脂质纳米片
阅读说明：本技术 脂质纳米片 (Lipid nanosheet ) 是由 南佐旻 金鲜基 徐进荣 朴夏亨 于 2019-05-23 设计创作，主要内容包括：根据本公开的脂质纳米片包括：支撑的脂质双层,具有组合在纳米颗粒单元中的多个纳米颗粒；多个纳米颗粒之中的固定的纳米受体,包括结合到纳米受体的表面的至少一个第一表面分子；以及多个纳米颗粒之中的可移动的纳米漂浮物,包括结合到纳米漂浮物的表面的至少一个第二表面分子。根据由至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子对输入的反应的结果来控制纳米受体与纳米漂浮物之间的相互作用,并且脂质纳米片基于相互作用提供逻辑结果。(Lipid nanoplatelets according to the present disclosure comprise: a supported lipid bilayer having a plurality of nanoparticles combined in nanoparticle units; an immobilized nano-receptor among a plurality of nanoparticles comprising at least one first surface molecule bound to a surface of the nano-receptor; and a plurality of movable nano-floats among the nano-particles, including at least one second surface molecule bound to a surface of the nano-floats. The interaction between the nano-receptors and the nano-floats is controlled as a result of a reaction to the input by the at least one first surface molecule and the at least one second surface molecule, and the lipid nanoplatelets provide a logical result based on the interaction.)
技术领域
本公开涉及使用纳米颗粒的计算。具体地，本公开涉及使用生物信息作为输入的纳米颗粒计算。
背景技术
在许多长度尺度上，物质已经与计算合并，从微尺寸的液滴和微粒到分子机器和诸如酶和核酸的生物分子。然而，尽管将从控制其潜在有用的等离子激元性质、光子性质、催化性质和材料性质而受益的广泛的潜在的应用，但是在纳米尺度的物体中(特别是在纳米颗粒中)实施复杂计算仍未被探索。
使用纳米颗粒作为基底进行计算的常用方法是用刺激响应型表面配体使“核”结构功能化。然后，一组表面改性的纳米颗粒可以响应于各种化学输入和物理输入来进行基本逻辑运算，理想地，单个纳米颗粒应被用作模块化的“纳米部件”，期望的计算应以即插即用的方式实现。然而，这种现有方法已经限于安装适用于仅控制简单输出的少量逻辑计算，诸如颗粒的聚集/分散和表面分子的释放。这种限制是因为在溶液相中难以对多个逻辑门进行模块化布线，其中，输入、逻辑门和输出都在三维空间中不可控地扩散。
具体地，以下约束已经对用纳米颗粒的计算施加了限制。
首先，逻辑嵌入的颗粒在一次操作之后不可逆地改变，并且与未反应的输入不加选择地混合在一个整体溶液(bulk solution)中。区室化的缺少阻止了每个试管实施超过一个的计算任务。
其次，难以控制或表征3D空间中自由地扩散的单个颗粒的结构改变、动态相互作用和输出信号。在大多数情况下，仅获得平均信号作为最终读出，其中，计算的逐个颗粒响应被平均。
因此，这些约束对采用纳米颗粒作为模块化和可组合的部件施加了限制，模块化和可组合的部件可以被重新构造为以“即插即用”的方式实施期望的计算。
发明内容
技术问题
为了构建复杂且可靠的纳米颗粒电路，有必要超越曾经依赖于溶液步骤的方法，转向具有原位读出和控制功能的可扩展集成平台。另外，期望的纳米颗粒电路应基于数字设计原理系统地设计和构建。
技术方案
具有计算能力的纳米颗粒系统可以实现在单个纳米颗粒的简单集合中无法实现的复杂功能。这种“纳米系统”响应于刺激自主地执行复杂任务。然后，纳米系统可以是可以引导物质和信息以纳米尺度流动的系统。
用纳米颗粒处理分子信息允许将纳米颗粒的丰富且强大的功能合并到分子计算过程上的算法和自主控制中。在本公开中，被命名为“脂质纳米片”的平台被提供以构建可以产生纳米颗粒电路的广泛地可适用的系统。脂质纳米片是在二维脂质双层中以单个颗粒的水平构建纳米颗粒逻辑门和电路的技术。这种脂质双层类纳米颗粒计算平台(用计算机系统/软件作为使用基础)在下文中被称为脂质纳米片(LNT)。
脂质纳米片使用脂质双层作为化学/生物板，在其上放置有表面改性的纳米颗粒以使脂质双层能够与分子信息反应，以容纳纳米颗粒，并且将它们用作计算的单元。单纳米颗粒逻辑门感测分子输入且触发颗粒组装或分解。通过本公开，可以提供一组诸如AND、OR和NOT计算的布尔逻辑运算、扇入/扇出的逻辑门以及诸如多路转接器的电路。如所描述的，在脂质纳米片上实现纳米颗粒电路模块可以在信息处理纳米系统中打开先前未知的机会。
根据本发明的一个方面的脂质纳米片包括：支撑的脂质双层，多个纳米颗粒以纳米颗粒单元集成到其；固定的纳米受体，包括栓系到表面的至少一个第一表面分子，并且在多个纳米颗粒之中是固定的；以及纳米漂浮物，包括拴系到表面的至少一个第二表面分子，并且在多个纳米颗粒之中是可移动的，其中，纳米受体与纳米漂浮物之间的相互作用根据至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子相对于输入的反应结果来控制，并且提供基于相互作用的逻辑结果。
脂质纳米片可以包括基于组装反应产生逻辑结果的YES门，在组装反应中，至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子通过输入组合，并且因此纳米受体和纳米漂浮物被拴系。
输入可以包括DNA输入，并且至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子分别包括表面DNA配体，并且纳米受体的表面DNA配体和纳米漂浮物的表面DNA配体可以响应于DNA输入来杂交。
脂质纳米片可以包括基于分解反应产生逻辑结果的YES门，当纳米受体和纳米漂浮物通过至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子的组合拴系时，分解反应通过输入去除纳米受体与纳米漂浮物之间的拴系。
输入可以包括DNA输入，并且DNA输入可以在通过DNA键拴系的纳米受体和纳米漂浮物的预二聚化中通过支点介导的链置换去除DNA键。
脂质纳米片可以包括AND门，AND门通过纳米受体和纳米漂浮物的拴系来产生逻辑结果，纳米受体和纳米漂浮物通过对至少一个第一表面分子的第一输入和对至少一个第二表面分子的第二输入的组合来拴系。
至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子可以包括构象可切换的第一DNA发夹和第二DNA发夹，并且第一DNA发夹可以通过与第一输入杂交而打开，并且因此第一结合域被暴露，第二DNA发夹可以通过与第二输入杂交而打开，并且因此第二结合域被暴露，并且纳米受体和纳米漂浮物可以通过第一结合域和第二结合域的杂交而拴系。
至少一个第一表面分子可以包括第三表面分子和第四表面分子，至少一个第二表面分子可以包括第五表面分子和第六表面分子，并且脂质纳米片可以包括OR门，OR门通过第一输入与第三表面分子和第五表面分子的组合以及第二输入与第四表面分子和第六表面分子的组合中的至少一个从纳米受体和纳米漂浮物的拴系产生逻辑结果。
第三表面分子至第六表面分子可以是DNA配体，并且可以包括第一结合域至第四结合域，并且第一输入可以与第一结合域和第三结合域杂交，并且第二输入可以与第二结合域和第三结合域杂交。
至少一个第一表面分子可以包括第三表面分子和第四表面分子，至少一个第二表面分子可以包括第五表面分子和第六表面分子，第三表面分子和第五表面分子可以组合，第四表面分子和第六表面分子可以组合，并且第三表面分子和第五表面分子可以组合，第四表面分子和第六表面分子可以组合，并且脂质纳米片可以包括AND门，AND门通过去除第三表面分子和第五表面分子的组合且去除第四表面分子和第六表面分子的组合来产生逻辑结果。
第三表面分子与第五表面分子之间的第一DNA结合以及第四表面分子与第六表面分子之间的第二DNA结合可以暴露第一支点域和第二支点域，第一支点域可以是第一输入的识别区域，第一输入可以通过链置换去除第一DNA结合，第二支点域可以是第二输入的识别区域，并且第二输入可以通过链置换去除第二DNA结合。
至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子可以组合，并且脂质纳米片可以包括OR门，OR门通过第一输入和第二输入中的至少一个通过去除至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子产生逻辑结果。
至少一个第一表面分子和至少一个第二表面分子的组合可以是DNA结合，DNA结合可以包括第一支点域和第二支点域，并且当第一支点域募集第一输入时，第一输入通过与至少一个第一表面分子的链置换裂解DNA结合，或者当第二支点域募集第二输入时，第二输入可以通过与至少一个第二表面分子的链置换裂解DNA结合。
纳米受体与纳米漂浮物之间的相互作用可以是通过第一输入和第二输入控制的第一逻辑门，多个纳米颗粒之中的另一个第一纳米受体与另一个第一纳米漂浮物之间的相互作用可以是通过第三输入和第四输入控制的第二逻辑门，并且脂质纳米片可以包括第三逻辑门，第三逻辑门基于第一逻辑门的第一逻辑结果和第二逻辑门的第二逻辑结果产生逻辑结果。
纳米受体和纳米漂浮物可以被第一输入和第二输入中的至少一个栓系，第一纳米受体和第一纳米漂浮物的栓系可以通过第三输入和第四输入分解，并且第一逻辑输出可以是第三逻辑门的逻辑OFF输出，并且第二逻辑输出可以是第三逻辑门的逻辑ON输出。
至少一个第一表面分子可以包括第三表面分子和第四表面分子，至少一个第二表面分子可以包括第五表面分子和第六表面分子，并且脂质纳米片可以包括INHIBIT门，INHIBIT门通过去除第三表面分子与第五表面分子之间的组合产生逻辑结果。
第二输入可以组合第四表面分子和第六表面分子。
第一输入可以去除第三表面分子与第五表面分子之间的DNA结合。
当拴系到至少一个第一表面分子和纳米受体的表面的第三表面分子和第四表面分子以及拴系到至少一个第二表面分子和纳米漂浮物的表面的第五表面分子和第六表面分子彼此相互作用时，可以控制纳米受体和纳米漂浮物的相互作用。
第一输入和第二输入中的至少一个可以去除至少一个第一表面分子与至少一个第二表面分子之间的组合，第三输入和第四输入中的至少一个可以去除第三表面分子与第五表面分子之间的组合，并且，第五输入和第六输入中的至少一个可以去除第四表面分子与第六表面分子之间的组合。
第一输入和第二输入中的至少一个可以去除至少一个第一表面分子与至少一个第二表面分子之间的组合，第三输入可以形成第三表面分子与第五表面分子之间的组合，并且第四输入可以形成第四表面分子与第六表面分子之间的组合。
第一输入可以去除至少一个第一表面分子与至少一个第二表面分子之间的组合，第二输入可以去除第三表面分子与第五表面分子之间的组合，并且第三输入可以形成第四表面分子与第六表面分子之间的组合。
纳米受体与纳米漂浮物之间的第一相互作用可以通过多个纳米颗粒之中的第一输入和第二输入控制，另一个第一纳米受体与另一个第一纳米漂浮物之间的第二相互作用可以通过第三输入和第四输入控制，并且第一输入和第三输入可以具有相同的类型，并且第二输入和第四输入具有相同的类型。
根据第一相互作用检测的图像信号的颜色和根据第二相互作用检测的图像信号的颜色可以彼此不同。
纳米受体与纳米漂浮物之间的栓系可以通过第一输入和第二输入分解，并且第一纳米受体与第一纳米漂浮物之间的栓系可以通过第三输入和第四输入分解。
根据本发明的另一方面，在多个纳米颗粒以纳米颗粒单元集成到其的支撑的脂质双层中的脂质纳米片包括：第一纳米受体；第二纳米受体；第一纳米漂浮物，根据用于第一纳米受体的至少一个输入相互作用；以及第二纳米漂浮物，根据用于第二纳米受体的第一输入相互作用，其中，包括第一纳米受体的第一逻辑门与包括第二纳米受体的第二逻辑门之间的布线可以基于第一纳米漂浮物和第二纳米漂浮物来确定。
第一纳米漂浮物和第二纳米漂浮物可以具有相同的类型，并且第一逻辑门和第二逻辑门可以是AND布线的。
至少一个输入可以包括两个输入，并且脂质纳米片可以根据两个输入来输出第一纳米受体和第一纳米漂浮物的相互作用的结果，并且根据第一输入来输出第二纳米受体和第二纳米漂浮物的相互作用的结果。
第一纳米受体与第一纳米漂浮物之间的拴系可以通过两个输入分解，并且因此第一纳米漂浮物可以被释放，并且第一纳米漂浮物和第二纳米受体可以通过第一输入拴系。
第一纳米受体与第一纳米漂浮物之间的拴系可以通过两个输入中的至少一个分解，并且因此第一纳米漂浮物可以被释放，并且第一纳米漂浮物和第二纳米漂浮物可以通过第一输入拴系。
第一纳米受体与第一纳米漂浮物之间的栓系可以通过两个输入中的一个分解，并且因此第一纳米漂浮物可以被释放，第一纳米漂浮物和第二纳米漂浮物可以通过第一输入栓系，并且第一纳米受体和第一纳米漂浮物可以通过两个输入中的另一个栓系。
第一纳米漂浮物和第二纳米漂浮物可以具有不同的类型，并且第一逻辑门和第二逻辑门可以是OR布线的。
至少一个输入可以包括两个输入，并且脂质纳米片可以根据两个输入来输出第一纳米受体和第一纳米漂浮物的相互作用的结果，并且根据第一输入来输出第二纳米受体和第二纳米漂浮物的相互作用的结果。
第一纳米受体与第一纳米漂浮物之间的栓系可以通过两个输入分解，并且因此第一纳米漂浮物可以被释放，并且，第二纳米受体和第二纳米漂浮物可以通过第一输入分解，并且因此第二纳米漂浮物可以被释放。
第一纳米受体与第一纳米漂浮物之间的栓系可以通过两个输入中的至少一个分解，并且因此第一纳米漂浮物可以被释放，并且第二纳米受体和第二纳米漂浮物可以通过第一输入分解，并且因此第二纳米漂浮物可以被释放。
根据本发明的另一方面，在多个纳米颗粒以纳米颗粒单元集成到其的支撑的脂质双层中的脂质纳米片包括：第一逻辑门，其中第一纳米受体和第一纳米漂浮物根据选择的输入和第一输入彼此相互作用；以及第二逻辑门，其中第二纳米受体和第二纳米漂浮物根据选择的输入和第二输入彼此相互作用，其中，第一逻辑门和第二逻辑门中的一个可以根据选择的输入释放与根据第一输入和第二输入之中的对应的输入对应的纳米漂浮物。
第一纳米受体和第一纳米漂浮物可以通过第一输入分解，第一纳米受体和第一纳米漂浮物可以通过选择的输入组装，并且第二纳米受体和第二纳米漂浮物可以通过第二输入和选择的输入分解。
脂质纳米片还可以包括：第一表面分子和第二表面分子，拴系到第一纳米受体的表面；以及第三表面分子和第四表面分子，拴系到第一纳米漂浮物的表面，其中，第一表面分子与第三表面分子之间的组合通过第一输入去除，并且第二表面分子和第四表面分子通过选择的输入组合。
脂质纳米片还可以包括：第五表面分子和第六表面分子，拴系到第二纳米受体的表面；以及第七表面分子和第八表面分子，拴系到第二纳米受体的表面，其中，第五表面分子和第七表面分子的组合可以通过第二输入去除，并且第六表面分子和第八表面分子可以通过选择的输入去除。
根据本发明的另一方面，在多个纳米颗粒以纳米颗粒单元集成到其的支撑的脂质双层中的纳米生物计算方法包括以下步骤：根据输入，在脂质双层中的多个固定的纳米受体与脂质双层中的多个可移动的纳米漂浮物之间产生多个相互作用；基于多个相互作用产生多个信号；跟踪多个信号之中的仅从多个纳米受体产生的信号；以及基于跟踪结果确定逻辑结果。
跟踪可以包括以下步骤：通过暗场显微镜在产生的图像数据中检测比检测参数高的信号；通过区分检测的信号的边界产生分段信号；通过定位分段信号的中心来提供纳米颗粒的位置；通过多个帧通过比较纳米颗粒的位置识别纳米受体；以及对与识别的纳米受体对应的信号采样。
跟踪结果中的信号的强度的增加可以指示多个纳米受体之中的与输入对应的纳米受体和多个纳米漂浮物之中的与输入对应的纳米漂浮物的组装。
跟踪结果中的信号的强度的降低可以指示多个纳米受体之中的与输入对应的纳米受体和多个纳米漂浮物之中的与输入对应的纳米漂浮物的分解。
有益效果
可以提供一种脂质纳米片，所述脂质纳米片可以用具有实时读出和控制功能的可扩展集成平台基于数字设计原理系统地设计和建造电路，同时克服了一次只能驱动一种计算的溶液类的现有方法的局限性。
附图说明
图1A至图1C示出了LNT上的单个纳米颗粒逻辑计算。
图2A和图2B是用于描述LNT平台的示意图。
图3A至图3C示出了DNA改性的纳米颗粒的特征。
图4A至图4C示出了用于分析单个纳米颗粒散射信号的相关DFM-SEM图像。
图5A至图5B示出了拴系到支撑的脂质双层的纳米颗粒的扩散动力学。
图6A和图6B示出了基于支点介导的链置换的单个输入分离YES门的运算。
图7示出了通过暗场显微镜在纳米颗粒逻辑门运算中的平行的单颗粒分析。
图8A和图8B示出了纳米颗粒拴系到支撑的脂质双层的逻辑门。
图9是示出了通过MATLAB类模拟的多聚体形成反应的程度的曲线图。
图10A至图10C示出了用于LNT上的逻辑门的纳米颗粒的清晰和更定量可视化的用于仅受体的数字图像处理的算法。
图11A至图11C示出了R纳米颗粒、G纳米颗粒和B纳米颗粒的散射信号分布。
图12A至图12D示出了LNT上的双输入纳米颗粒逻辑门。
图13示出了双输入组装门的运算原理和DNA序列。
图14示出了双输入组装OR门的运算原理和DNA序列。
图15示出了双输入分解AND门的运算原理和DNA序列。
图16示出了两个输入OR门的运算原理和DNA序列。
图17A至图17F示出了纳米颗粒逻辑门的设计原理。
图18A至图18C示出了两个发夹类输入组装AND门中的模块性。
图19示出了两个输入分解OR门的不均匀响应。
图20A至图20B示出了NAND门的双轨。
图21A至图21C示出了处理INHIBIT运算且具有多个输入(扇入)和多个输出(扇出)的纳米颗粒逻辑门。
图22A至图22B示出了双输入分解INHIBIT门的运算。
图23示出了六输入分解门的运算。
图24A至图24B示出了多输入分解门。
图25A至图25C示出了通过网络编程的纳米颗粒逻辑门的连接。
图26示出了双层AND-AND级联电路的重建的暗场快照。
图27示出了双层OR-AND级联电路。
图28示出了双层INHIBIT-AND级联电路。
图29示出了双层AND-OR级联电路的暗场快照。
图30示出了双层OR-OR级联电路。
图31A到31C示出了纳米颗粒多路转接器电路的设计和实施方案。
图32示出了域级中的多路转接电路运算。
图33A至图33C示出了相对于漂浮物扩散的鲁棒性的分析。
具体实施方式
本公开中公开的发明可以应用于基于纳米颗粒附着到其的脂质膜的全部的纳米颗粒计算，而不限于DNA分子。可以附着到纳米颗粒的分子可以包括诸如DNA、RNA、蛋白质、多肽、金属螯合剂等的各种化学配体。即，本发明不仅可以应用于生物计算，而且可以应用于纳米颗粒脂质平台类分子计算。
细胞膜在生物学上起到与电子电路的电路板相同的功能。细胞膜将受体和细胞的富含信息的外部流体区分开，同时在计算单元中容纳各种受体蛋白，并且通过引导受体在二维流体表面上横向地相互作用来执行复杂功能。作为生物电路的活性成分的每个受体将化学和物理线索(诸如与配体的结合事件和膜电压的改变)作为“输入”，并且产生诸如构象改变和二聚化/解离反应的“输出”。膜可以允许许多不同的计算过程平行发生。
从细胞膜得到灵感，脂质纳米片(LNT)包括光散射等离子激元纳米颗粒拴系到其的支撑的脂质双层(SLB)，并且使用SLB执行逻辑计算。为了执行计算，编程了SLB拴系的纳米颗粒使用表面配体彼此相互作用。
已经广泛地用作用于细胞表面的合成模拟物的SLB在此用作“化学电路板”，执行计算的纳米颗粒放置在表面上。将纳米颗粒栓系到脂质双层能够实现以下目的。
首先，颗粒与颗粒之间的相互作用被限制为仅通过2D反应空间处的横向扩散发生。其次，因为大量的光散射纳米颗粒被限制在暗场显微镜(DFM)的焦平面中，所以可以以单颗粒分辨率来实现纳米颗粒相互作用的平行原位跟踪和分析。第三，纳米颗粒与包含分子输入的溶液区分。通过使用这种特征，可以提供作为用单个纳米颗粒进行计算的非常规方式的“纳米生物”计算。纳米生物计算发生在纳米结构和生物分子的界面处。为了证明这一点，在本公开中，纳米颗粒通过使用强生物素-链霉亲和素相互作用而拴系到脂质双层，并且使用DNA作为分子输入DNA和表面配体。然而，本发明的表面配体不限于DNA，并且可以应用可以通过与分子输入的特异性地反应来提供能够控制纳米颗粒之间的相互作用的结合(例如抗原-抗体结合、配体-受体结合、螯合结合、共价结合、氢键结合、范德华结合、通过疏水作用的结合、静电结合或通过化学反应的结合)的分子以及能够提供功能结合、静电结合或化学结合的结合分子。
图1A至图1C示出了LNT上的单个纳米颗粒逻辑计算。
图2A和图2B是用于描述LNT平台的示意图。
如图1A、图2A和图2B中所示，LNT由流动室组成，流动室的底部基底涂覆有与纳米颗粒接合的SLB芯片，纳米颗粒的光学信号、迁移率和表面DNA配体容易地可调节。
与单纳米颗粒逻辑计算相关的DNA序列和实验条件总结在表1、表2和表13中。
在图1A中，示出了LNT平台的示意性结构。两类纳米颗粒(固定的纳米受体(NR)和可移动的纳米漂浮物(NF))栓系到支撑的脂质双层(SLB)。两种纳米颗粒将DNA作为输入，并且用逻辑运算的输出改变纳米颗粒的相互作用。然后，发生组装反应或分解反应。
如图2A中所示，脂质纳米片使用分子作为输入，并且通过连接到支撑的脂质双层的动态纳米颗粒网络执行纳米颗粒逻辑计算，并且使用可以用暗场显微镜容易地读取和分析的输出来提供原位光学读数(optical reading)。纳米颗粒逻辑单元通过纳米颗粒表面上的生物素化DNA接头(linker)与栓系到生物素化DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)脂质的链霉亲和素之间的强相互作用连接到脂质双层表面。结合的纳米颗粒受体和漂浮物用作逻辑门，并且通过使用可编程的刺激响应型表面配体来处理溶液中的分子信息。
如图2B中所示，支撑的脂质双层表面是用于纳米颗粒计算的化学电路试验板。纳米颗粒逻辑门通过化学栓系集成到脂质双层芯片。基本上，许多不同的纳米颗粒逻辑门集成到单个脂质双层表面，因此每个逻辑门可以以平行方式执行逻辑计算，同时产生不同的(或独特的)光学信号。当纳米颗粒逻辑门集成在脂质芯片上时，洗涤缓冲液、纳米颗粒门或包括分子输入的溶液可以交换结合的颗粒而不交换拴系的颗粒。此外，暗场成像可以在溶液交换期间原位执行。
图3A至图3C示出了DNA改性的纳米颗粒的特征。
在图3A中，示出了具有主要地显示红色(R)散射信号的银纳米壳的金纳米棒(直径＝22.2±1.2nm，长度＝55.9±2.9nm，长宽比＝2.5)。
在图3B中，示出了主要地显示绿色(G)散射信号的金纳米球(直径＝50.0±1.8nm)。
在图3C中，示出了在主要地显示蓝色(B)散射信号的金种子上的银纳米球(直径＝54.8±3.1nm)。
在图3A至图3C中，第一列示出了透射电子显微镜图像，第二列示出了从紫外-可见分光光度计获得的消光光谱，三个光谱用1光学密度(OD)归一化。第三列示出了暗场显微镜(DFM)图像。
如图3A至图3C中所示，存在三种类型的核纳米颗粒，例如，按照图3A至图3C的顺序，具有银纳米壳的金纳米棒、金纳米球和银纳米球分别用作显示红色R散射信号、绿色G散射信号和蓝色B散射信号的金种子。通过LNT上的纳米颗粒单元的计算通过DFM直接地可视化，使用流动室能够容易地交换溶液，而不洗掉系统中的纳米颗粒电路。
图4A至图4C示出了用于分析单个纳米颗粒散射信号的相关DFM-SEM图像。
在图4A至图4C中，左列是在图案化的玻璃基底上的纳米颗粒的DFM图像，中心列是在左列的图像中的标记区域中的放大的DFM图像，右列是在与中心列的图像相同的位置处的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图4A示出了具有银纳米壳的金纳米棒(R纳米颗粒)的DFM图像和SEM图像，图4B示出了金纳米球(G纳米颗粒)的DFM图像和SEM图像，图4C示出了具有银纳米壳的金纳米球(B纳米颗粒)的DFM图像和SEM图像。
可以确定的是，Cr图案化的玻璃基底有助于在两个图像中找到相同的位置。两个图像的相互关系表明在图3A至图3C中所示的特征化的散射信号来自单个纳米颗粒。
当两个等离子激元纳米颗粒紧密接近时，纳米颗粒表现出等离子激元结合效应(plasmon binding effect)，因此可以通过分析DFM图像的散射强度来确定亮颗粒是单个纳米颗粒还是聚集的纳米颗粒。与SEM图像中的相同位置相比，可以确认在DFM图像中的初始状态中的亮斑来自单个纳米颗粒。
使用两类纳米颗粒(纳米受体(NR)和纳米漂浮物(NF))作为LNT的基本成分。纳米受体和纳米漂浮物中的每个的表面DNA配体用一种方法设计，在该方法中，根据从溶液得到DNA分子的逻辑计算的结果来控制受体-漂浮物相互作用(例如，通过组装或分解)。
图5A和图5B示出了拴系到支撑的脂质双层的纳米颗粒的扩散动力学。
在图5A中，示出了相对于时间的均方位移(MSD)以绘制五个代表性扩散轨道。如图5A中所示，三个迁移率R、G和B以及纳米漂浮物R-NF、G-NF和B-NF的MSD绘图示出了随机2D布朗运动的线性关系，G受体G-NR和B受体B-NR的MSD绘图示出了G受体G-NR和B受体B-NR的固定性。
在图5B中，示出了扩散的R-NF(Ntot＝154)、G-NF(Ntot＝194)和B-NF(Ntot＝247)的平均扩散系数。
如图5A和图5B中所示，因为受体的横向扩散被与SLB上的链霉亲和素相互作用的大量生物素化DNA接头限制，所以受体在SLB上是固定的。受体表面化合价的34％至50％被接头功能化。受体在整个计算过程中被监测，并且用作纳米颗粒计算的报告分子(reporter)。
漂浮物以约1.0μm2/s的扩散系数在SLB上是高度地可移动的，漂浮物的生物素接头化合价在0.4％至0.5％的范围内。
由于高移动性，NF可以在空间和时间上与NR主动地(或积极地)相互作用，同时用作计算的活动单元。表面DNA配体介导受体-漂浮物相互作用，将DNA分子作为输入，并且诱导受体-漂浮物复合物的组装或分解作为输出。
拴系到SLB的漂浮物的动作在单个颗粒的水平上是二进制的。即，对于给定的观察时段，漂浮物要么通过组装或分解离散地切换其状态(ON)，要么不切换其状态。当用布尔逻辑控制每个漂浮物的数字动作时，受体-漂浮物对可以被实现为单个逻辑门。
在图1B中，纳米颗粒YES门被示出为由受体-漂浮物对实现的逻辑门的示例。
在图1B中，示出了作为YES逻辑门的受体-漂浮物对。表现出主要的绿色的绿色纳米受体G-NR和绿色纳米漂浮物G-NF可以在YES门中使用。
当输入DNA(Xa)诱导受体与漂浮物之间的组装反应时，漂浮物-受体对被限定为组装YES门。当输入DNA(Xd)通过被支点(toehold)域T2公开的链置换输出且因此受体-漂浮物(R-F)对诱导分解时，漂浮物-受体对被限定为分解YES门。在图中，“T”表示支点域，“A”和“B”是结合域，功能域可以以A-T-B或B-T-A的顺序连接。箭头指示3'末端，星号“*”指示互补性。每个逻辑门可以显示在图1B中所示的反应图中。
在组装YES门中，G-NF响应于可以与受体和漂浮物两者的表面DNA配体杂交的单链DNA输入(Xa)通过与G-NR关联将其构象状态从可扩散的单体(“0”)切换为固定的二聚体(“1”)。
在分解YES门中，G-NF最初通过与寡核苷酸(Xd*)杂交结合到G-NR。该步骤被命名为预二聚化。当DNA输入(Xd)通过支点介导的链置换去除预先存在的DNA键Xd*时，G-NF随后从G-NR释放并将其状态从固定的二聚体(“0”)切换为可扩散的单体(“1”)。
图1B中所示的组装YES门和分解YES门的DNA序列和实验条件公开在表1和表13中。
图6A和图6B示出了基于支点介导的链置换的单个输入分离YES门的运算。
在图6A中，在序列水平上示出了使用完全互补输入和错配输入的分离反应。强调了支点域的侧端(从A到G、从G到T)处的两点转换和错配的碱基对(图6A的Xmut*中的“TTCGCTGACG”的相对端处的“T”和“G”)。
在图6B中，示出了相对于两个输入获得的暗场动力学实验绘图。在图6B中，分别显示了相对于完全互补输入和错配输入的输出。由于500nM的高浓度输入和长支点域，即使存在碱基错配，平衡也被推回到分离。因此，在两种条件下的反应在足够的操作时段之后饱和。然而，完全互补输入诱导分离门的更快响应，这表明系统可以通过使用动力学信息在特定条件下识别错配输入。在图6A中，EG表示乙二醇单元。
对于输入，逻辑值“0”和“1”表示溶液中不存在输入DNA和存在输入DNA。对于输出，“1”表示用于组装门的结合到G-NR的G-NF(即，R-F二聚体)以及用于分解门的可扩散的、单体的G-NF。“0”表示漂浮物保持在它们的初始状态。
关于漂浮物的状态切换行为的信息可以通过跟踪受体的信号改变来获得。例如，当G-NF通过输入DNA组装到G-NR上而导致G-NR的G强度逐步增加时，组装YES门产生输出“1”。
“纳米颗粒反应网络”抽象概念可以用于表示逻辑门的纳米颗粒的行为。抽象概念基于有向图，其中节点由纳米颗粒表示，边由逻辑、输入和反应类型表示。如图1B中所示，组装反应由从漂浮物指向受体的实线箭头标记，分解反应由从受体指向漂浮物的虚线箭头标记。纳米颗粒逻辑门可以被设计为产生特定于受体-漂浮物对的组合的特征、等离子激元耦合诱导的信号。因此，可以平行分析多个纳米颗粒逻辑门，只要每个门提供不同的光学读出即可。
图7示出了通过暗场显微镜在纳米颗粒逻辑门运算中的平行、单颗粒分析。
如图7中所示，可以平行分析多个纳米颗粒逻辑门中的每个，只要每个门产生不同的光学信号作为输出即可。在图7中，在暗场显微镜成像的放大框区域和平行单颗粒分析中，B-NR由比G-NF暗的阴影指示。由于等离子激元耦合诱导的纳米颗粒散射信号的改变依赖于与相互作用相关的受体-漂浮物对，因此可以容易地设计产生独特光学信号的多个逻辑门。
例如，当组装门由G-NR和G-NF组成且分解门由B-NR和G-NF组成时，可以同时地执行两个门。在两个信号中，G-NR的G强度的增加和B-NR的G强度的降低是容易地可辨别的。
足够高的密度的纳米颗粒需要被保持以确保可以在短时间内发生大量逻辑门纳米颗粒反应。对于通常持续15分钟至30分钟的计算过程，监测拴系到单位面积(180×180μm2)的大约超过4000个纳米颗粒(>3700个受体和300个漂浮物)。
图8A和图8B示出了纳米颗粒拴系到支撑的脂质双层的逻辑门。
在图8A中，示出了拴系到支撑的脂质双层的纳米颗粒NP的数量与培养时间之间的绘图。
在图8A中，示出了左侧处的2.5pM G-NR、中心处的2.6pM G-NF和右侧处的2.2pMB-NR的栓系过程。在各个时间处，对于四个不同位置，在90μm×90μm的区域中对每个纳米颗粒的数量计数。误差条是基于在四个位置处获得的颗粒的数量计算的标准偏差。如图8A中所示的绘图中所示，拴系的颗粒的数量与脂质双层室以及包括生物素化纳米颗粒的溶液的培养时间成线性关系(R2>0.98)。另外，如从较高的接头密度所预期的，绘图示出了受体拴系比漂浮物拴系快。这种线性关系能够精确控制脂质双层中的纳米颗粒密度。
在图8B中，示出了三个重复脂质流动室(例如，片1至3)中的拴系的纳米颗粒的数量。G-NR和B-NR的组合示出在图8B的左侧中，B-NR和G-NF的组合示出在图8B的中心中。在每个片上，在拴系之后，在90μm×90μm区域中的四个不同位置处计数纳米颗粒的数量。误差条是基于在四个位置处获得的颗粒数量计算的标准偏差。颗粒计数中的片与片之间的可变性是可忽略的。
在图8B的右侧中，示出了在脂质室中的四个不同位置处测量的三种拴系的纳米颗粒B-NR、G-NR和G-NF中的每个的数量。误差条是基于在四个位置处获得的NP的数量计算的标准偏差。这些结果表明，脂质纳米片中的纳米颗粒的栓系可以被控制且在脂质双层的大面积之上是稳定的，与纳米颗粒类型和迁移率无关。
受体的数量被设定为比漂浮物的数量高，以使三聚体形成和四聚体形成最小化。这种条件允许漂浮物仅在单体与二聚体阶段之间切换。
图9是示出了通过MATLAB类模拟的多聚体形成反应的程度的曲线图。
如图9中所示，相对于给定的NR/NF比在脂质双层中模拟的组装反应中形成聚合物(三聚体或四聚体)的NF比可以通过使用MATLAB类模拟来估计。在NR/NF比是10:1、8:1、5:1和2:1时，6％、15％、15％和34％的漂浮物通过组装反应形成聚合物。例如，一个受体与两个漂浮物之间的两个组装反应产生三聚体。在模拟的系统中的纳米颗粒的总量被设定为在128×128μm2的区域中是约1800。为了与实验结果一致，NF的扩散系数分布为满足平均0.9μm2/s的正态分布和0.3μm2/s的标准偏差。
在图1C中，示出了用于纳米颗粒逻辑计算的清晰和定量可视化的仅受体数字图像处理。来自受体的固定的信号被特异性地识别并数字化以用于可视化。这种分析提供了具有增强的信噪比、单个受体的信号分布和逻辑计算的动态的重建的暗场视频。动力学绘图可以通过对产生精确的单个颗粒读出值的受体计数来获得。
如图1C以及图10A到图10C中所示，能够对单个纳米颗粒信号进行集成检测、跟踪、分类和可视化的图像分析管道用于分析大量纳米颗粒逻辑门。
图10A至图10C示出了用于LNT上的逻辑门的纳米颗粒的清晰和更定量可视化的用于仅受体的数字图像处理的算法。
在图10A中，示出了来自延时DFM数据的纳米颗粒和受体的计算识别。在登记(步骤1)之后，检测具有比检测参数高的信号强度的像素，并且用黄色十字标记像素(步骤2)。检测参数d可以根据每个暗场视频变化。这是因为每个片中的纳米颗粒的类型和数量影响视频的背景。例如，d由等式“d＝mbackground+0.5×σbackground”限定，其中mbackground和σbackground表示其灰度强度小于或等于选择的阈值T的像素的平均值和标准偏差。可以容易地区分检测的信号(像素)的边界。假设分段信号来自纳米颗粒。分段信号的中心被定位以提供纳米颗粒位置。用十字标记定位的颗粒(步骤3)。通过比较通过帧N、N+1和N+2的定位的位置来确定受体(步骤4)。用受体识别具有静止信号的颗粒，并且用三角形点标记颗粒(步骤5)。对于由三角形点指示的每个颗粒，设定用于信号采样的区域(3×3像素)，并且对预定采样区域中的信号采样(步骤6)。仅使采样的受体信号可视化产生具有增强的信噪比的重建视频(步骤7)。
图10B示出了作为阈值T的函数绘制的检测的信号的数量。平台的存在示出了识别的信号的数量对被选择为用于分析的阈值T不敏感。
图10C示出了作为跟踪帧绘图的函数绘制的受体的数量。平台的存在示出了识别的受体的数量对被选择为用于分析的阈值T不敏感。例如，当70(a.u.)被选择为阈值T且31(帧)被选择为跟踪长度时，在原始暗场视频中视觉地识别的受体与在上述算法中识别的受体匹配。该比较可以示出算法在高密度设定下稳定地区分受体与漂浮物。
由于在高密度设定中难以跟踪漂浮物的移动信号，因此使用专门地跟踪受体的图像分析管道法。
未落入用于红色信号簇、绿色信号簇或蓝色信号簇的散点图类别中的模糊信号被消除以用于分析。在图像分析管道法中，跟踪算法用于重建仅可视化受体信号的视频。这种视频表现出增强的信噪比，提供了纳米颗粒电路如何在单颗粒水平实时操作的清晰视图。首先，通过相应的分析法执行对R纳米颗粒、G纳米颗粒和B纳米颗粒的散射信号进行分析，该分析用于信号分类。
图11A至图11C示出了R纳米颗粒、G纳米颗粒和B纳米颗粒的散射信号分布。
在图11A和图11B中，每个簇以对应的颜色显示，因此容易地区分用于每种颜色的簇。在图11A中，在3D信号空间中示出了用于R纳米颗粒(顶部)、G纳米颗粒(中间)和B纳米颗粒(底部)的RGB强度散点绘图。在图11B中，示出了在3D信号空间中一起示出R簇、G簇和B簇的两个透视图。根据观看3D信号空间的视角划分两个透视图。
在图11C中，用于R纳米颗粒、G纳米颗粒和B纳米颗粒中的每个的红色散射强度、绿色散射强度和蓝色散射强度的平均值以及背景信号被显示为条。如图11C中所示，由“/”标记的条表示绿色，由“\”标记的条表示蓝色，由“×”标记的条表示红色。误差条表示标准偏差。纳米颗粒单体的信号分析可以用于确认和分类脂质纳米片中的逻辑门的纳米颗粒反应。
图12A至图12D示出了LNT上的双输入纳米颗粒逻辑门。
参照图12A至图12D，将描述组装AND门、组装OR门、分解AND门和分解OR门。为了构建这些门，DNA键在受体-漂浮物接口中被编程，使得仅当两个不同的DNA输入满足AND逻辑或OR逻辑时，通过组装形成键或通过分解裂解键。这种方法被称为接口编程(interfaceprogramming)。
用于双输入纳米颗粒逻辑门的DNA序列和实验条件总结在表3和表14中。
图13示出了双输入组装AND门的运算原理和DNA序列。
在图13中，序列级图被示出以用于描述用于响应于两个输入X1和X2的组装AND门的方法。EG表示乙二醇单元。
如图12A和图13中所示，在组装AND门中，构象可切换的DNA发夹可以用作表面配体。G-NR(R1)用DNA发夹T2改性，G-NF(F1)用DNA发夹T1改性，DNA发夹中的每个将其结合域(B1A1和A1*B1*)隐藏在茎(stem)中。通过在其环上与输入链X1和X2杂交，打开发夹，暴露G-NR(R1)的结合域B1A1和G-NF(F2)的结合域A1*B1*，G-NR(R1)和G-NF(F2)通过两个结合域之间的杂交组装。即，只有当X1和X2两者都存在于溶液中时，受体R1和漂浮物F1才组装。在图12A的曲线图中，示出了由于组装引起的R1的强度的增加。
图14示出了双输入组装OR门的运算原理和DNA序列。
在图14中，序列级图被示出以用于描述用于响应于两个输入X3和X4的组装OR门的方法。EG表示乙二醇单元。
如图12B和图14中所示，在组装OR门中，G-NR R2用两种类型的DNA配体(B2*和B3*)改性，B-NF F2用两种类型的DNA配体(A2*和A3*)改性。每个DNA配体暴露不同的结合域。输入X3或X4都可以与F2和R2上的半互补域杂交，导致二聚化。在图12B的曲线图中，示出了由于结合引起的R2强度的增加。
图15示出了双输入分解AND门的运算原理和DNA序列。
在图15中，序列级图被示出以用于描述用于响应于两个输入X5和X6的分解AND门的方法。EG表示乙二醇单元。
如图12C和图15中所示，在分解AND门中，G-NF F3通过两个不同的DNA键结合到B-NR R3，DNA键中的每个暴露颗粒之间的接口内的支点域(T5和T6)。两个支点域用作识别区域，募集输入链X5和X6，并且各自通过链置换去除DNA键。当两个不同的DNA键被X5和X6去除时，开始分解反应。在图12C的曲线图中，示出了由于分解引起的R3强度的增加。
图16示出了两个输入OR门的运算原理和DNA序列。
在图16中，序列级别图被示出以用于描述用于响应于两个输入X7和X8的分解OR门的方法。EG表示乙二醇单元。
如图12D和图16中所示，在分解OR门中，B-NF F4通过一种类型的DNA键结合到B-NRR4，DNA键暴露接口中的两个支点域T7和T8。两个支点域中的一个可以独立地募集输入链。输入链X7和X8中的每个的序列域与现有的DNA键半互补。例如，输入链X7的序列域“T7*A6*”与DNA键“B6T8T7A6”半互补，输入链X8的序列域“B6*T8*”与DNA键“B6T8T7A6”半互补。输入链X7和X8通过与B-NR R4上的配体的链置换(通过X8)或与B-NF F4上的配体的链置换(通过X7)来裂解键。在图12D的曲线图中，示出了由于分解引起的R4强度的降低。
用于接口编程的设计原理被示意性地概括并示出在图17A至图17F中。
图17A至图17F示出了纳米颗粒逻辑门的设计原理。
在图17A中，示出了泛化概念的图形概要。示出了效应器介导的纳米颗粒的YES门的组装/分解(左)和用于该概念的真值表(右)。用于组装/分解逻辑门的构造需要选择性的效应器-配体对和效应器-螯合剂对。为了通过使用两个纳米颗粒构建逻辑门，键相互作用需要在受体-漂浮物接口中编程，使得仅当两个分子输入满足AND逻辑或OR逻辑时，通过组装形成键或通过分解裂解键。
图17B示出了组装AND门的设计。图17C示出了组装OR门的设计。
当成键相互作用需要通过两个输入的串行激活时，组装反应由AND逻辑控制，当成键相互作用被平行控制时，组装反应由OR逻辑控制。
图17D示出了分解AND门的设计。图17E示出了分解OR门的设计。
分解反应由通过平行断开范例的AND逻辑和通过串行断开设计的OR逻辑控制。
图17F示出了接口编程的泛化概念。DNA的序列识别和链置换用作实现逻辑的机制。具体地，使用单链DNA分子作为效应器、硫醇寡核苷酸作为配体和链置换作为螯合机制。设计的简单性使得可以设计具有若干约束的序列。这种简单的设计规则可以应用于其他配体系统和核纳米结构。
纳米颗粒门的性能可以通过对在暗场视频中捕获的纳米颗粒门的输出响应计数来分析。一种类型的纳米颗粒门是否产生精确的数字输出可以通过量化过程来确定。
所有四个逻辑门在逻辑FALSE条件下产生低输出计数，并且在TURE条件下产生高输出计数。具体地，分别提供用于组装AND门、组装OR门、分解AND门和分解OR门的具有快速响应动力学(t1/2<19分钟、t1/2<5分钟、t1/2<9分钟和t1/2<5分钟)的超过5倍、88倍、93倍和42倍的ON/OFF水平。
ON/OFF水平通过将在TURE条件下获得的最低输出计数除以在FALSE条件下获得的最高输出计数来评价。在表1中，在TURE条件下，响应率(％)(对输入反应的漂浮物的数量除以漂浮物的总数)通常是约80％。
[表1]
响应率(被限定为对输入反应的漂浮物的数量除以在初始状态下计数的漂浮物的总数)通常超过80％。组装AND门在1AND 0和0AND 1处表现出较小的输出泄漏，推测是因为表面发夹处于关闭状态与打开状态之间的动态平衡中。
图18A至图18C示出了两个发夹类输入组装AND门的模块性。
如图18A中所示，发夹类AND组装过程由输入诱导的发夹开口控制。
如图18B中所示，在没有与其他杂交事件干扰的情况下发生发夹类组装过程。
在图18A中，组装AND门相对于顺序地引入的输入被顺序地激活，导致产生组装AND门的响应。在图18A中，□表示X1在X2的加入之后被加入的情况，◇表示X2在X1加入之后被加入的情况。如图18A中所示，两个杂交事件都是诱导纳米颗粒组装所需要的。
在图18B中，示出了在通过与非发夹配体相互作用的DNA输入X3杂交之后的组装AND门运算。如图18B中所示，发夹类组装对相同颗粒中的其他杂交事件不敏感。
在图18C中，示出了通过正常DNA输入X3的组装。如图18C中所示，通过简单杂交的组装(如在组装OR门中)对相同颗粒中发夹配体的存在不敏感。DNA序列和实验条件总结在表7、表8和表18中。
图19示出了两个输入分解OR门的不均匀的响应。
如图19中所示，分解OR门表现出不均匀的响应，其中在0OR 1条件下的TURE输出是在其他输入条件下的其他TURE输出的57％分数。这种结果是由于受体与漂浮物之间表面配体密度的差而产生的。
在图19中，因为表面配体的密度在F4中比在R4中高，所以在1OR 0条件下的响应率可以比在0OR 1条件下的响应率高。由于高配体密度，F4比R4暴露多的单链域(B6-T8-T7)。暴露的链可以与进入的输入链相互作用。在0OR 1条件下的输入B6*-T8*与暴露的键之间的相互作用比在1OR 0条件下的输入A6*-T7*与键之间的相互作用有效。这是因为可识别的序列更长且更容易先前的相互作用。因此，输入B6*-T8*更容易地被暴露的链捕获，而不引起诱导颗粒分解的有效链置换。
另外，LNT系统与“双轨”规则兼容，其中逻辑门的布尔值由一个信号(“0”)或另一信号(“1”)的存在表示。这种形式用于难以限定NOT函数的系统。利用这种表示，AND门和OR门足以计算任何布尔函数。
图20A至图20B示出了NAND门的双轨。
在图20A中，示出了双输入双轨NAND门。Xi的双轨输入用和(分别表示逻辑OFF和逻辑ON)标记，输出也用相同的规则标记。双输入组装OR门(OR)和双输入分解AND门(AND)平行实现以处理双轨NAND逻辑。
图20B示出了暗场动力学实验结果。两个门产生精确的逻辑输出，同时提供超过37倍(Y0，2输入组装OR)和33倍(Y1，2输入分解AND)的ON/OFF水平，而不会彼此干扰。该结果可以证明纳米颗粒逻辑门的模块性。DNA序列和实验条件总结在表9和表19中。
接口编程可以扩展为使得纳米颗粒逻辑门能够处理INHIBIT逻辑(X1AND NOTX2)，并且产生具有多个输入(扇入)的多个输出(扇出)。
图21A至图21C示出了处理INHIBIT运算且具有多个输入(扇入)和多个输出(扇出)的纳米颗粒逻辑门。
在图21A至图21C中，∧、∨和￢分别表示相对于AND、OR和NOT的逻辑符号。每个绘图包含与每个门对应的反应曲线图。DNA序列和实验条件总结在表4-1、表4-2和表15中。在1x PBS缓冲溶液中在25℃下进行实验。
首先，在图21A中，示出了在R1-F1中实现的双输入分解INHIBIT门。为了实现逻辑功能，用于组装YES门和分解YES门的配体同时地用于控制G-NR(R1)与G-NF(F1)之间的分解。组装输入X2用于形成其他DNA结合，但是分解输入X1用于去除现有的DNA结合。
在图21A中所示的双输入分解INHIBIT门中，INHIBIT门所需的NOT逻辑可以通过由X1触发的DNA键去除与由X2触发的DNA键形成之间的竞争来实现。当且仅当存在组装输入X1且不存在组装输入X2时，INHIBIT门释放F1作为输出。
图22A至图22B示出了双输入分解INHIBIT门的运算。
在图22A中，示出了双输入分解INHIBIT门的运算的域级图和重建的暗场图像。重建的图像仅提供受体信号。仅在逻辑1AND(NOT 0)的状态下观看到分解反应。
如图22A中所示，INHIBIT门仅在具有超过129倍的ON/OFF水平的TURE状态下产生输出计数。当存在两种输入时，没有观看到输出泄漏，表明通过X2的键形成比通过X1的键去除快。
如图22B中所示，两个竞争反应在彼此不干扰的情况下进行。
图22B示出了INHIBIT门中的链置换反应的特征。根据这种设计，当加入两个输入X1和X2时，门的结合从B1-T1-A1改变为B2-T2-A2 X2。构象转换在受体-漂浮物接口中是有效的，分解反应应在随后加入X2*时发生。暗场动力学绘图表明INHIBIT门按设计运作。DNA序列和实验条件总结在表4-1、表4-2和表15中。
因为双输入AND、OR和INHIBIT运算构成功能上完整的布尔函数集，所以INHIBIT门的证明是重要的。
其次，增加受体-漂浮物二聚体中可以被分解的不同DNA键的数量，使得能够扇入分解门。
在图21B中，示出了用R2-F2实现的六输入分解门的电路图和门的运算(左)以及动力学实验曲线图(右)。
如图21B中所示，当从G-NR(R2)释放G-NF(F2)需要断开三个不同的DNA键(DNA键中的每个可以通过双输入OR逻辑裂解)时，分解由六输入表达式(X3 OR X4)AND(X5 OR X6)AND(X7 OR X8)控制。
图23示出了六输入分解门的操作。
在图23中，示出了处理(X3 OR X4)AND(X5 OR X6)AND(X7 OR X8)逻辑的六输入分解门的域级图(左)和重建的暗场图像。DNA序列和实验条件总结在表4-1、表4-2和表15中。如图23中所示，暗场成像确认六输入逻辑门仅在具有超过88倍的ON/OFF水平的TURE状态下产生输出。
图24A至图24B示出了多输入分解门。
在图24A和图24B中，通过组合INHIBIT逻辑和在实施扇入中使用的接近方法，设计了能够实现更复杂的逻辑表达式的分解门。
在图24A中，示出了处理(X1 OR X2)AND NOT(X3 OR X4)逻辑表达式的四输入分解门。在该设计中，X1或X2可以裂解DNA键(在预形成的R1-F1二聚体中)，X3或X4可以在二聚体中形成键。为了发生分解，在X3和X4不存在的情况下，必须进行键裂解反应。
在图24B中，示出了处理(X5 AND X6)AND(NOT X7)逻辑的三输入分解门。对于分解，X5和X6需要去除两个不同的DNA键，而不通过X7形成附加的键。
如图24A和图24B中所示，基于动力学竞争和增加的“键阶”的两种策略可以用于产出具有复杂多输入布尔逻辑(诸如(X1 OR X2)AND NOT(X3OR X4)和(X1 AND X2)AND(NOTX3))的分解逻辑门。
第三，在图21C中示出了具有三个输出的双输入分解AND门。分解门用AND逻辑处理两种类型的DNA输入，并且产生三个不同的可移动的漂浮物F3、F4和F5作为输出。三个代表性的R-F对被标记为R3-F3、R3-F4和R3-F5。
如图21C中所示，逻辑门的扇出通过在三个不同的受体-漂浮物对中实施相同的双输入分解AND逻辑来证明，每个受体-漂浮物对具有不同的漂浮物信号。由于每个漂浮物的特征信号，因此容易地可分析三种漂浮物的分解反应。R-NF、G-NF和B-NF与各自受体的解离导致受体信号的R强度、G强度和B强度的逐步降低。分解门根据具有超过20倍的ON/OFF水平的逻辑释放所有三个输出F3、F4和F5。
随着反应器-漂浮物内反应的复杂性增加，不完全反应或虚假相互作用也会出现。因此，依赖于设计漂浮物-受体表面接口不是用于构造复杂电路的有效且可扩展的策略。因此，在本公开中，使用可以用AND逻辑或OR逻辑将两个单个颗粒逻辑门连接的纳米颗粒“网络编程”。
图25A至图25C示出了通过网络编程的纳米颗粒逻辑门的连接。
DNA序列和实验条件总结在表5和表16中。在1x PBS缓冲溶液中在25℃下进行实验。
在图25A中示出的网络编程中，两个纳米颗粒门可以在纳米颗粒网络层级中被模块化布线，在两个纳米颗粒门中的每个中，R-F接口被编程为具有期望的逻辑。设计为顺序地参与分解门1和组装门2的漂浮物使得两个门能够用AND逻辑(上部)布线。当两个分解逻辑门(门3和门4)产生具有相同信号的漂浮物时，两个门用OR逻辑(下部)布线。
图25B和图25C示出了在左列中使用代表性单颗粒暗场分析(黑色背景图)的网络级布线策略的电路图，布线策略电路图中的组装和分解过程分别用实线和虚线箭头标记。反应性受体R1、R2、R3和R4用组装前圆CR1或分解前圆CR2以及组装后电路CR3或分解后电路CR4标记。动力学实验结果示出在图25B和图25C的下端中，并且示出了最终输出计数(左)和中间反应的定量(右)。∧表示AND逻辑，∨表示OR逻辑。
图25B示出了具有AND逻辑的逻辑门的布线。在其初始状态下结合到第一受体R1的漂浮物F1被设计为用作分解AND逻辑门(X1 AND X2)，随后用作具有第二受体R2的组装YES门(X3)。R2-F1二聚体的产生是最终输出。在图25B中，分解之前的受体R1用圆圈CR2标记，分解之后的第一受体R1用圆圈CR4标记，组装之后的第二受体R2用圆圈CR3标记。
图25C中所示的逻辑门用OR逻辑布线。分解AND门(X4 AND X5)和分解YES门X6都被设计为释放G-NF，因此G-NF的产生由使用OR逻辑将两个门组合的电路控制。在图25C中，分解之前的受体R3和R4用圆圈CR2标记，分解之后的受体R3和R4用圆圈CR4标记。
首先，如图25B中所示，网络级AND布线可以通过能够在分解门和组装门中使用漂浮物来证明。例如，在由G-NR R1和G-NF F1形成的分解AND门中，释放G-NF F1，稍后释放的G-NF F1与另一受体B-NR R2用作组装YES门。
在该网络级布线方案中，B-NR(R2)-G-NF(F1)二聚体的形成成为AND-AND级联电路(X1 AND X2)AND X3的输出。
图26示出了双层AND-AND级联电路的重建的暗场快照。
从G-NR R1释放G-NF F1由AND逻辑(X1和X2)控制。仅当组装输入X3存在时，释放的F1可以拴系到R2。最终电路输出由三输入逻辑方程(X1AND X2)AND X3控制。第一条件(1AND1)AND 1中的绿色强度在受体R1中降低且在受体R2中增加，因此成功地被G-NF F1级联。绿色强度的降低仅在第二条件(1AND 1)AND 0下观看到。信号增加的缺少表明释放的漂浮物F1未栓系到另一受体。在下面的两个附图中没有看到反应。
AND-AND级联电路由反应曲线图描述，其中两个受体R1和R2串联地连接到漂浮物F1。电路提供36倍的ON/OFF水平。如图26中所示，由于其不同的光学信号，也可以同时地监测和分析中间分解反应。上游分解AND门导致超过89倍的ON/OFF水平。通过该平行分析，估计响应于四个输入组合的随时间推移的漂浮物F1群体，仅当输入X3是TURE时，释放的漂浮物F1随后可以结合到受体R2。
对于(1AND 1)AND 1条件，超过92％的F1响应于组装输入X3。该结果表明顺序分解-组装级联是高效的。其他双输入分解门(诸如OR门和INHIBIT门)可以在没有优化的情况下模块化地重新布线，从而产生图27中所示的OR-AND级联和图28中所示的INHIBIT-AND级联。
图27示出了两层OR-AND级联电路。
在图27中所示的两层OR-AND级联电路中，网络级AND布线应用在执行(X1 OR X2)AND X3逻辑计算的纳米颗粒电路的构造中。电路通过产生与逻辑对应的精确的输出来提供超过11倍的ON/OFF水平。上游分解门示出了超过128倍的ON/OFF水平。如在图25B中所示的AND-AND级联电路中，可以在电路中预估G-NF的群体动态。根据分析，仅当组装反应所需的输入X3存在时，释放的G-NF结合到B-NR。DNA序列和实验条件总结在表10和表20中。
图28示出了双层INHIBIT-AND级联电路。
在图28中所示的双层INHIBIT-AND级联电路中，网络级AND布线应用为构造执行(X1 AND NOT X2)AND X3逻辑计算的纳米颗粒电路。该电路执行如所设计的逻辑计算，因此ON/OFF水平超过37倍。上游INHIBIT门提供超过70倍的ON/OFF水平。只有当输入X3存在时，释放的G-NF才结合到B-NR。DNA序列和实验条件总结在表11和表21中。
其次，通过设计两个分解门，OR布线可以被实现为平行产生具有相同的光学信号的漂浮物。
如图25C中所示，例如，由B-NR(R3)和G-NF(F2)形成的分解AND门与由G-NR(R4)和另一G-NF(F3)形成的分解YES门一起安装。在电路((X4 AND X5)OR X6)中，G-NF可以从AND门或YES门产生，因此，使得两个门用OR逻辑布线。
图29示出了双层AND-OR级联电路的暗场快照。
参照图29，示出了双层AND-OR级联电路的暗场快照，从B-NR(R3)释放G-NF(F2)由AND逻辑(X4 AND X5)控制，从G-NR(R4)释放另一G-NF(F3)由YES逻辑(X6)控制。最终电路输出由三输入逻辑表达式(X4 AND X5)OR X6控制。在第一条件(1AND 1)OR 1中，绿色强度在R3和R4中降低，因此G-NF成功地从每种受体释放。在第二条件(1AND 1)OR 0中，绿色强度的降低仅在B-NR中观看到。即，作为AND逻辑计算的结果，裂解R3-F2对。
如图29中所示，AND-OR级联输出超过55倍的ON/OFF输出水平。两个上游分解门的运算被单独地评价，以表明每个门以高ON/OFF水平进行计算，而不会彼此干扰。
图30示出了双层OR-OR级联电路。
如图30中所示，分解OR门也可以连接以产出OR-OR级联电路。
在图30中所示的双层OR-OR级联电路中，网络级OR布线方案应用为形成执行(X1OR X2)OR X3逻辑计算的纳米颗粒电路。该电路执行如所设计的计算，使得ON/OFF水平变为超过43倍。上游分解OR门和YES门分别提供超过37倍和24倍的ON/OFF水平。DNA序列和实验条件总结在表12和表22中。
由于分解门支持扇出，因此任何上游分解门应该能够容易地产生多个漂浮物，每个漂浮物负责不同的下游计算。释放的漂浮物随后可以通过网络级AND布线“插入”到组装门的另一层中。这种方法能够实现复杂的多层级联。
为了证明LNT上电路设计的模块性，多路转接器MUX 2到1通过网络编程通过布线先前引入的逻辑门来实现。
图31A到31C示出了纳米颗粒多路转接器电路的设计和实施方案。
在图31A中，示出了用纳米颗粒网络实现的多路转接器电路MUX 2到1。多路转接器通过OR逻辑将分解INHIBIT门(X1 AND NOT Sel)和分解AND门(Sel AND X2)连接来形成。四个纳米颗粒R1、R2、F1和F2形成多路转接器电路。
在图31B中，示出了脂质双层上的纳米颗粒多路转接器的模块化的实施方式。电路组成元件可以以模块方式被高度地控制和加载。为了防止F1与F2之间的不期望的天然相互作用，在拴系F1之前，通过保护链A2保护F2。
在图31C中，示出了多路转接器电路的测量性能和真值表。图32中描述了用于电路工作的域级图。在记录有电路的操作过程的延时暗场图像的分析中，纳米颗粒多路转接器产出对具有超过35倍的ON/OFF水平的八种不同输入组合的预期响应。DNA序列和实验条件总结在表6和表17中。在1x PBS缓冲溶液中在25℃下进行实验。
图31A的电路图可以转化为指导用于每个纳米颗粒的表面DNA配体的设计的反应曲线图。在纳米颗粒级别，多路转接器电路由两个R-F对：R1-F1(X1 AND NOT Sel)和R2-F2(Sel AND X2)形成。产生G-NF作为输出的两个分解门用OR逻辑布线。具体地，在多路转接器电路中，作为选择的输入的选择器Sel应当由INHIBIT逻辑(R1-F1内)和AND逻辑(R2-F2内)中的两个不同逻辑运算同时地处理。在这种设计限制下，每个纳米颗粒应暴露与另一颗粒的域完全地互补的序列域(A2或B2)。由于这种条件，纳米颗粒电路组成元素可以在溶液步骤中自发地形成聚集体。为了防止这种自发的相互作用，以特定顺序加载纳米颗粒电路组成元件并引入保护链A2。
如图31B中所示，因为纳米颗粒之间的不期望的自发的相互作用可以在拴系和预二聚化过程期间被区室化和控制，所以多路转接电路可以在LNT平台中被容易地构建。因为R1和R2的固定，所以R1和R2不彼此碰撞，F1-F2相互作用通过在栓系过程中引入保护链A2保护F2的A2*域被暂时地封闭。在四种类型的纳米颗粒加载到脂质双层中之后，两个分解逻辑门通过形成相应的R1-F1和R2-F2二聚体制备。
图32示出了域级中的多路转接电路操作。
纳米颗粒表面配体被设计为允许两个不同的受体-漂浮物对同时地处理选择链(Sel)。多路转接器通过使用选择器链(Sel)来选择两个输入X1和X2中的一个，并且将选择的输入转换为单个输出。
纳米颗粒多路转接器的证明示出，能够以模块化和可控的方式在LNT平台上设计和操作纳米颗粒电路。
LNT的操作原理分为以下三个方面。
首先，计算仅由SLB拴系的纳米颗粒驱动，SLB拴系的纳米颗粒的颗粒间的相互作用是原位可编程且可读的。单个纳米颗粒的动态网络与逻辑电路等效。
其次，由于级联仅由漂浮物驱动，因此过程d不需要信号恢复或放大。即，漂浮物是经由对外部条件稳定的横向扩散将上游门的信息携带到下游门中的“布线”。
图33A至图33C示出了相对于漂浮物扩散的稳定性的分析。
如图33A至图33C中所示，在各种条件下分析漂浮物G-NF的扩散动力学。例如，在1xPBS缓冲液中，漂浮物扩散过程可以在不同条件下与高浓度(500nM)的虚设DNA、低浓度(20nM)的互补DNA输入和高浓度(500nM)的互补DNA输入一起分析。
漂浮物G-NF的表面配体与虚设DNA5'-GTTTAAGATTTATGGTTAAGCGTAGATTAAGTATTAAG-3'之间没有互补性。在单输入组装YES门中使用的G-NF用于分析G-NF(参照表1)。在脂质纳米片中的三个不同位置处重复每种溶液中的分析。
图33A是在每种条件下G-NF的扩散系数的柱状曲线图。图33B示出了G-NF的扩散系数，图33C示出了相对于时间的均方位移以绘制四个代表性扩散轨迹。分析结果示出，G-NF的整体扩散行为对溶液的化学环境是稳健的。
第三，空间约束被用来控制纳米颗粒“信号”网络中分子信息的流动。如多路转接器中所示，可以模块化地控制不期望的相互作用。然后，复杂的数字定位操作可以使用相对少量的颗粒和配体类型来实施。通过与脂质双层的集成，以单颗粒水平上编程、控制和可视化纳米颗粒，从而根据数字原理设计和实施期望的电路。这种功能在仅依赖于“被动地”聚合在溶液上的纳米颗粒的现有方法中是不可能的。可以在LNT上处理的分子信息的范围可以扩展若干种方式。
首先，因为仅需要DNA分子来操作LNT上的纳米颗粒电路，所以释放单链DNA作为输出的溶液相分子电路可以与LNT平台协同地连接。在这种情况下，溶液上的分子电路可以附加地处理分子信息。该方法可以介导脂质双层上的不同纳米颗粒电路模块之间以及与外部环境之间的通信。
其次，基于除了DNA之外的不同化学配体的颗粒改性可以容易地引入以处理不同的化学信息。当在纳米颗粒上引入新的表面化学成分时，因为在LNT上空间地或临时地控制颗粒之间的相互作用，所以可以减少设计约束(会由不同的表面配体之间的串扰引起)。
第三，脂质双层与DNA纳米结构的集成可以提供朝向新类型的分子电路的路径。例如，通过将包含空间地定位的DNA电路的DNA折纸支架(origami scaffold)栓系到SLB，可以利用折纸间的相互作用的动态网络。用于构建或连接纳米颗粒逻辑门的原理(接口编程和网络编程)可以应用于构建DNA折纸支架电路。该方法可以能够实现更复杂甚至实用的分子计算。
尽管有这种潜力，但是因为输入(DNA)和输出(状态切换漂浮物)具有不同的形式，所以LNT上的纳米颗粒电路的进一步扩大的复杂性将导致挑战。目前，这种固有的差异限制了任意大的电路的构造。可以以两种方式潜在地解决该挑战。
首先，因为其允许通过更复杂的机制控制纳米颗粒接口和网络，所以引入纳米颗粒反应和配体激活的新模式(诸如动态重构、通信、DNA行走(DNA walker)和光诱导的DNA释放)将能够针对电路设计提供宽得多的设计空间。
其次，增加每个LNT的不同纳米颗粒计算单元的数量将增强LNT的整体处理能力。不同的纳米颗粒计算单元可以以平行方式运算，或者通过网络编程组装为组合电路。这种方法类似于集成电路密度的增加如何导致硅基计算机的计算能力的改善。最终，每个纳米颗粒通过使用平行处理独立地自己执行不同的计算。
由于空间约束(诸如定位和封装)导致分子电路的模块化执行，将纳米颗粒拴系到脂质双层提供了构建复杂纳米颗粒电路的系统方法。根据本公开的LNT类方法可以在构建高度地功能性的“自主”纳米结构中起关键作用。这种装置可以对分子诊断和智能传感器具有广泛的影响。装置中的纳米系统应该能够利用内部计算算法来感测多个刺激并触发最适当的响应。
另外，脂质双层上的信息处理纳米系统可以应用于重建人工细胞之间的连接，并且用作用于研究活细胞中的膜相关现象的工具。与依赖于不可变的材料(诸如图案化膜)的现有方法不同，LNT类方法可以允许SLB上的纳米结构的网络自主地形成簇或结构图案，并且响应于来自细胞的信号分子分析。允许每个纳米和细胞系统彼此通信，这种“主动”SLB细胞连接也可以用于测试单个治疗诊断纳米机器人如何在复杂和动态环境中导航。
可以如下制造用于在图1A中所示的脂质纳米片中使用的支撑的脂质双层(SLB) “芯片”。
在圆底烧瓶中混合脂质溶液(在氯仿中)，获得包含97.2mol％的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、0.3mol％的生物素化二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和2.5mol％的聚(乙二醇)(1K)-DOPE的混合物。通过旋转蒸发仪去除氯仿，将烧瓶内部形成的脂质膜在N2流下完全地干燥15分钟。在去离子水(DI水)中重悬干燥的混合物，使得总浓度变为2mg/mL。对于获得的脂质溶液，在78℃与40℃之间的温度下重复3次冻融循环。如上所述获得的脂质溶液可以在液氮罐中储存长达2周。将脂质溶液在30℃下通过具有100nm孔的聚碳酸酯膜挤出11次，然后进行超声波处理15分钟以从脂质溶液产生小的单层囊泡(SUV)。将如上所述获得的SUV溶液在4℃下储存直至使用。
通过囊泡融合法在由上部玻璃和下部玻璃以及石蜡膜间隔物(4mm×50mm×200μm)组成的玻璃室内形成SLB。
玻璃室的操作体积小于40uL(～40uL)。在将具有流入端口和流出端口的上部载玻片(Paul Marienfeld GmbH)通过在去离子水中超声波处理5分钟和食人鱼蚀刻2分钟进行洗涤之后，通过用溶解在150mM NaCl磷酸缓冲盐水(1x PBS)中的10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)钝化来封闭SLB形成。将下部盖玻片(Co.KG，德国)在丙酮和去离子水中进行超声波处理5分钟，浸入在食人鱼蚀刻溶液中2分钟，并且洗涤，然后用去离子水清洗。之后，将两倍的石蜡膜间隔物放置在两个载玻片之间并在100℃下热密封。将新挤出的SUV溶液在1x PBS溶液中稀释至1mg/mL，然后进行超声波处理15分钟直至使用。通过在30℃下将囊泡溶液引入到流动室中来形成SLB。在60分钟之后，用去离子水(2次)和1x PBS轻轻地洗涤流动室。然后，使用溶解在1x PBS中的100μg/mL BSA封闭SLB表面上的缺陷45分钟。将溶解在1x PBS中的17nM链霉亲和素(STV)注射到流动室中以转化生物素化脂质45分钟。在BSA封闭和链霉亲和素转化之后，用1x PBS洗涤两次流动室中的流动池。具有STV改性的SLB的流动室可以在4℃的加湿冰箱中储存长达3天。在与脂质室相关的所有过程中必须避免气泡。
纳米颗粒的合成方法如下。
用在金种子上的主要地表现出红色R散射信号、绿色G散射信号和蓝色B散射信号的银纳米壳、金纳米球和银纳米球来合成金纳米棒，并且在以下示例中始终使用它们。首先，通过种子介导的生长机制合成具有4的长宽比的金纳米棒。将种子与HAuCl4·3H2O溶液(5mL，0.5mM)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液(5mL，0.2M)混合，然后快速地注入冰冷却的NaBH4溶液(600μl，10mM)。在还原步骤之后，将种子溶液放置2小时。将HAuCl4·3H2O溶液(5mL，1mM)与CTAB溶液(5mL，0.2M)混合，然后在加入AgNO3溶液(250μl，4mM)之后，加入L-抗坏血酸溶液(70μl，78mM)。向其中加入12μl种子溶液并轻轻地混合。将获得的溶液在60℃下培养4小时，离心，并且在去离子水中再分散3次。将金纳米棒溶液(1ml，100nm)与十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)溶液(1ml，10mM)、AgNO3(1ml，0.2mM)和抗坏血酸(1ml，50mM)混合，然后用约5nm银壳涂覆金纳米棒。在60℃下培养4小时之后，通过离心洗涤溶液，去除上清液，然后在去离子水中再分散三次以获得红色(R)纳米颗粒。球形形状的金纳米颗粒(50nm)购自于BBI Solutions(Cardiff，UK)，并且用作绿色(G)纳米颗粒。通过在20nm球形形状的金种子上生长17nm银壳来制备蓝色(B)纳米颗粒。将抗坏血酸钠溶液(100μl，50mM)快速地注入到包含150pM的20nm金纳米颗粒、0.2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.24mM硝酸的混合物中，以在金种子上形成银壳。
纳米颗粒受体和漂浮物的制造方法如下。
将具有硫醇官能团的合成DNA寡核苷酸(Bioneer，Daejeon，Korea)用溶解在100mMpH 8.0的磷酸盐缓冲液(PB)中的100mM二硫苏糖醇(DTT)的溶液还原1小时，然后通过使用NAP-5柱(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)分离。以下示例中使用的表面DNA配体的序列、改性和密度总结在表2至表12中。表2至表12示出了用于功能化纳米颗粒的硫醇化DNA链的序列(r：在具有硫醇化ENA链的5'硫醇基团的表面密度的配体和接口中使用的间隔物：在具有5'-A15至EG6-3'3'硫醇基团的配体和接口中使用的间隔物：和下表中公开的序列号5'-EG至A15-3'与不包括间隔物的配体和接口的序列对应)。
[表2]
[表3]
[表4-1]
[表4-2]
[表5]
[表6]
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
将硫醇化DNA的混合物与纳米颗粒(最终浓度：15pM)在室温下培养1小时。使用全浓度的硫醇化DNA，使得相对于R纳米颗粒和G纳米颗粒分别超过14,400倍和19,200倍。相对于红色纳米漂浮物(R-NF)、绿色纳米漂浮物(G-NF)、蓝色纳米漂浮物(B-NF)、绿色纳米受体(G-NR)和蓝色纳米受体(B-NR)，生物素化的DNA接口与整个表面DNA配体的比分别是0.5％(w/v)、0.5％(w/v)、0.5％(w/v)、35％(w/v)和50％(w/v)。之后，在金纳米棒(R纳米颗粒)的情况下，将溶液调节到在10mM PB中的0.1％(w/v)PVP，在球形形状的金纳米颗粒(G纳米颗粒)的情况下，将溶液调节到在10mM PB中的0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，在用于纳米颗粒(B纳米颗粒)的10mM PB的溶液中调节球形形状。以1小时的间隔加入1M NaCl、0.1％SDS和10mM PB盐溶液的三个试样，使得NaCl的最终浓度是0.3M。在加入每种盐之后，将混合物在50℃下加热10分钟并在室温下培养。在达到最终浓度之后2小时，将纳米棒溶液离心洗涤并再分散在1x PBS中。将另一纳米颗粒溶液培养12小时，离心洗涤，并且再分散在去离子水(球形形状的金纳米颗粒)或1×PBS(球形形状的纳米颗粒)中。通过使用透射电子显微镜(JEM-2100，JEOL Ltd，Japan)、紫外-可见分光光度计(Agilent 8453，AgilentTechnologies，USA)和暗场显微镜(Axiovert 200M，Carl Zeiss，Gottingen，Germany)观看改性的纳米颗粒的特征(图3A至图3C)。通过相关的SEM-DFM图像分析来自三种纳米颗粒的单个颗粒散射信号(图4A至图4C)。将纳米颗粒加载到玻璃基底上并用暗场显微镜成像。之后，在Pt涂覆(Cressington 108auto，Cressington Scientific Instruments Ltd，UK)之后，通过场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，JSM-7600F，JEOL Ltd，Japan)对相同位置成像。在大学间研究设施国家中心和先进材料研究院(National Center for Inter-UniversityResearch Facilities and Research Institute of Advanced Materials)(均为首尔国立大学，首尔)执行TEM和FE-SEM测量。
用于脂质纳米片上的纳米颗粒电路的标志分析的实验条件如下。
为了完全地组装脂质纳米片，将包含具有生物素化接头(1至10pM)的DNA改性的纳米颗粒的溶液引入到流动室中，流动室的下部玻璃基底涂覆有链霉亲和素改性的脂质双层表面。将溶液培养1至5分钟以获得期望的颗粒密度。在这些条件下，颗粒密度与培养时间成线性比例(图8A和图8B)。在加载脂质纳米片之后，将其用1x PBS洗涤两次。之后，栓系的颗粒获取包含在1x PBS缓冲液中的DNA输入，并且用作逻辑门。DNA输入序列和密度以及用于预二聚化(分解门)的实验条件总结在表13至表22中。表13至表22示出了逻辑电路计算中使用的实验条件和DNA输入序列(DNA序列以从5'至3'的方向公开，N/A：不适用)。
[表13]
[表14]
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
[表21]
[表22]
在暗场成像期间，将500μl输入溶液注入到流动室中以测试每个纳米颗粒电路在25℃下的性能。使用40x物镜(NA 0.6)和在光学台上配备有AxiCam HRC彩色相机的暗场显微镜(Dail Systems，South Korea)执行暗场成像。在注射输入溶液之前，用200ms成像时间步长获取31个图像以确认受体纳米颗粒。在输入溶液注入期间和在输入溶液注入之后，以2.5s成像间隔记录电路性能。在固定的位置中获取两个图像序列。
暗场延时数据分析方法如下。
对从延时暗场图像获得的图像数据进行处理和分析，以量化纳米颗粒电路的输出。逻辑门输出的量化基于三个步骤：信号识别、跟踪和分类。
在用暗场显微镜延时成像之后，用ImageJ软件和自定义MATLAB代码验证和跟踪来自纳米颗粒逻辑门的光学散射信号。在ImageJ中，首先由StackReg插件登记图像，以校正成像期间的横向漂移。通过能够检测和跟踪颗粒的图像分析算法来处理漂移校正的图像序列。该过程在图10A至图10C中描述。分析过程如下：(1)执行能够用远高于阈值强度的信号和每个纳米颗粒信号分割斑点(像素)的信号检测步骤；(2)执行用于确定每个分段信号的代表性部分的颗粒定位步骤；以及(3)执行颗粒跟踪步骤以识别受体纳米颗粒并对信号分类。为了稳定地确认受体位置，使用初始状态下的短视频(在输入加入之前以5fps的记录帧速度拍摄的视频)。随后，因为在典型实验条件下使用的高颗粒密度(在区域(180μm×180μm)的视场中捕获超过4000个纳米颗粒)干扰了可移动的漂浮物纳米颗粒的可靠跟踪，所以仅跟踪受体纳米颗粒。在成像之后，因为视场上的非均匀的焦点和照明(通常沿着图像边界观察)阻碍了一致的纳米颗粒散射信号分布的获取，所以选择视场的一部分(128×128μm2)用于分析。
因为受体信号中的改变取决于与受体相互作用的漂浮物的信号，所以受体信号跟踪为用于定量逻辑门提供了足够的信息。(4)最后，采样并平均来自每个受体的定位位置周围的3×3像素的散射信号，在给定时间将一个平均散射信号分配给受体。对于所有受体和帧重复该过程，因此对于在视场中识别的所有受体获得散射信号的迹线。由于漂浮物组装的增加和漂浮物分解的增加而引起的受体信号的逐步改变分别被确认为组装事件和分解事件。消除瞬时相互作用(受体信号中的短暂和瞬时增加或减少)。自制代码排除在成像完成之前不会持续的强度变化。即，只有显示与阶跃函数类似的信号迹线的受体被识别为输出产品颗粒。
根据受体信号如何随时间变化，对与期望的逻辑门对应的每个组装/分解事件分类。R纳米颗粒、G纳米颗粒和B纳米颗粒的信号分布用于分类(图11A至图11C)。分类过程如下：(1)通过从平行成像和分析获得的受体的信号迹线识别代表单个信号改变的受体。受体信号中的逐步增加指示颗粒组装，受体信号中的逐步降低指示颗粒分解(从预二聚化的纳米颗粒对)。(2)对于组装反应，将指示的受体的信号与图11A至图11C中所示的信号分布进行比较。基于其在3D信号分布中的位置，受体被分类为R纳米颗粒单体、G纳米颗粒单体或B纳米颗粒单体中的一个。在分解反应的情况下，预二聚体受体的原始身份可以通过将显示的受体的最终信号与3D信号分布进行比较来确定。(3)由于由R漂浮物、G漂浮物和B漂浮物诱导的信号改变对参与每个反应的颗粒的组合是特异性的，因此信号跟踪中的改变用于对与识别的受体相互作用的漂浮物进行分类。(4)通过使用受体类型(在步骤(2)中获得)和信号改变(在步骤(3)中获得)，对受体-漂浮物对之间的反应类型进行完全地分类。
在图7中，(i)具有离散的逐步减少的信号迹线表示分解反应，(ii)分解之后的信号表示B-NR，以及(iii)信号改变表示G强度中的急剧降低(表示从B-NR释放G-NF)，因此可以辨别G-NF从B-NR的分解。在实验中，受体-漂浮物比被设定为约10以使多聚体的形成最小化。
对于每个电路，随时间计算产生正确输出的受体的数量。继续记录直到动力学图变得恒定。针对每种类型的逻辑门，对事件的最终数量进行归一化，以使颗粒群体的可变性的影响最小化。对于组装门，事件计数通过在初始的31个图像中检测的漂浮物的数量来标准化。在分解门的情况下，分解事件计数通过在预二聚化中形成的二聚体的数量来标准化。通过将在TURE条件下获得的最低输出计数除以在FALSE条件下获得的最高输出计数来计算ON/OFF水平(当FALSE条件下的输出计数为0时，输出计数被设定为1)。
如下分析纳米颗粒逻辑门的扩散行为，具体地，漂浮物颗粒的扩散行为。(1)装载在SLB上的漂浮物颗粒的颗粒密度(每个总视场～200个颗粒)足够低，因此提供长期跟踪而没有轨道叠置。(2)从每个帧检测信号，基于上述相同的算法定位每个漂浮物颗粒的位置。(3)确定的位置用于产生每个漂浮物的轨迹，然后用于扩散系数的计算。对于每个颗粒，均方位移(MSD)值作为时间的函数获得。该轨迹的MSD绘图拟合到等式<r2>＝4Dt，其中<r2>是MSD，D是扩散系数，t是时间间隔。
用于脂质双层的纳米颗粒组装反应的模拟方法如下。
通过使用MATLAB对SLB拴系的纳米颗粒的组装反应进行建模和模拟。开发这种计算方法以评价NR/NF比如何影响二聚体形成的程度。在该模型中，给定数量的NR和NF随机地分散在具有周期性边界条件的128×128μm2的区域中。NF的扩散常数被指定为具有正态分布，该正态分布具有0.9μm2/s的平均值和0.3μm2/s的标准偏差。该近似示出在图5A和图5B中，并且基于与图33A至图33C中所示的NF的扩散分布相关的实验数据。漂浮物的扩散受到二维随机游动的影响，当t＝5ms时，假定每个漂浮物的步长是4Dt。NR的位置是固定的。为了有效地执行模拟，纳米颗粒被设定为通过纳米颗粒的晶面间距(包括表面配体的长度)在网格点处扩散。对于每次碰撞，NR与NF之间的结合事件以0.3的概率发生。在模拟中，“碰撞”被限定为当漂浮物的剖面与受体的剖面叠置时发生的事件。在多聚体的形成中，推测将另一漂浮物加入到受体-绘图仪二聚体中在空间上不比将漂浮物加入到受体中优选，因此使用低结合势(对于三聚体形成是0.18，对于四聚体形成是0.09)。基于几何约束条件引入缩放因子，该模拟结果示出在图9中。
寡核苷酸设计方法如下。
用在3'端或5'端处的包含硫醇改性的单链DNA链来功能化纳米颗粒。通过使用DomainDesign(“D.Y.Zhang,A.J.Turberfield,B.Yurke,E.Winfree,EngineeringEntropy-Driven Reactions and Networks Catalyzed by DNA.Science.318,1121-11252007”和“D.Y.Zhang in DNA Computing and Molecular Programming,Y.Sakakibara,Y.Mi Eds.(Springer Berlin Heidelberg,2010.Lecture Notes in Computer Science,pp.162-175”)在域水平上设计作为免费的原代码的DNA序列。硫醇化的DNA链包括(1)用于将纳米颗粒拴系到链霉亲和素改性的SLB表面的生物素化“接头”DNA链，以及(2)通过与SLB上的其他纳米颗粒的表面配体和溶液中的输入DNA链杂交直接地参与纳米颗粒计算的“配体”DNA链。
具有5'-硫醇改性的接头链包括：(i)在5'-硫醇基团之后的15碱基的聚A域；(ii)6个乙二醇EG单元(PEG部分)；以及(iii)34碱基的接头域，之后是生物素改性。
具有3'-硫醇改性(在5'-端处具有生物素改性)的接头链之后是(i)34碱基的接头域，(ii)PEG部分以及(iii)3'-硫醇改性，之后是15碱基的聚A域。
在以下示例中使用的表面配体DNA链被分类为以下两种类型：(1)不形成发夹环的“正常”单链DNA链；以及(2)在组装AND门中使用的发夹型DNA配体。
正常配体类型还被分类为两组：具有3'-硫醇改性的组；以及具有5'-硫醇改性的组。
5'-硫醇配体包括：(i)PEG部分(5'-硫醇之后)；(ii)10碱基的间隔物域；以及(iii)14碱基的结合域。3'-硫醇配体包括：(i)14碱基的结合域；(ii)10碱基的间隔物域；以及(iii)PEG部分(随后包括3'-硫醇改性)。除非另外说明，否则3'-硫醇配体和5'-硫醇配体分别用于受体和漂浮物。发夹型DNA配体在5'末端处被硫醇化。在以下示例中，使用10碱基的支点域。
<110> 首尔大学校产学协力团
<120> 脂质纳米片
<130> OPP20184349KR
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<151> 2018-05-29
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<400> 5
ttactacact gtcactgatc atcgcatgct atac 34
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成物
<400> 6
caaataacta atacacattc atct 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成物
<400> 7
cataatctat aatcatcctc ataa 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 合成物
<400> 8
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<223> 合成物
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<220>
<223> 合成物
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ttactacact gtcactgatc atcgcatgct atac 34
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<211> 34
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<223> 合成物
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<220>
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<211> 23
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<211> 38
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gattatagat tatgtgttag ctgtgtattt agaaaatg 38
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