的屈昔多巴。
对映异构体过量或缩写的“e.e.”或“ee”被定义为两种对映异构体的摩尔分数之间的绝对差且其通常表示为对映异构体过量的百分比，％ee，其可以通过以下计算获得：％ee＝|R-S|/|R+S|x100％，其中单一对映异构体的量通常可以通过手性色谱法测量。
显而易见地且任选地，本发明的方法可以被重新应用到已经光学纯化的屈昔多巴上，从而可以制备有100％光学纯度的屈昔多巴。
光学异构体苏式和赤式之间的比从50:50至99:1是指重量与重量之比，然而，其对应于通过HPLC A/A％测定的量。
根据本发明的方法的优选实施方式，式(I)化合物在苏式和赤式(苏式/赤式)之间的非对映异构体之比包含从50/50至90/10，更优选地从50/50至70/30。
根据本发明的方法的更优选实施方式，式(I)化合物在苏式和赤式(苏式/赤式)之间的非对映异构体之比为70/30。
根据本发明的优选实施方式，在步骤b-4)中，化合物(III)或(IV)或(V)或(VI)或(VII)或(VIII)或(IX)或(X)或(XI)在光学异构体之间的比为从75:25至85:15，因为此异构体之比是通过本发明的方法的酶还原通常实现的异构体之比。
说明使用技术人员的公知常识通过结晶方法的纯化和拆分的实例的证据可以在日本专利申请49252/75、36233/79、29551/81和32540/76；欧洲专利第084928号；第128684号；美国专利第3920728号中找到。
根据本发明的方法的优选实施方式，生成式(I)化合物的式(II)化合物的反应发生具有在从20％至至少95％范围内的转化。
具体地，当所述反应用KRED130进行时，转化为至少95％。
具体地，当用KRED130进行式(II)化合物的反应时，式(I)化合物在苏式和赤式(苏式/赤式)之间有70/30的非对映异构体之比。
根据本发明的方法的优选实施方式，式(I)化合物有至少75/30(苏式/赤式)的非对映异构体之比和应用的KRED130。
根据本发明的方法的优选实施方式，生成式(III)化合物的式(II)化合物的反应发生具有在从20％至至少95％范围内的转化。
具体地，当所述反应用KRED130进行时，转化为至少95％。
根据本发明的方法的优选实施方式，式(III)化合物在苏式和赤式(苏式/赤式)之间的非对映异构体之比包含从50/50至90/10，更优选地从50/50至70/30。
根据本发明的方法的更优选实施方式，式(III)化合物在苏式和赤式(苏式/赤式)之间的非对映异构体之比为70/30。
具体地，当用KRED130进行式(II)化合物的反应时，式(III)化合物在苏式和赤式(苏式/赤式)之间有70/30的非对映异构体之比。
根据本发明的方法的优选实施方式，式(III)化合物有至少75/30(苏式/赤式)的非对映异构体之比和应用的KRED130。
所述非对映异构体之比被定义为苏式异构体的摩尔分数和赤式异构体的摩尔分数之间的绝对比，其可以通过以下计算获得：比＝|苏式|/|赤式|，其中单一对映异构体的量通常可以通过手性色谱法测量。
式(III)化合物：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢、直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基；
可以通过包含通过酮还原酶进行的式(II)化合物的酶还原的步骤的方法来制备：
其中R1、R2、R3、R4具有上文相同的含义；
式(II)化合物：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢、直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基；
可以被用于制备式(III)化合物：
其中R1、R2、R3、R4具有上文相同的含义；
或用于制备式(I)的屈昔多巴或其盐
因此可以用酮还原酶来进行式(II)化合物的酶还原以提供式(III)化合物或提供式(I)的屈昔多巴或其盐：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢、直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基，；
其中R1、R2、R3、R4具有上文相同的含义；
因此，根据优选的实施方式，用于进行式(II)化合物的酶还原的酮还原酶是130。
因此，本发明的方法也提供了新的中间体，即式(II)化合物：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢、直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基。
因此，本发明的方法也提供了新的中间体，即式(III)化合物：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢、直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基；
除了所述化合物以外其中：
-R1、R2和R4是氢，R3是甲基；
-R1、R2和R4是氢，R3是乙基；
-R1和R2是氢、乙酰基，R3是乙基且R4是乙酰基；
-R1、R2和R4是乙酰基，R3是乙基。
此外，酶还原方法相比于现有技术中使用了有机金属手性催化剂的方法有利于环境。酶作为还原剂的使用相比于有机金属手性催化剂的使用更加便宜。此外，根据已知方法使用手性胺的拆分导致约50％的非所需异构体的损失且因此在工业上不适合。
实验部分
所述酮还原酶大部分是可商购的，例如由Codexi(美国)供应，例如KRED筛选试剂盒。
起始材料式(II)化合物有以下化学式：
其中R1、R2独立地是氢或乙酰基，R3是氢或者直链或支链的C1-C4烷基且R4是氢或胺保护基；或者根据现有技术已知的合成方法制备。
一些制备式(II)化合物的方法已经被描述，例如Kazuishi Makino等在Journalof the American Chemical Society(2005),127,(16),5784-5785；Brinton Seashore-Ludlow等在Organic Letters(2010),12,(22),5274-5277；Zheng Long-Sheng等在Chemical Communications,54(3),283-286；2018；Guan,Yu-Qing等在ChemicalCommunications,53(58),8136-8139；2017；Seashore-Ludlow,Brinton等在Chemistry AEuropean Journal,18(23),7219-7223,2012。
体积意指每单位产物的溶剂体积，因此，例如，1体积是每1千克1升，或每1克1毫升，或每1毫克1微升。因此，10体积意指例如每1千克物质10升。
实施例1：在式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)的酶还原中使用KRED试剂盒。
对于异丙醇依赖的酶，所述反应以1毫升在试管中进行并在室温下摇晃过夜，反应条件是：115.2mM磷酸钠缓冲液、1.53mM硫酸镁、1mM NADP+、10％v/v异丙醇、10mg/ml的式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)、10mg/ml的酶、pH 7。
对于葡萄糖依赖的酶，反应条件是：128mM磷酸钠、1.7mM硫酸镁、1.1mM NADP+、1.1mM NAD+、80mM D-葡萄糖、4.3U/ml葡萄糖脱氢酶、10mg/ml的式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)、pH 7。
在HPLC-MS中分析所述反应以确定所需产物质量。也通过HPLC来评估手性纯度并在苏式和赤式形式之间观测。
实施例2：通过式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)的酶还原合成式(I)的屈昔多巴BOC。
在50ml的pH为7的100mM磷酸盐缓冲液中，向1g式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)添加20mg MgSO4、50mg CDX-901(辅助因子再生酶、葡萄糖脱氢酶)、200mg KRED-130、50mg NADP+、1g葡萄糖。在25℃下进行所述反应并通过自动滴定添加0.5M的NaOH来维持pH 7。在64h的反应分析生成约80A％的屈昔多巴BOC后，用100ml的EtOAc和1g硅藻土来淬火反应并过滤以移除酶并分离有机层。用100ml的EtOAc洗涤水性层两次。将合并的有机层蒸馏至残留物，获得0.7g屈昔多巴BOC粗产物。通过HPLC-MS分析来分析产物。
实施例3：通过式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)的酶还原合成式(I)的屈昔多巴BOC。
在150ml的pH为7的100mM磷酸盐缓冲液中，向3g式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)添加60mg MgSO4、150mg CDX-901(辅助因子再生酶、葡萄糖脱氢酶)、600mg KRED-130、150mg NADP+、3g葡萄糖的溶液。在25℃下搅拌所述反应混合物并通过自动滴定添加0.5M的NaOH来维持pH 7。在反应15和24h后，添加150mg NADP+和150mg CDX-901。通过HPLC监测反应转化，并在120h后用100ml的EtOAc和1g硅藻土来淬火反应，随后过滤悬浮液以移除酶并分离有机层。用50ml的EtOAc洗涤水性层两次。用Na2SO4干燥合并的有机层并将其蒸馏至残留物，获得3.0g自动结晶的屈昔多巴BOC粗产物。分离的晶体屈昔多巴BOC的分析为约60A％。
实施例4：通过Boc N-保护基的化学裂解来合成式(I)的屈昔多巴乙酯。
将实施例3中获得的70mg屈昔多巴BOC溶解在1ml二氯甲烷中。在25℃下添加1mlTFA并通过HPLC监测转化。在完全裂解BOC后，通过用氮气流浓缩至残留物来分离产物屈昔多巴乙酯。
实施例5：通过R3的化学水解来合成式(I)的屈昔多巴，其中R3是乙基。
将实施例4中获得的25mg分离的屈昔多巴乙酯添加至1ml 3M的NaOH。所述反应在室温下混合2h并通过HPLC监测。在完全水解后，用10％HCl溶液中和反应并通过用氮气流浓缩溶液至残留物来分离屈昔多巴粗产物。通过HPLC来分析分离的屈昔多巴的非对映异构体纯度，其中在苏式屈昔多巴和赤式屈昔多巴形式之间观测到70:30A％的比。
实施例6：通过Boc N-保护基的化学裂解来合成式(I)的屈昔多巴乙酯。
将实施例3中获得的1g屈昔多巴BOC粗产物溶解在10ml二氯甲烷中。在25℃下添加1.5ml TFA并通过HPLC监测转化。在完全裂解BOC后，通过添加饱和NaHCO3溶液来中和pH。通过浓缩至残留物来分离产物，获得约1.3g屈昔多巴乙酯粗产物。在HPLC-MS中分析分离的产物以确定质量(Mw 241)。也通过HPLC评估非对映异构体纯度，其中在苏式和赤式形式之间观测到72:28A％的比。
实施例7：通过R3的化学水解来合成式(I)的屈昔多巴，其中R3是乙基。
将实施例6中获得的100mg分离的屈昔多巴乙酯添加至1ml水。随后添加100μl 10M的NaOH并混合30min。通过HPLC监测反应。在完全水解后，用10％HCl溶液中和反应并通过用氮气流浓缩至残留物来分离屈昔多巴粗产物。通过HPLC来分析评估分离的约100mg产物的非对映异构体纯度。在苏式屈昔多巴和赤式屈昔多巴形式之间观测到70:30A％的比。
实施例8：通过式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)的酶还原合成式(I)的屈昔多巴BOC。
在75ml的pH为7的50mM磷酸盐缓冲液中，添加20mg MgSO4、25mg CDX-901(辅助因子再生酶、葡萄糖脱氢酶)、200mg KRED-130、75mg NADP+、1.3g葡萄糖。在30℃下混合悬浮液并用0.5M的NaOH校正pH至7。随后在10min内向所述悬浮液添加溶解在3.25mlDMSO中的包含1.5g式(II)化合物(其中R1和R2是乙酰基、R3是乙基、R4是Boc)的溶液。在30℃下进行所述反应并通过自动滴定添加0.5M的NaOH来维持其pH 7。在反应9h和17h后添加75mg NADP+和25mg CDX-901。通过HPLC监测反应转化，并在22h后过滤反应以移除未溶解的材料。在母液中添加50ml EtOAc和1.5g硅藻土，混合30min，随后将其过滤并用50ml的EtOAc洗涤滤液。向所获得的溶液添加20ml NaCl并分离有机层。用20ml EtAc再次提取水性层并用30ml水洗涤合并的有机层。将所述有机层蒸馏至残留物并用30ml的DCM洗脱两次。最终获得0.9g屈昔多巴BOC并分析。
实施例9：通过Boc N-保护基的化学裂解来合成式(I)的屈昔多巴乙酯。
将实施例8中获得的0.9g屈昔多巴BOC溶解在10ml二氯甲烷中。随后，在25℃下在10min内向获得的溶液中添加1.5ml TFA。在25℃下搅拌所获得的反应混合物1h。通过HPLC监测转化。在完全裂解BOC后，通过添加饱和NaHCO3溶液来中和pH。通过蒸发至残留物来分离产物，获得约0.9g屈昔多巴乙酯粗产物。在HPLC-MS中分析分离的产物以确定质量(Mw241)。也通过HPLC评估非对映异构体纯度，其中在推定的苏式和赤式形式之间观测到72:28A％的比。
实施例10：通过R3的化学水解来合成式(I)的屈昔多巴，其中R3是乙基。
将实施例9中获得的0.5mg分离的屈昔多巴乙酯添加至6ml 3M的NaOH。在25℃下搅拌反应混合物1h并通过HPLC监测转化。在完全水解后，用10％HCl溶液中和反应并通过用氮气流浓缩所述溶液至残留物来分离屈昔多巴粗产物。通过HPLC来分析评估约0.5g分离的产物的非对映异构体纯度，其中在苏式屈昔多巴和赤式屈昔多巴形式之间观测到72:28A％的比。
实施例11：分析反应产物的分析方法
通过HPLC测定纯度、非对映异构体纯度和测试法：
色谱条件：
柱：Luna C18(2)150x 4.6mm,3.0μm
流动相A：在1000mL水中溶解1.0g 1-庚烷磺酸钠和1.36g磷酸二氢钾并用磷酸调整pH至2.0。向930ml该溶液中添加70mL乙腈。
探测器：220nm的UV
流速：1.0mL/min
柱温度：25℃
注入体积：50μl
运行时间：35分钟
稀释剂：MilliQ水。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：苯衍生物