具体实施方式

现将本公开内容的前述及其他方面关于本文所述的其他实施方案更详细地描述。应当理解的是，本发明可以不同的形式实施，且不应被解释为限于本文所阐述的实施方案。相反地，提供这些实施方案是为了使本公开内容彻底并完整，并且对本领域技术人员充分传达本发明的范围。

本文中对本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定具体实施方案的目的，而非意图限制本发明。如在本发明的描述以及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”以及“该”目的在于也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“特征在于(characterized by)”或其任何其他变型指在明确指出的任何限制的情况下，涵盖非排他性的包含。例如，包含一系列特征的组合物、混合物、流程或方法不必仅限于那些特征，而是可以包括未明确列出的或这种组合物、混合物、流程或方法固有的其他特征。

连接词“由......组成(consisting of)”排除了未指定的任何特征、步骤，或成分。如果在权利要求中，除了通常与之相关的杂质之外，其将排除掉除了所述材料之外的材料。当“由......组成”一词出现在一项权利要求正文的一个子句中，而非紧接在前序之后时，其仅限制该子句中规定的特征；其他特征不排除在整个权利要求之外。

连接词“基本上由......组成(consisting essentially of)”用于定义除了字面上公开的那些之外，还包括材料、步骤、特征、组件，或元件的组合物、方法，条件是这些附加的材料、步骤、特征、组件，或元件不会实质上影响请求保护的发明的基本与新颖特征。术语“基本上由......组成”占据“包含”及“由...组成”之间的中间地带。

如果申请人已经将发明或其一部分定义为具有开放式术语，例如“包含”，则应该容易理解(除非另有说明)该描述应该被解释为也使用术语“基本上由......组成”或“由......组成”来描述这样的发明。

如本文所用，术语“约”用于表示数值，包括，例如测量装置或用于确定该数值的方法误差的固有变异，或研究对象之间存在的变异。通常，该术语意指包括大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的变化，取决于具体情况。

除非明确指出仅指替代方案或替代方案为相互排斥的，权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，尽管本公开内容支持仅为替代方案以及“和/或”的定义。

如本文所用，术语“转化”、“转化的”或“将核酸引入宿主细胞”指有或没有伴随物质的情况下，将外源核酸(例如载体或质粒)引入宿主细胞的任何方法的应用。术语“转化细胞”或“转化的细胞”表示将外来核酸引入该细胞或其子细胞中，使得该宿主细胞含有该外来核酸。一旦引入该宿主细胞，该核酸与染色体整合并成为其片段，或作为染色体外元件保留，用于复制的目的。以例如表达载体转化合适的宿主细胞可以使用本领域已知的方法，例如电穿孔及颗粒轰击，或使用化学方法，例如以磷酸钙催化该转化过程实现。这些方法描述于例如Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory,1982年)，或Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons,1994年)。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。本文引用的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献透过引用整体并入与呈现参考文献之该些句子及/或段落相关的教示。

根据本申请的发明的实施方案涉及用于产生重组CRM197蛋白质的方法。

根据本发明的实施方案的方法涉及培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细菌细胞。培养后，该细胞，例如大肠杆菌，被诱导在最佳条件下表达该CRM197蛋白质，进而成功地达到可溶形式的重组CRM197蛋白质的过表达。优选地，该细胞在约15℃至约37℃，更优选为20～35℃、20～30℃，或20～25℃的温度下繁殖或诱导。该方法将有助于以天然构象及二硫键生产并纯化重组CRM197。

该方法可以进一步包括将密码子优化的多核苷酸克隆至表达载体中以转化细菌细胞，例如大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生物或菌株的步骤。该多核苷酸包含与SEQ IDNO:1至少90％相同的CRM197核苷酸序列，以及在该CRM197核苷酸序列的5’端编码SEQ IDNO:2的氨基酸的分泌信号序列。果胶酸裂解酶B(PelB)序列可用作该CRM197蛋白质的前导序列，使该细胞表达的CRM197蛋白质为可溶且于细胞内、周质或分泌的。在一个实施方案中，该PelB序列可来自欧文氏菌属种。该分泌信号序列可直接与该CRM197核苷酸序列连接。或者，在该分泌信号序列与该CRM197核苷酸序列之间可存在间隔区。该间隔区可包含多于或少于9个核苷酸，例如5～20个核苷酸。在一个优选的实施例方案，该表达增强子包含该CRM197核苷酸序列上游的核糖体结合位点以及ATG密码子。

将透过以下提出的特定实施例进一步说明本发明的实施方案。本领域技术人员将理解，这些实施例仅用于说明而非用于限制，因为在不脱离本发明之范围的情况下可以进行变化及修改。

无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例仅被解释为说明性的，且不以任何方式限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物均透过引用方式并入。

实施例

实施例1：构建pEGm-pho A 1.0载体，其为碱性磷酸酶A启动子衍生的表达载体

简言之，目标基因CRM197的密码子优化序列与各种5’端信号序列融合，其可将CRM197的表达引导至周质以达成正确的二硫键形成及适当的蛋白质折叠。该重组CRM197在适于表达的条件下与表达控制启动子可操作地连接。在相关方面，该5’端信号序列编码Sec依赖性信号序列，例如PelB与CRM197融合以进行周质表达。在pMK-RQ载体中合成该CRM197基因(SEQ ID NO:1)的优化序列(CRM197_pMK-RQ)，并使用数对引物将信号序列插入pMK-RQ载体中CRM197的5’端。优化该原始CRM197序列并与各种信号序列融合，然后将其亚克隆到表达载体中，例如pEGm-phoA 1.0，其含有选择标记基因，例如卡那霉素，以及磷酸盐调节的启动子，以控制蛋白质表达。

具体地，从市售载体修饰pEGm-phoA 1.0。特别是，该中的选择标记Amp^R被Kan^R取代。此外，该原始pTAC启动子也被大肠杆菌碱性磷酸酶A(phoA)启动子取代(Craig等人，1991年)。pEGm-phoA 1.0表达载体中的phoA启动子用于在精细控制磷酸盐浓度的培养基下调节CRM197的表达。

实施例1-1：构建体卡那霉素抗性基因作为选择标记

使用pET27b(+)质粒作为模板，以一对特异性引物(表1，SEQ ID NO:3与SEQ IDNO:4)扩增并获得卡那霉素抗性基因的DNA片段。亦使用作为模板，以2种特异性引物(表1，SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6)扩增pEGm-phoA 1.0的载体骨架，但不具Amp^R抗性基因。以Phusion高保真性PCR试剂盒扩增此2个DNA片段，进一步使用无缝克隆和组装(seamless cloning and assembly)试剂盒克隆此2个DNA片段，产生带有Kan^R基因的修饰的载体，命名为

表1

^#灰色区域中的序列为PelB序列的相应核苷酸序列。

实施例1-2：以pho A启动子取代pTAC启动子。

将进一步用作模板以经由2种引物(表1，SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8)扩增具有pho A启动子序列插入的整个载体。该phoA启动子在-35(CTGTCATAAAGTTGTCAC)区域含有该Pho盒序列(Craig等人，1991年)。最后，在DNA测序后，我们获得了2个具有正确pho A启动子序列的新构建体。这些新的表达载体被命名为pEGm-phoA 1.0#2以及pEGm-pho A 1.0#3。

实施例2：CRM197表达质粒的构建体

实施例2-1：CRM197基因合成

以(Life technologies^TM)合成CRM197基因的编码序列，并针对大肠杆菌表达优化密码子选择(图1)。将合成的CRM197基因插入pMK-RQ载体，命名为CRM197_pMK-RQ，其具有2个用于进一步克隆的限制酶位点，5’-HindIII与3’-EcoRI。

实施例2-2：在CRM197的5’端插入PelB信号序列

为了在蛋白质合成期间达成CRM197的正确折叠及二硫键形成，透过以2种设计的引物(表1，SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10)扩增该CRM197_pMK-RQ而将PelB的前导核苷酸序列(pelBss)插入CRM197编码序列的5’端。PelB为一种22个氨基酸的肽(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA；SEQ ID NO:2)，其可以将融合蛋白质导向周质空间并且会被内源性信号肽酶去除。新的CRM197构建体被命名为pelBss-CRM197_pMK-RQ。

实施例2-3：将pelBss-CRM197构建至pEGm-phoA 1.0

构建CRM197表达质粒的最后步骤为透过HindIII与EcoRI限制酶位点将pelBss-CRM197基因亚克隆至pEGm-phoA 1.0载体以产生表达质粒pelBss-CRM197_pEGm-phoA 1.0(图2)。我们获得了几个克隆，具有合适大小的CRM197插入片段，大约1.67kb。透过测序确认第3-14号构建体具有正确的pelBss-CRM197编码序列，随后用于蛋白质表达(图3)。

实施例3：表达细菌菌株筛选

将该表达载体pelBss-CRM197_pEGm-phoA 1.0#3-14转化到大肠杆菌BL21菌株中，并在LB琼脂平板(含有30μg/mL卡那霉素)上于37℃温育过夜，以获得几个单菌落转化物。筛选6个转化物以选择最佳的CRM197表达菌株。首先将该转化物接种于在14mL聚丙烯管中的5mL LB培养液(含30μg/mL卡那霉素)中，于37℃下，以225rpm培养5小时，直至OD₆₀₀约为1.0。接下来，将每种菌株的0.5mL培养物转移到在250mL烧瓶中的50mL表达培养基中，于37℃下，以225rpm再培养3小时。该表达培养基包含30mM硫酸铵；2.4mM柠檬酸三钠脱水物；14.35mM氯化钾；1.07g/L酵母提取物；3.22g/L胰蛋白胨，0.11M MOPS pH 8；0.55％葡萄糖以及0.007mM硫酸镁。当OD₆₀₀达到约0.5-1，优选为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0时，温度变为约16℃至25℃，优选为约20℃至25℃，更优选为20、21、22、23、24或25℃，持续29小时，用于CRM197的表达。通过SDS-PAGE进一步分析可溶性CRM197的表达程度以确定候选细菌菌株。将来自培养物上清部分的总共6μg的每种样品上样到10％SDS-PAGE中进行分析(图4(A))。这六种菌株中的CRM197表达程度看起来相当，选择第3-14-8号菌株用于进一步研究。

另外，图4(B)显示了蛋白质诱导28及45小时时PelB-CRM197的表达。表达细菌菌株按上述条件培养，但诱导时间分别为28及45小时。从结果来看，蛋白质表达在蛋白质诱导的28及45小时时是相似的，表示PelB-CRM197的表达可以在诱导28小时或之前达到峰值。

此外，第3-14-8号菌株于2017年11月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(TheAmerican Type Culture Collection,ATCC)，位于邮递区号20110，美国，弗吉尼亚州，马纳萨斯市，大学大道10801号(10801University Boulevard,Manassas,VA 20110,USA)，ATCC登录号PTA-124609，以及于2017年12月7日保藏于食品工业发展研究院(Food IndustryResearch and Development Institute,FIRDI)，邮递区号300，中国台湾，新竹市食品路331号，BCRC登录号BCRC 940662。

实施例3-A：诱导条件的优化

实施例3-A-1：表达培养基

在具有各种缓冲液组合物的培养基中测试PelB-CRM197的周质表达，例如1M的MOPS、Tris或磷酸盐缓冲液。将第3-14-8号菌株接种并于培养基中培养，加入1M MOPS、Tris以及磷酸盐缓冲液，pH8。在不同的时间点，即3及24小时收获培养的细菌，以检查缓冲液组合物对CRM197表达程度的影响。以裂解缓冲液破坏收获的细胞。透过10％SDS-PAGE分级6μg可溶性总蛋白质。

图5中的结果显示加入MOPS的培养基在诱导24小时后诱导了最多的CRM197蛋白质表达，接着是Tris及磷酸盐缓冲液。

实施例3-A-2：表达培养基的pH值

在具有1M MOPS的各种pH值，例如pH 7.0、7.5或8.0的培养基中测试PelB-CRM197的周质表达。接种第3-14-8号菌株并在7.0、7.5或8.0的各种pH值的培养基中培养。在不同的时间点，即3及24小时收获培养的细菌，以检查pH值对CRM197表达程度的影响。以裂解缓冲液破坏收获的细胞。透过10％SDS-PAGE分级6μg可溶性总蛋白质。

图6中的结果显示pH8.0的培养基在诱导24小时后诱导最多的CRM197蛋白质表达，然后是7.5及7.0。

实施例4：pelBss-CRM197 N端切割位点分析

由于可溶性形式CRM197被成功表达，接着进行检查是否已经透过细胞蛋白质酶从CRM197重组蛋白质中精确且完全地除去PelB信号序列。因此，对部分纯化的CRM197进行液相层析-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析。在本实验中，制备了两批CRM197表达细胞：一批在phoA培养基中培养，另一批在补料分批系统中使用MTB作为基础培养基(酵母提取物24g/L；植物蛋白质胨12g/L；甘油8g/L；氯化钠5g/L；磷酸二氢钾0.232g/L；磷酸氢二钾1.643g/L)。接着将收获的细胞进行一步DEAE层析，以获得用于LC-MS分析的均质化CRM197。LC-MS及CID分析的结果(图7)清楚地显示在这些部分纯化的样品中没有观察到PelB信号序列，且没有N端截短形式的CRM197蛋白质，表示PelB信号序列已经被精确且完全地自该重组CRM197去除。

实施例5：pelBss-CRM197二硫键形成分析

CRM197含有四个胱氨酸，并且可在Cys186-Cys201以及Cys461-Cys471之间形成2个内二硫键。因此，上述部分纯化的CRM197也用于二硫键分析。图8的结果显示在这二批CRM197样品中鉴定出2个二硫键，Cys186-Cys201以及Cys461-Cys471，并且没有鉴定出游离的巯基以及扰乱的二硫键。结果表示该重组CRM197产物形成正确的二硫键。

实施例6：PelBss-CRM197_pEGm-phoA 1.0BL21#3-14-8细菌菌株稳定性测定。

为了了解CRM197表达菌株的稳定性，例如第3-14-8号菌株，进行蛋白质表达及质粒稳定性分析。为了评估数代继代后的菌株稳定性，将细菌菌株连续培养并保持在指数期长达96代(在phoA培养基中倍增时间约为40分钟，数据未显示)。简言之，将一小瓶pelBss-CRM197_pEGm-phoA 1.0BL21#

3-14-8RCB解冻，将0.4mL甘油储液接种于在250mL的烧瓶内的40mL phoA培养基(含30μL/mL卡那霉素)中，于37℃下，以225rpm培养。当OD₆₀₀达到1(约4小时)时，将0.4mL培养液转移到另一个带有40mL新鲜phoA培养基的烧瓶中。该过程重复进行16次。收集培养细胞的某些阶段(第6、66及96代)并也产生甘油储液且储存于-75℃下用于进一步分析。

实施例6-1：蛋白质表达稳定性分析

为了检查CRM197表达稳定性，对三个不同继代的CRM197第3-14-8号菌株进行CRM197表达。蛋白质表达方法如前述，最终的CRM197表达分析显示于图9中。结果清楚地显示，在phoA培养基中培养27.5小时后，以10％SDS-PAGE分析，第6、66以及96代培养细胞具有相当的CRM197表达程度(图9(A))。此外，在4及27.5小时温育后测量的OD₆₀₀值非常相似(表2)：4小时0.552-0.592以及27.5小时3.402-3.576，表示这三代菌株的生长速率相似。因此，pelBss-CRM197_pEGm-phoA 1.0BL21#3-14-8RCB在96代继代中保持了很好的表达稳定性。

表2

实施例6-2：质粒稳定性分析

为了证实CRM197表达载体是否也保持其稳定性而没有DNA片段的缺失、复制或倒位，对从第6、66以及96代细胞中提取的质粒进行限制酶消化作用及DNA测序。将两组限制酶用于质粒消化。HindIII以及EcoRI可释放pelBss-CRM197基因片段(约1.67kb)以及载体骨架(约5.13kb)。另一方面，EcoRV在pelBss-CRM197_pEGm-phoA 1.0中有2个识别位点，一个位于CRM197基因上，另一个位于卡那霉素基因，可释放2个DNA片段(分别约为2.65及4.15kb)。图9(B)及9(C)上的限制酶图谱分析结果显示，当以HindIII/EcoRI或EcoRV消化0.5μg来自三代不同细胞的质粒，并以1％琼脂糖凝胶分析时，观察到预期的DNA片段。此外，还从Genomics BioSci&Tech对从96代细胞中萃取的质粒进行DNA测序(表1，SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:13)，并确认了CRM197编码基因的正确序列(数据未显示)。总之，本申请的CRM197表达菌株在多达96代的继代后仍然保持稳定的质粒稳定性。

实施例6-3：质粒拷贝数保留率分析

此外，检查96代继代后的质粒拷贝数保留率。为此，应用基于即时定量PCR(quantitative-PCR,qPCR)的方法来确定大肠杆菌中的质粒拷贝数(Lee等人，2006年)。为了计算绝对及相对质粒拷贝数，使用两组引物检测质粒中的CRM197基因作为目标基因(表1，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15)。宿主染色体中的DXS基因(D-1-去氧木酮糖-5-磷酸合酶,D-1-deoxyxylulose5-phosphate synthase)作为参考基因(表1，SEQ ID NO:16与SEQID NO:17)。由于CRM197与DXS为载体及大肠杆菌染色体中的单拷贝基因，因此该质粒拷贝数可以确定为CRM197/DXS的比例。为了计算质粒(目标基因)与参考基因的确切拷贝数，首先产生2条标准线性线，透过pelBss-CRM197_pEGm phoA 1.0以及DXS_pEGm phoA 1.0的已知分子(由浓度计算)将质粒分子转化为Ct值。接下来，对从第6、66以及96代细胞中萃取的总DNA(含有pelBss-CRM197质粒与基因组DNA)进行qPCR，并计算CRM197基因(质粒)与DXS基因(基因组)的量。最后，透过CRM197/DXS的数量获得绝对质粒拷贝数。如表3所示，透过除以6代样品的质粒拷贝数进一步计算拷贝数保留率。2次实验的结果显示，该质粒拷贝数保留率仍然保持至少80％上至第96代继代。

表3

对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所公开的实施方案进行各种修改及变化。说明书与实施例目的在于仅被视为示例性的，本公开内容的真实范围由所附权利要求书及其均等范围所指示。

参考文献

除非本说明书另有明确说明，否则以下列出并在此引用的参考文献透过引用方式结合到本说明书中。

1.Craig,S.P.III,Yuan,L.,Kuntz,D.A.,McKerrow,J.H.,and Wang,C.C.,1991.High level expression in Escherichia coli of soluble,enzymaticallyactive schistosomal hypoxanthine/Guanine phosphoribosyltransferase andtrypanosomal ornithine decarboxylase.Proc.Natl.Acda.Sci.USA.88,2500-2504.

2.Lee,C.,Kim,J.,Shin,S.G.and Hwang,S.,2006.Absolute and relative QPCRquantification of plasmid copy number in Escherichia coli.J.Biotechnol.123,273-280.

序列表

<110> 台湾浩鼎生技股份有限公司

Liu, Lee-Cheng

<120> CRM197蛋白质表达

<130> 19P0065(19Q0057)

<150> US 62/619449

<151> 2018-01-19

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRM197 DNA序列

<400> 1

ggtgcagatg atgttgttga tagcagcaaa agtttcgtga tggaaaactt cagcagctat 60

catggcacca aaccgggtta tgtggatagc attcagaaag gtattcagaa accgaaaagc 120

ggcacccagg gtaattatga tgatgattgg aaagagttct acagcaccga taacaaatat 180

gatgcagcag gttatagcgt ggataatgaa aatccgctga gcggtaaagc cggtggtgtt 240

gttaaagtta cctatccggg tctgaccaaa gttctggcac tgaaagttga taatgccgaa 300

accatcaaaa aagaactggg tctgagcctg accgaaccgc tgatggaaca ggttggcacc 360

gaagaattta tcaaacgttt tggtgatggt gcaagccgtg ttgtgctgag cctgccgttt 420

gcagaaggta gcagcagcgt tgaatatatc aataattggg aacaggcaaa agccctgagc 480

gttgaactgg aaatcaattt tgaaacccgt ggtaaacgtg gtcaggatgc aatgtatgaa 540

tacatggcac aggcatgtgc aggtaatcgt gttcgtcgta gcgttggtag cagcctgagc 600

tgtattaatc tggattggga tgtgattcgc gacaaaacca aaacgaaaat cgaaagcctg 660

aaagaacatg gtccgatcaa aaacaaaatg agcgaaagcc cgaataaaac cgtgagcgaa 720

gaaaaagcaa aacagtatct ggaagaattt caccagaccg cactggaaca tccggaactg 780

agcgaactga aaaccgttac cggcaccaat ccggtttttg ccggtgcaaa ttatgcagca 840

tgggcagtta atgttgcaca ggttattgat agcgaaaccg cagataatct ggaaaaaacc 900

accgcagcac tgagcattct gcctggtatt ggtagcgtta tgggtattgc agatggtgca 960

gtgcatcata ataccgaaga aattgttgcc cagagcattg ccctgagcag tctgatggtt 1020

gcccaggcaa ttccgctggt tggtgaactg gttgatattg gttttgcagc ctataacttt 1080

gtcgagagca tcattaacct gtttcaggtt gtgcataaca gctataatcg tccggcatat 1140

agtccgggtc ataaaaccca gccgtttctg catgatggtt atgcagttag ctggaatacc 1200

gttgaagata gcattattcg taccggcttt cagggtgaaa gcggtcatga tatcaaaatt 1260

accgcagaaa atacaccgct gccgattgcc ggtgttctgc tgccgaccat tccgggtaaa 1320

ctggatgtga ataaatccaa aacccacatt agcgtgaacg gtcgtaaaat tcgtatgcgt 1380

tgtcgtgcaa ttgatggtga tgttaccttt tgtcgtccga aaagtccggt ttatgttggt 1440

aatggtgttc atgcaaatct gcatgttgca tttcatcgta gctccagcga aaaaattcat 1500

agcaatgaaa ttagcagcga tagcattggt gttctgggtt atcagaaaac cgtggatcat 1560

accaaagtga atagcaaact gagcctgttc tttgaaatca aaagctaa 1608

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PelB 果胶酸裂解酶B)氨基酸信号序列

<400> 2

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala

20

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Kan-F

<400> 3

tgaaaaagga agagtatgag ccatattcaa cgg 33

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Kan-R

<400> 4

aacttggtct gacagttaga aaaactcatc gagcat 36

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTAC-F

<400> 5

ctgtcagacc aagtttactc atatatac 28

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTAC-R

<400> 6

actcttcctt tttcaatatt attgaa 26

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> phoA-pTAC-1-F

<400> 7

ctttgttttt attttttaat gtatttgtac ataggagata taatatgaag cttcctcg 58

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> phoA-pTAC-1-R

<400> 8

cgactataag tctcggccgt gacaacttta tgacagaatt tcagaaggat cctctacgc 59

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pelB-F

<400> 9

ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc ggtgcagatg atgttgttga ta 52

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pelB-R

<400> 10

cagaccagca gcagcggtcg gcagcaggta tttaagctta tgcggccttg a 51

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> phoA-SEQ-F

<400> 11

gcgtagagga tccttctgaa at 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTAC-SEQ-R

<400> 12

ctgtatcagg ctgaaaatct tctc 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRM197-433-F

<400> 13

gcagcagcgt tgaatatatc a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EG-197(II)-F

<400> 14

gcgaactgaa aaccgttacc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EG-197(II)-R

<400> 15

accaatacca ggcagaatgc 20

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DXS-XhoI-F

<400> 16

actgctcgag taagttttga tattgccaaa tacccgacc 39

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DXS-EcoRI-R

<400> 17

actggaattc ttatgccagc caggccttga 30

PCT/RO/134表